Name: Femoral Medula Óssea aspiração Live Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Aprenda a aspirar medula óssea femoral em camundongos vivos sem sacrificar os animais. Este método permite estudos longitudinais de hematopoiese e análises citométricas repetidas.

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O.A.-W. é apoiado por um Prêmio de Investigador Clínico NIH K08 (1K08CA160647-01), um Prêmio de Pós-Doutorado do Departamento de Defesa dos EUA em Pesquisa de Falha da Medula Óssea (W81XWH-12-1-0041), o Programa de Investigadores Josie Roberston e um Prêmio de Investigador Clínico Damon Runyon com o apoio da Fundação Evan.

Todos os procedimentos com animais descritos neste protocolo foram conduzidos de acordo com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Animal Care e Use Comitê Institucional (IACUCs) no Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. 1. Aspiração de medula óssea (BM) As células do Fêmur <ol><li> Anestesiar o rato que passará por aspiração da medula óssea do fêmur com isoflurano (1-4%) administrado com um vaporizador de precisão. Profundidade da anestesia deve ser monitorada a cada 5-10 min durante todo o procedimento por meio da observação de que não há nenhuma alteração na taxa respiratória associada à manipulação cirúrgica e / ou ouvido, do dedo do pé, e a cauda de aperto. A anestesia é induzida com isoflurano e também mantida durante todo o procedimento com isoflurano. Uma dose pré-processual de preferência de buprenorfina a uma dose de 0,05-0,1 mg / kg por via subcutânea a cada 6-12 horas pode ser usado para prevenir a dor associada com o processo como um adjUNCT ao carprofeno. </li><li> Aplicar pomada oftálmica para os olhos do rato após a indução da anestesia para evitar o ressecamento da córnea. </li><li> A pele é cuidadosamente cortado a partir de uma área de pele de cerca de 150% maior do que a área do local da aspiração pretendido. Pele frouxa é removido com uma gaze úmida. Por favor, mantenha o mouse sobre uma almofada de água quente circulando ou outra superfície segura termóstato para evitar hipotermia durante o procedimento. </li><li> Desinfetar toda a perna contendo o fêmur, que passará por aspiração com três conjuntos de scrubs alternada (alternando com qualquer um iodopovidona (Betadine) ou um de clorexidina (Nolvasan) esfoliação e 70% de álcool isopropílico ou 70% de etanol embebido esponjas de gaze). </li><li> Umedeça um 0,5 ml de tuberculina Seringa (volume: 0,5 cc; bitola: 27,5 g) com tampão fosfato estéril (PBS), antes de aspirar o BM. Encha a seringa com 200-500 mL de PBS e expulsar imediatamente o PBS. Repita este procedimento 2-3 times. </li><li> Manter a tíbia dobrada do fémur, empurrando a tíbia ou com o dedo ou do quinto dedo. Confirme se um plano anestésico adequado foi atingido. A seringa é realizada utilizando o polegar e o dedo indicador. Isto permite que os côndilos a ser expostos e facilita a inserção da agulha. </li><li> Depois de molhar a seringa inserir a agulha através do tendão patelar, de modo que a agulha é apresentada de forma segura entre os dois côndilos do fémur. Mantendo a diáfise próxima da epífise do fémur com o polegar eo dedo indicador, a agulha é inserida no eixo do fémur facilmente. </li><li> Rodar a agulha para fora e para cima, de modo que é paralelo com o eixo do fémur. Esta acção facilita a recuperação do conteúdo de medula