Protocolo SIVQ-LCM para o Instrumento ArcturusXT

O objetivo geral deste procedimento é usar a análise de imagem espacialmente invariante, quantização vetorial ou SIVQ em combinação com MICRODISSECÇÃO de captura a laser ou LCM para identificar características teciduais de interesse e realizar rapidamente a microdissecção direcionada. Isso é feito capturando primeiro imagens do tecido-alvo para SIVQ. A análise SIVQ é então realizada e a anotação SIVQ é importada para o dispositivo de microdissecção para processamento.

Em última análise, as células de interesse podem ser isoladas por S-I-V-Q-L-C-M para análise molecular a jusante. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes é que o S-I-V-Q-L-C-M agiliza o processo de seleção e microdissecação de grandes áreas-alvo que, de outra forma, seriam desafiadoras e demoradas pelas técnicas tradicionais de microdissecação por captura a laser. Demonstrando o procedimento estará o Dr. Avi Rosenberg, um colega clínico em nosso laboratório, para obter imagens das amostras de tecido de interesse.

Primeiro, carregue as lâminas no estágio motorizado do instrumento de microdissecção e inicie o software relacionado. Em seguida, marque as caixas de seleção apropriadas para designar as posições dos slides carregados e certifique-se de que os arquivos de imagem capturados sejam salvos no formato JPEG. Ajuste o brilho e o foco da imagem na tela para otimizar a qualidade da imagem.

Em seguida, usando a caixa de ferramentas de inspeção, ligue o difusor e defina um lamp brilho de 60 e um ganho de câmera de dois 20. Na janela de visão geral, clique com o botão direito do mouse para selecionar, lembrar as configurações e salvar. Capture uma imagem de visão geral em miniatura do slide para fornecer um roteiro para o processo de dissecação.

Ajuste uma ampliação e encontre a área de interesse. Em seguida, capture uma imagem da área para análise de algoritmo das imagens capturadas. Comece transferindo as imagens para a pasta SIVQ.

Em seguida, abra o SIVQ e carregue a imagem capturada de interesse. Navegue até a área de interesse e ajuste o tamanho das janelas de exibição da janela de visualização cinco e seis sem ajustar a ampliação da imagem. Em seguida, selecione o tamanho do vetor de anel e o número de anéis a serem usados para análise.

Clique com o botão direito do mouse no recurso de imagem predicada a ser capturado na janela seis da janela de visualização, selecione mapa de calor e clique em digitalizar para X para analisar a imagem. Em seguida, use a parte superior das duas barras deslizantes horizontais para ajustar a especificidade geral do vetor. Use a barra inferior para aumentar a sensibilidade após o desempenho da pele.

Para aumentar a área classificada como correspondente, desmarque a caixa de opção do mapa de calor para garantir que o mapa de calor SIVQ seja alterado para uma cor vermelha uniforme e aumente o tamanho da tinta. Salve a imagem clicando no botão salvar imagem. Em seguida, converta a saída BMP em um formato de arquivo JPEG.

Em seguida, use um editor hexadecimal para recolher as coordenadas posicionais encontradas entre o início do marcador de imagem e o primeiro marcador de tabela de quantização definido no cabeçalho do arquivo do JPEG de pós-análise da imagem original do instrumento de dissecação antes de iniciar a microdissecação. Coloque a MICRODISSECÇÃO de captura a laser ou a tampa LCM no centro da região de interesse onde as imagens foram capturadas para a análise do SIVQ. Em seguida, depois de calibrar os lasers UV e infravermelho, otimize os parâmetros, incluindo duração da energia, localização do laser e velocidade de corte UV.

Em seguida, abra o software de seleção automatizada e importe a imagem analisada. Crie um novo arquivo de análise para treinar o software de seleção automatizada para reconhecer a anotação SIVQ. Agora selecione as áreas de fundo marcadas pelos quadrados azuis da imagem analisada pelo SIVQ.

Em seguida, selecione as regiões de interesse ou R OIS marcadas pelos círculos vermelhos e clique em aprender para gerar o arquivo de treinamento. Copie as áreas selecionadas para a imagem ao vivo. Para iniciar a microdissecção, selecione a caixa de ferramentas de microdissecação e escolha os botões apropriados de captura de infravermelho ou corte UV.

Após a conclusão da dissecação, mova a tampa LCM para a estação de controle de qualidade e capture uma imagem da amostra dissecada. Finalmente, se as amostras desejadas foram dissecadas com sucesso, clique no botão do estágio atual e remova a tampa do LCM para iniciar o procedimento de extração molecular para análise a jusante. Neste experimento representativo, uma seção de tecido mamário humano embebido em parafina fixada em formalina foi imunomarcada para citoqueratina AE um, AE três usando um protocolo de imuno-histoquímica padrão.

Como esse tecido não pode ser coberto para microdissecção, as células coradas imuno-histoquímicas podem ser difíceis de apreciar visualmente. Assim, para fornecer melhor correspondência de índice e uma imagem aprimorada, xilenos foram adicionados à seção de tecido para criar uma pseudo lamínula. Uma imagem JPEG foi então capturada da área da pseudo-cobertura e importada para o SIVQ para análise do algoritmo.

Um recurso de imagem predicado observado como uma coloração DAB marrom escura foi selecionado pelo usuário e o algoritmo SIVQ foi iniciado para análise de imagem. O mapa de calor SIVQ foi então convertido em uma tinta vermelha que é reconhecida pelo software de seleção automatizada, e os xilenos foram deixados evaporar. O mapa de calor do SIVQ foi então importado para o software de seleção automatizada.

Por fim, as células destacadas foram dissecadas com o laser infravermelho. A tampa LCM foi então movida para a estação de controle de qualidade do instrumento de microdissecção e inspecionada visualmente para avaliar o sucesso da dissecção. O tecido restante também foi inspecionado e o mapa de calor do SIVQ foi reimportado.

Para confirmar ainda mais a eficiência da microdissecação, uma vez dominado, o S-I-V-Q-L-C-M pode ser feito em questão de minutos por lâmina, fornecendo rapidamente uma entrada enriquecida para uma variedade de técnicas analíticas a jusante. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como implementar o S-I-V-Q-L-C-M em seu fluxo de trabalho de microdissecação.