Name: Protocolo SIVQ-LCM para o Instrumento ArcturusXT (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Aprenda a técnica SIVQ-LCM para microdissecção a laser de tecidos com análise de imagem espacialmente invariante. Este método acelera a identificação e isolamento preciso de células para análise molecular em pesquisa biomédica.

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O estudo foi financiado em parte pelo Programa de Pesquisa Intramural dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional do Câncer, Centro de Pesquisa do Câncer.

O protocolo descrito foi utilizado em conformidade com as normas do NIH sobre a utilização de amostras de tecidos humanos. 1. Preparação de Tecidos <ol><li> Antes do início, obter amostras de tecidos humanos de acordo com a Institutional Review Board (IRB) protocolos. </li><li> Escolha o tipo de bloco de tecido / célula e correspondente método de processamento [fixadas em formalina embebido em parafina (FFPE), congelados ou fixo-etanol (EFPE) incluído em parafina]. Fixação formalina fornece histologia ideal, com fixação de etanol e flash congelado. No entanto, métodos de transformação e de fixação do tecido podem afectar o ADN, ARN, e a quantidade de proteína e de qualidade para análise molecular e a jusante devem ser considerados. </li><li> Corte as seções do bloco de tecido / célula para o tipo de slide (vidro, vidro da membrana, ou membrana estrutura de metal) de escolha. Análise SIVQ funciona igualmente bem em todos os três tipos de slides. Por favor, note que o método pseudo-lamela (descrito abaixo) com xilenos e Ethanol não pode ser realizado nas lâminas de membrana de armação de metal uma vez que a lâmina tem de ser invertida no palco. </li><li> Selecione uma mancha tecido química ou com base em IHC para identificar as células de interesse do fundo. Note-se que os métodos de coloração pode também afectar o ADN, ARN, e qualidade e quantidade de tecido de proteína. Teste o tecido após coloração para avaliar a qualidade da linha de base de biomoléculas, antes de prosseguir com o protocolo. SIVQ-LCM foi realizada em lâminas de tecido / citologia coradas com: imuno-histoquímica (IHQ) com DAB 15, imunofluorescência, vermelho rápido, de novo vermelho, azul de toluidina e hematoxilina e eosina (H &amp; E) (dados não publicados). </li></ol> 2. Specimen Imagem <ol><li> Carga desliza no palco motorizado do instrumento microdissection e lançar o software relacionado. Marque as caixas de seleção para designar as posições das lâminas carregadas e garantir que os arquivos de imagens captadas devem ser salvos no formato jpeg. </li><li> Otimizar o imqualidade idade, ajustando o brilho eo foco da imagem na tela, usando o anel de foco manual ou através do software do instrumento de dissecação. <ol><li> Usando a caixa de ferramentas Imagem no software do instrumento de dissecação, definir o ganho de brilho da lâmpada e câmera de forma adequada. Exemplo de valores de brilho são = 60 = 220 e ganho, com o difusor. </li><li> Concentre-se manualmente ou com o recurso de foco automático no software. </li></ol></li><li> Capturar uma imagem panorâmica miniatura do slide para fornecer um roteiro para o processo de dissecação. <ol><li> Para melhor qualidade de imagem de um slide de uncoverslipped, utilizar o difusor abaixo do condensador sobre o instrumento, ou, adicionar uma pequena quantidade (~ 30 mL) de etanol ou xilenos para melhorar o índice refratário (pseudo-lamela). Ao utilizar xilenos, estar ciente de que eles são deve ser utilizado medidas de segurança adequadas e tóxicas, incluindo o uso de um exaustor e jaleco de proteção, óculos de proteção dos olhos, e luvas. </li><li> NÃO coloque a tampa da LCM no slide até a solução de etanol ou xilenos foi completamente limpo ou o polímero na tampa será distorcida. </li></ol></li><li> Navegue o slide e capturar imagens das áreas a serem dissecados em 10X, 20X ou 40X de ampliação. Se necessário, melhorar a imagem com software como AutoCorreção (no Microsoft Office Picture Manager), como descrito anteriormente 22. As imagens devem ser capturadas em formato jpeg, que lhes permitam ser re-importado para o software de seleção automática. </li></ol> 3. Algoritmo Análise da Imagem <ol><li> Transferência de imagens capturadas a partir do instrumento microdissection para a pasta SIVQ. Instalar e abrir os pacotes de software ArcturusXT, AutoScan e SIVQ no computador conectado ao instrumento de dissecação. Para ter acesso ao software SIVQ, por favor, entre em contato com o Dr. Ulysses Balis (ulysses@med.umich.edu). </li><li> Abrir SIVQ e carregar a imagem capturada (jpeg) de interesse. &lt;/ Li&gt; <li> Navegar para a área de interesse e / ou ajustar o tamanho das janelas de visor de visualização (5 e 6). No software SIVQ, Viewport 5 mostra a imagem de pré-processamento e Viewport 6 mostra a imagem pós-processamento 16. </li><li> Escolher o tamanho