óssea a partir do eixo do fémur. </li><li> Gire o agulha e anti-horário, enquanto empurrando-o lentamente na cavidade da medula do fêmur. Confirme o correto posicionamento da agulha movendo suavemente a syRinge lateralmente. </li><li> Com cuidado, puxe o êmbolo agulha para trás, criando uma pressão negativa, enquanto movendo a agulha para trás e para a frente dentro da cavidade BM. Nota: O volume da BM aspirado será de aproximadamente 5 mL, que corresponde tipicamente a 0,4-0,8 x 10 6 células mononucleares. Aspiração bem sucedida será confirmado visualmente pelo aparecimento de sangue no topo da agulha na base da seringa. Se o sangue não é visto na seringa, é provável que um fragmento de osso ou tecido pequena está preso no interior da agulha. Este pode ser retirado a partir da agulha, movendo o êmbolo para cima e para baixo em PBS (este é uma razão para que a seringa deve ser previamente cheio com PBS antes de aspirar a BM). Se o tecido não pode ser desalojado da seringa, usar uma nova agulha e seringa (de novo molhar a seringa com 200-500 ul de PBS). </li><li> Uma vez BM é aspirado com sucesso a partir do fêmur, retire a agulha e seringa do fêmur e mouse. </li><li> Mover aspirado BM para um pr microtuboefilled com 500 ul de PBS. Para a maioria das aplicações, as células BM deve, então, ser mantido no gelo até o processamento, se possível. </li><li> Após a conclusão do procedimento, administrar analgésico com carprofeno 5 mg / kg por via subcutânea. Em seguida, retire do mouse da anestesia e coloque em uma almofada aquecida até que esteja totalmente recuperado. NOTA: Não deve haver nenhuma complicação ou angústia experimentada após o procedimento de aspiração, se feito corretamente. </li><li> Antes de devolver os ratos para a área de habitação, garantir que eles são capazes de atingir e deambular comida e água. Observe os ratos para detectar sinais de perigo ou procedimento pós infecção no próximo 24 horas. Os sinais incluem: sangramento constante, anemia, letargia. Se algum destes sinais são vistos após o procedimento, o animal (s) devem ser sacrificados. Nota: BM aspiração / amostragem pode ser repetida, mas o procedimento de repetição devem ser realizadas sobre o fémur oposta para prevenir o trauma repetido da mesma perna. Há pouca informação disponível sobre o frequency essa aspiração BM pode ser realizada. Aspiração da medula óssea do fêmur é geralmente repetida não mais frequentemente do que a cada 2 semanas. </li></ol> 2. Avaliação do conteúdo celular em Aspirado BM Células <ol><li> Células de pellets obtidos a partir BM aspiração e coloque em um tubo de microcentrífuga por centrifugação a 300 xg por 5 min a 4 ° C ou RT. </li><li> Aspirar o sobrenadante e, em seguida, voltar a suspender o sedimento em 500 ul de sangue vermelho ACK tampão de lise celular (tamp de lise &quot;de amónio-cloreto de potássio&quot;). </li><li> Incubar as células em tampão de lise de glóbulos vermelhos, durante 10 min e em seguida adicionar 1 ml de PBS e girar novamente a mistura a 300 xg por 5 min a 4 ° C ou TA. Nota: Os sedimentos de lise de glóbulos vermelhos é agora constituído por células mononucleares do BM. Estes podem ser ressuspendidos em coloração de FACS, a contagem das células, o transplante, a análise de citospina e / ou qualquer outra utilização (tal como células de MO colhidas a partir de ratinhos sacrificados seria utilizado). </li></ol>

<ol><li>Sundberg, R., Hodgson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspiration+of+bone+marrow+in+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Aspiration of bone marrow in laboratory animals.</a> Blood. 4, 557-561 (1949).</li>
<li>Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+technique+for+intrafemoral+injection+and+bone+marrow+sampling+in+mouse+transplant+models%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+lymphoma%22%5BJournal%5D)">Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models.</a> Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).</li>
<li>Warner, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+cooperating+genetic+events+in+the+leukemic+transformation+of+normal+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells.</a> Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).</li>
<li>Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-initiating+cells+in+human+T-lymphoblastic+leukemia+exhibit+glucocorticoid+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance.</a> Blood. 116, 5268-5279 (2010).</li>
<li>Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+isolation%2C+and+stimulation+of+quiescent+primitive+leukemic+progenitor+cells+from+patients+with+acute+myeloid+leukemia+%28AML%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML).</a> Blood. 101, 3142-3149 (2003).</li>
<li>Nolta, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gold+standard+improves%3A+a+better+assay+for+HSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The gold standard improves: a better assay for HSCs.</a> Blood. 106, 1141-1142 (2005).</li>
<li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121, 1109-1121 (2005).</li>
<li>Purton, L., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+factors+in+murine+hematopoietic+stem+cell+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays.</a> Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).</li>
<li>Dykstra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+propagation+of+distinct+hematopoietic+differentiation+programs+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo.</a> Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).</li>
<li>Jordan, C., Lemischka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+and+systemic+analysis+of+long-term+hematopoiesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse.</a> Genes & development. 4, 220-232 (1990).</li>
<li>Challen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnmt3a+is+essential+for+hematopoietic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation.</a> Nature genetics. 44, 23-31 (2012).</li>
<li>Hess, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+based+on+CD133+and+high+aldehyde+dehydrogenase+activity+isolates+long-term+reconstituting+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells.</a> Blood. 107, 2162-2169 (2006).</li>
<li>Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+myeloerythroid+repopulation+after+intrafemoral+transplantation+of+NOD-SCID+mice+reveals+a+new+class+of+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells.</a> Nat Med. 9, 959-963 (2003).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Serial aspiração BM é um procedimento de rotina fundamental para investigação clínica de distúrbios hematológicos em seres humanos. A capacidade de executar uma série de amostragem análoga do BM em ratos para a caracterização da composição celular e componentes da BM em todo longas experiências é também muito valioso. Este processo é útil para a caracterização de HSPC de sem sacrificar o rato, mas também para detectar a presença de tipos de células adicionais na BM nos casos em que o conteúdo do sangue periférico não po...