do vector de anel e o número de anéis de ser utilizados. </li><li> Selecione o recurso de imagem predicado a ser capturada pelo botão direito sobre ele na Viewport 6. </li><li> Clique em &quot;Scan&quot; para analisar a imagem. </li><li> Ajustar a probabilidade estatística da imagem correspondente, utilizando as duas barras deslizantes. A barra superior ajusta a especificidade global do vetor, e é utilizado para excluir a área a partir da pesquisa inicial (com sensibilidade, tal como definido pela variável selecionado &quot;Dados&quot;) que podem representar excessiva área incluída. Por outro lado, a barra inferior é utilizado para aumentar a sensibilidade, depois de uma análise é executada, com a intenção de aumentar a área que é classificada como sendo um jogo. Ambos os controles deslizantes utilize a variável &quot;Dados&quot;, como o limiar de sensibilidade ao início do estudo. </li><li> Para salvar a imagem, clique em &quot;salvar como jpeg&quot; (imagem agora está salvo na pasta c :/ vq_test / fotos). </li><li> Analisar a imagem com o algoritmo. A saída do algoritmo de análise deve resultar numa imagem anotada para que possa ser utilizado em SIVQ-LCM. No momento, a versão atual do motor central SIVQ está em testes beta versão com a expectativa de que a versão de produção total (disponível Q1 2014) irá incorporar um kit de desenvolvimento de software completo (SDK) e uma interface de programação de aplicativo (API) para a integração simplificada de filtros espaciais gerados por usuários e as etapas de processamento de dados de fluxo de trabalho a jusante com o motor correspondente anel central. Este SDK será distribuído com um conjunto completo de documentação. <ol><li> Verifique se o heatmap SIVQ é alterado para uma cor vermelha uniforme. </li></ol></li><li> Exporte a imagem. É essencial para a re-inserir as coordenadas de posição do post-análise de imagem JPEG usando um editor de HEX para colar no cabeçalho do arquivo a partir da imagem instrumento dissecção originais. Os dados apropriados podem ser encontradas entre o &quot;Início da Imagem&quot; marcador (0xFF, 0xD8) eo primeiro &quot;Definir Quantização Table&quot; marcador (0xFF, 0xDB). </li></ol> 4. Microdissecção <ol><li> Coloque a tampa LCM no centro da região de interesse, onde as imagens foram capturadas para análise SIVQ. </li><li> Calibrar e Controle de Qualidade (CQ) os lasers UV / IR e otimizar os parâmetros, incluindo a energia, a duração, locais de laser, e velocidade de corte UV (como recomendado pelo fabricante). Execute estas calibrações antes de voltar a importar a imagem analisada. </li><li> Abrir AutoScanXT (software seleção automática) e importar a imagem analisada a partir de c :/ vq_test pasta / pics. </li><li> Treinar o software de selecção automática para reconhecer a anotação SIVQ e criar o mapa de dissecação. <ol><li> Para criar um training arquivo, selecione quatro regiões de interesse (marcadas por &quot;círculos azuis&quot;) sobre a &quot;tinta vermelha&quot; da imagem analisada SIVQ. </li><li> Selecione as áreas de fundo (marcadas por &quot;quadrados vermelhos&quot;) que não estão a ser dissecado. </li><li> Clique no botão &quot;Analisar&quot; para gerar o arquivo de treinamento, que pode ser guardado para usos posteriores. </li></ol></li><li> Realizar microdissecção usando o apropriado infravermelho (IR) e / ou ultravioleta (UV) lasers. <ol><li> Copie as áreas selecionadas para a imagem &quot;ao vivo&quot;. </li><li> Na caixa de ferramentas &quot;microdissect&quot;, selecione a captura IR apropriado ou botões de corte UV. </li></ol></li><li> Após a dissecção é completa, mova a tampa de LCM para a estação de QC e capturar uma imagem dos tecidos / células dissecadas. Outra abordagem é o de colocar a tampa sobre uma área vazia do slide antes de movê-lo para a estação de QC, o que permite ao usuário tirar fotos em várias ampliações. </li><li>Capturar uma imagem da área de tecido de interesse após microdissecção para avaliar ainda mais levantando a eficiência. </li><li> Se as células desejadas foram dissecados com êxito, clique no botão &quot;estágio atual&quot; no software ArcturusXT e retire a tampa LCM dar início ao processo de extração molecular para análise de downstream. </li></ol>

<ol><li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+molecular+analysis+of+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278, 1481-1483 (1997).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li>
<li>Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+mammalian+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of mammalian tissue.</a> J Vis Exp. (8), (2007).</li>
<li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+in+Barrett%27s+esophagus%3A+laser+capture+versus+whole+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian journal of gastroenterology. 44, 787-795 (2009).</li>