Todas as células sanguíneas são derivadas de células-tronco hematopoiéticas (HSCs). Procedimentos que permitem o acesso à medula óssea (MO), local da grande maioria das CTHs em camundongos e homens, sem exigir o sacrifício de animais, fornecem um recurso para monitorar a fonte de hematopoiese em série. O objetivo geral do procedimento descrito aqui é fornecer um protocolo detalhado para a amostragem de células BM do fêmur de camundongos vivos que forneça material representativo das células que seriam recuperadas pela colheita convencional de células BM por meio do sacrifício dos camundongos. A vantagem desse procedimento sobre a coleta convencional de células MO é que esse procedimento não requer o sacrifício de camundongos e, portanto, permite o estudo longitudinal do compartimento da medula óssea de camundongos ao longo do tempo. 
Embora este procedimento de aspiração de medula óssea murina tenha sido usado em vários estudos e descrito anteriormente (ver Sundberg et al. Para uma revisão histórica1), procedimentos formais passo a passo que ilustram essa técnica não foram publicados anteriormente. Este protocolo permite a amostragem seriada de rotina da MO para fins como a avaliação do enxerto na MO de células introduzidas exogenamente no camundongo (como seria feito em estudos de xenoenxerto, por exemplo, 2,3), análise do quimerismo na MO para comparação com o sangue periférico (onde os resultados não são necessariamente congruentes), monitoramento da abundância de tipos específicos de células normalmente enriquecidas na medula, como células-tronco hematopoiéticas e progenitoras, e recuperação de células MO para cultura ex vivo e/ou transplante. Além disso, a avaliação do conteúdo da medula pode ser muito útil em modelos murinos de doença hematológica, pois a aspiração é útil na avaliação da carga de doença hematológica em momentos em que a doença pode não ser evidente no sangue periférico3-5. Além disso, essa técnica pode ser usada para avaliar a resposta da doença hematológica na medula a drogas administradas em estudos terapêuticos. Assim, o procedimento descrito aqui é ideal para investigadores que desejam obter acesso a células hematopoiéticas da medula óssea de camundongos para análise citológica, análise de citometria de fluxo, cultura in vitro e/ou estudos de transplante in vivo sem exigir sacrifício ou dano aos camundongos. 
O protocolo de amostragem de MO aqui descrito é bastante semelhante à técnica utilizada para injeção intrafemoral de material diretamente na cavidademedular3,6. A principal diferença é que este protocolo detalha o procedimento para remoção de células da medula, em vez de instilar material diretamente no espaço da cavidade da medula, como é feito com a injeção intrafemoral.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>PAA</td><td>K41-001</td><td></td></tr><tr><td>ACK tampão de lise</td><td>Caseiro</td><td></td><td>em 1 L. Ajuste o pH 7,2 ~ 7,4 e filtre estéril com 0,22 &mu; M filtro de vácuo.</td></tr><tr><td>8.3 g de cloreto de amônio</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>1 g de bicarbonato de potássio</td><td>Fisher Scientific</td><td>P184-500</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l 0,5 M EDTA pH 8</td><td>Gibco</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA</td><td>E15-842</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de tuberculina de 0,5 ml 27,5 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células estéreis 70 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, USP</td><td>Attane</td><td>NDC:66794-014-25</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de ponta romba</td><td>Stemcell Technologies</td><td>28110</td><td></td></tr><tr><td>Agulha PrecisionGlide 23 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305193</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 3 ml Ponta Luer-Lok Becton</td><td>Dickinson</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Placa não tratada para cultura de tecidos, 6 Poços</td><td>Becton Dickinson</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>12 x 75 mm tubos de 5 ml&nbsp;</td><td>Coloração Becton Dickinson</td><td>352054</td><td>FACS 12</td></tr><tr><td>x 75 mm tubos de 5 ml com tampa do filtro de células</td><td>Coloração Becton Dickinson</td><td>352235</td><td>FACS coloração</td></tr><tr><td>NK1.1 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>108723</td><td></td></tr><tr><td>CD11b APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>101225</td><td></td></tr><tr><td>CD45R (B220) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103223</td><td></td></tr><tr><td>CD3 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>100222</tr><tr><td>Ly-6G e Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>108423</td><td></td></tr><tr><td>Ter119 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>116223</td><td></td></tr><tr><td>CD19 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>302217</td><td></td></tr><tr><td>CD4 APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>317417</td><td></td></tr><tr><td>CD117 (c-KIT) PE</td><td>BioLegend</td><td>105808</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>122513</tr><tr><td>CD34 APC</td><td>Biolegend</td><td>128612</td><td></td></tr><tr><td>CD16 / 32 e450</td><td>eBioscience</td><td>48-0161-82</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;, 6-Diamidino-2-fenilindol dicloridrato)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>32670</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434</td><td>STEMCELLTECHNOLOGIES</td><td>3434</td><td>Para cultura de metocelulose</td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>Crescent Chemical Empresa</td><td>C11045850</td><td>1 dose (5mg/kg)&nbsp;</td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo, LSRFortessa</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puralube vet pomada (pomada oftálmica de petrolato estéril)</td><td>Dechra-US</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr></tbody></table>

femoral medula Óssea aspiração live ratos

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

A amostragem seriada da composição celular da medula óssea (MO) é um procedimento de rotina crítico para a hematologia clínica. Este protocolo descreve um procedimento técnico detalhado passo a passo para um procedimento análogo em camundongos vivos que permite a caracterização seriada das células presentes na MO. Este procedimento facilita estudos destinados a detectar a presença de células administradas exogenamente dentro da MO de camundongos, como seria feito em estudos de xenoenxerto, por exemplo. Além disso, este procedimento permite a recuperação e caracterização de células enriquecidas na MO, como células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs), sem sacrifício de camundongos. Dado que a composição celular do sangue periférico não reflete necessariamente as proporções e tipos de células-tronco e progenitoras presentes na medula, os procedimentos que fornecem acesso a esse compartimento sem exigir a terminação dos camundongos são muito úteis. O uso da aspiração da medula óssea femoral é ilustrado aqui para análise citológica de células da medula, caracterização por citometria de fluxo do compartimento tronco hematopoiético/progenitor e cultura de HSPCs selecionadas obtidas por aspiração femoral de MO em comparação com a coleta convencional de medula.

Femoral BM aspiração de um rato C57/B6 vivo foi utilizado para obter as células mononucleares, seguido de colheita de BM BM convencional do mesmo rato, após sacrifício. Células mononucleares BM obtidos pelos dois métodos foram então analisadas por (1) análise citológica de células BM, (2) determinar a freqüência relativa das células-tronco / progenitoras hematopoiéticas (HSPCs), e (3) ex vivo cultura de HSPCs ordenados. No último ensaio, Sca1 linhagem negativa + c-kit + células (LSK) foram classificadas a parti...

Este protocolo descreve um procedimento para amostragem seriada da medula óssea (MO) femoral sem exigir o sacrifício de camundongos. Este procedimento facilita estudos longitudinais da composição da MO de camundongos ao longo do tempo e fornece acesso serial às células dentro da MO para estudos ex vivo e de transplante.

Femoral Medula Óssea aspiração Live Ratos

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

O objetivo geral deste procedimento é aspirar com segurança o conteúdo de células hematopoéticas da medula óssea do espaço medular do fêmur de um camundongo vivo. Isso é realizado primeiro acoplando uma seringa de tuberculina com PBS. Na segunda etapa, a perna do camundongo é cuidadosamente posicionada no ângulo ideal para a coleta da medula óssea.As células hematopoiéticas são então aspiradas do espaço medular do fêmur e os glóbulos vermelhos são removidos. Em última análise, a aspiração bem-sucedida do conteúdo da medula óssea pode ser visualizada por meio de análises citométricas e citológicas. O procedimento será demonstrado por Rock Chung, um técnico muito talentoso de nosso laboratório.A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a coleta convencional de medula óssea, é que ela permite a recuperação de uma parte das células hematopoéticas da medula óssea, mantendo o animal vivo para observação contínua e análises seriadas. F, após confirmar a sedação por meio do aperto no dedo da pata, aplique pomada oftálmica nos olhos do camundongo anestesiado para prevenir o ressecamento da córnea e depile a pata para expor a pele. Em seguida, realize a preparação cirúrgica asséptica da pele, esfregando a região com desinfetante de clorexidina, seguido de cotonete com álcool.Esse processo é realizado três vezes, utilizando uma seringa e agulha estéreis novas e fechadas para cada animal. Confirme que um plano anestésico adequado foi atingido. Em seguida, umedeça uma seringa de tuberculina de 0,5 mililitro com PBS estéril e aspire, em seguida expulse imediatamente 200 a 500 mililitros da solução salina duas a três vezes.Em seguida, use um dos dois últimos dedos de uma das mãos para dobrar suavemente a tíbia para longe do fêmur, facilitando a exposição do espaço condilar do fêmur e a inserção da agulha. Agora, insira a agulha através do tendão patelar, de modo que fique firmemente posicionada entre os dois côndilos do fêmur. Use o polegar e o indicador da outra mão para segurar a diáfise próxima à epífise do fêmur, permitindo que a agulha seja facilmente inserida no corpo do osso.Se nenhum sangue for observado na seringa, é provável que um pequeno fragmento de osso ou tecido esteja preso na agulha. Isso pode ser removido da agulha movendo-se o êmbolo para cima e para baixo em PBS. Se o tecido não puder ser desalojado da seringa, utilize uma nova agulha e seringa.Novamente, umedeça a seringa com 200 a 500 microlitros de PBS. Em seguida, gire a agulha no sentido horário e anti-horário enquanto a empurra contra o espaço condilar, de modo que fique paralela ao eixo do fêmur, para facilitar a retirada do conteúdo da medula óssea do corpo do fêmur.Gire a agulha no sentido horário e anti-horário enquanto a empurra lentamente para dentro da cavidade medular do fêmur. Confirme o posicionamento correto da agulha movendo suavemente a seringa lateralmente. Em seguida, puxe suavemente o êmbolo da agulha para trás, criando pressão negativa enquanto movimenta a agulha para frente e para trás dentro da cavidade da medula óssea.A aspiração bem-sucedida será confirmada pela presença de sangue na extremidade da agulha, na base da seringa. Uma vez que a medula óssea tenha sido aspirada com sucesso do fêmur, remova a agulha do osso e transfira a medula óssea aspirada para um tubo microcentrífugo previamente preenchido com 500 microlitros de PBS sobre gelo. Após a administração do analgésico, permita que o camundongo se recupere sob uma lâmpada de calor antes de devolvê-lo à área de alojamento.Certifique-se de que eles consigam se locomover e alcançar alimento e água. Em seguida, devolva o camundongo à sua gaiola e observe o animal em busca de sinais de estresse ou infecção após o procedimento nas próximas 24 horas. Enquanto isso, centrifugue as células da medula óssea, remova cuidadosamente o PBS por aspiração e re-suspenda o pellet.Em 500 microlitros de tampão de lise de eritrócitos após 10 minutos, lave as células em um mililitro de PBS. O pellet contém medula óssea de células mononucleares que podem ser usadas para análise experimental. Essas primeiras figuras ilustram como tipos e proporções semelhantes de células totais e de células-tronco e progenitoras hematopoéticas podem ser observados por análises morfológicas e citométricas de fluxo utilizando tanto a aspiração da medula óssea femoral quanto a coleta convencional de medula óssea.Aqui é mostrada a porcentagem de subpopulações de progenitores mieloides negativas para linhagem, positivas para SKA um e positivas para C kit, como frequência de células vivas totais em três aspirações independentes e na coleta convencional de medula. Esses dados revelam uma diminuição nas subpopulações de progenitores negativos para linhagem, positivos para SKA um, positivos para C kit e progenitores mieloides na medula óssea coletada por aspiração femoral em comparação com a coleta convencional de medula. Essa diferença não foi estatisticamente significativa para a população.No entanto, o isolamento de células negativas para linhagem, positivas para ska um e positivas para cki, seguido por cultura *ex vivo* em metilcelulose, resulta em números semelhantes de colônias e tipos celulares obtidos por aspiração da medula óssea femoral. Assim como na coleta convencional de medula óssea, os tipos de colônias observados e enumerados em ambas as culturas incluem unidades formadoras de colônia de granulócitos, eritrócitos, monócitos e megacariócitos, unidades formadoras de colônia de granulócitos e monócitos, e unidades formadoras de surto eritróide One master. Esta técnica pode ser realizada em 10 minutos por camundongo, se realizada corretamente seguindo este procedimento.Outros métodos, como a injeção intrafemoral de medula óssea, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como qual é o efeito do xenotransplante de células hematopoiéticas humanas em camundongos imunocomprometidos?

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Os modelos animais são freqüentemente utilizada para estudar metástase de câncer de osso. Neste protocolo, iremos descrever dois métodos comuns de inoculação do tumor para estudos de metástase óssea e descrever brevemente algumas das análises utilizadas para monitorar e quantificar esses modelos.

Modelos de metástase óssea

Este vídeo descreve um protocolo detalhado para isolar a medula óssea inteira fresca dos membros posteriores do camundongo para investigar defeitos de MO total para pacientes com doenças do sangue, como leucemia.

Colheita de medula óssea do membro posterior do camundongo

Os monócitos são os principais reguladores da imunidade inata e desempenham um papel crítico na renovação do sistema fagocítico mononuclear periférico e em caso de inflamação. Este manuscrito descreve o procedimento de imagem em tempo real da medula óssea da calvária de camundongos para estudar o mecanismo de mobilização de monócitos.

Acompanhando Rato Medula Óssea monócitos<em&gt; In Vivo</em

É apresentada uma estratégia para analisar quantitativamente os dados histológicos na medula óssea. A microscopia confocal de células marcadas com fluorescência em seções de tecido resulta em imagens bidimensionais, que são analisadas automaticamente. As análises de co-localização de diferentes tipos de células são comparadas com dados de imagens simuladas, fornecendo informações quantitativas sobre as interações celulares.

Automated Quantificação de células hematopoiéticas - Interações de células estromais em imagens histológicas de osso não descalcificadas

O protocolo descreve um novo modelo de câmara de janela de fêmur murino que pode ser usado para rastrear o movimento de células na medula óssea femoral in vivo. A microscopia de fluorescência multifotônica intravital é usada para obter imagens de três componentes da medula óssea femoral (vasculatura, matriz de colágeno e neutrófilos) ao longo do tempo.

Modelo Câmara fêmur Janela para<em&gt; In Vivo</em&gt; Acompanhamento de celular na Murino de Medula Óssea

Microscopia de fluorescência intravital (IVFM) da calvária é aplicada em combinação com modelos de animais geneticamente para estudar o homing e enxertia das células hematopoiéticas em nichos de medula óssea (BM).

Combinando a microscopia Intravital fluorescente (IVFM) com modelos genéticos para estudar a dinâmica de enxertia das células hematopoiéticas para nichos de medula óssea

O modelo murino fratura fechada do fêmur é uma plataforma poderosa para estudar a consolidação da fratura e novas estratégias terapêuticas para acelerar a regeneração óssea. O objetivo do presente protocolo cirúrgico é gerar fraturas femorais fechadas unilaterais em camundongos, usando uma haste intramedular aço para estabilizar o fêmur.

A geração de fraturas fechadas de fêmur em ratos: um modelo para estudar a consolidação óssea

Aqui, nós apresentamos um protocolo para processar a medula fresca (BM) isolada do rato ou do ser humano para a análise de massa High-dimensional da citometria (citometria pela tempo--vôo, cytof) de pilhas da neutrófilos-linhagem.

Preparação de medula óssea inteira para análise de citometria de massa de células de linhagem de neutrófilos

Descrevemos três métodos de transplante de medula óssea (TMO): TMO com irradiação total do corpo, TMO com irradiação blindada e método de TMO sem pré-condicionamento (TMO adotivo) para o estudo da hematopoiese clonal em modelos de camundongos.

Procedimentos de transplante de medula óssea em camundongos para estudar hematopoiese clonal

Este protocolo descreve a injeção intrafemoral de algumas células-tronco hematopoiéticas ou leucêmicas, incluindo células editadas por genes, em modelos de xenoenxerto murino, o que permitirá não apenas o transplante rápido e seguro de células, mas também análises seriadas da medula óssea.

Injeções intrafemorais simplificadas usando camundongos vivos permitem análise contínua da medula óssea

Este é apresentado um protocolo detalhado para isolar e caracterizar populações microambientais da medula óssea de modelos murinos de síndromes mielodisplásicas e leucemia mieloide aguda. Esta técnica identifica alterações no nicho da medula óssea não hematopoiética, incluindo as células endoteliais e estromais mesenquimais, com a progressão da doença.

Identificação de Populações Microambientais de Medula Óssea na Síndrome Mielodisplásica e Leucemia Mielóide Aguda

Aprenda a aspirar medula óssea femoral em camundongos vivos sem sacrificar os animais. Este método permite estudos longitudinais de hematopoiese e análises citométricas repetidas.

Femoral Medula Óssea aspiração Live Ratos

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