<li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection.</a> Nature. 1, 586-603 (2006).</li>
<li>Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contaminating+cells+alter+gene+signatures+in+whole+organ+versus+laser+capture+microdissected+tumors%3A+a+comparison+of+experimental+breast+cancers+and+their+lymph+node+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+experimental+metastasis%22%5BJournal%5D)">Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases.</a> Clinical & experimental metastasis. 25, 81-88 (2008).</li>
<li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components%3A+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in molecular biology. 980, 61-120 (2013).</li>
<li>Silvestri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+pathway+biomarker+analysis+of+human+cancer+reveals+requirement+for+upfront+cellular-enrichment+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+investigation%3B+a+journal+of+technical+methods+and+pathology%22%5BJournal%5D)">Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 90, 787-796 (2010).</li>
<li>Eberle, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoguided+laser+assisted+microdissection+techniques+for+DNA+methylation+analysis+of+archival+tissue+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+molecular+diagnostics+%3A+JMD%22%5BJournal%5D)">Immunoguided laser assisted microdissection techniques for DNA methylation analysis of archival tissue specimens.</a> The Journal of molecular diagnostics : JMD. 12, 394-401 (2010).</li>
<li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctions+in+gastric+cancer+gene+expression+signatures+derived+from+laser+capture+microdissection+versus+histologic+macrodissection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+medical+genomics%22%5BJournal%5D)">Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection.</a> BMC medical genomics. 4, 48(2011).</li>
<li>Klee, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sample+acquisition+and+linear+amplification+on+gene+expression+profiling+of+lung+adenocarcinoma%3A+laser+capture+micro-dissection+cell-sampling+versus+bulk+tissue-sampling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+medical+genomics%22%5BJournal%5D)">Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling.</a> BMC medical genomics. 2, 13(2009).</li>
<li>Zheng, J., Garg, S., Wang, J., Loose, D. S., Hauer-Jensen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissected+mucosa+versus+whole+tissue+specimens+for+assessment+of+radiation-induced+dynamic+molecular+and+pathway+changes+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissected mucosa versus whole tissue specimens for assessment of radiation-induced dynamic molecular and pathway changes in the small intestine.</a> PloS one. 8, e53711(2013).</li>
<li>Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+enriched+populations+of+neurons+or+single+neurons+for+gene+expression+analysis+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li>
<li>Iyer, E. P., Cox, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+Drosophila+peripheral+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons.</a> J Vis Exp. (39), (2010).</li>
<li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIVQ-aided+laser+capture+microdissection%3A+A+tool+for+high-throughput+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+pathology+informatics%22%5BJournal%5D)">SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling.</a> Journal of pathology informatics. 2, 19(2011).</li>
<li>Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+Invariant+Vector+Quantization%3A+A+pattern+matching+algorithm+for+multiple+classes+of+image+subject+matter+including+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol+Inform%22%5BJournal%5D)">Spatially Invariant Vector Quantization: A pattern matching algorithm for multiple classes of image subject matter including pathology.</a> J Pathol Inform. 2, 13(2011).</li>
<li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+complex+cancer+morphology+detection+using+the+SIVQ+pattern+recognition+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Cell+Pathol+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Optimization of complex cancer morphology detection using the SIVQ pattern recognition algorithm.</a> Anal Cell Pathol (Amst). , (2011).</li>
<li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+architectural+and+cytologic+drive+n+image+algorithms+for+prostate+adenocarcinoma+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+cellular+pathology%22%5BJournal%5D)">Integration of architectural and cytologic drive n image algorithms for prostate adenocarcinoma identification.</a> Analytical cellular pathology. 35, 251-265 (2012).</li>
<li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+area+calculation+of+histopathologic+features+using+SIVQ%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Cell+Pathol+%28Amst%22%5BJournal%5D)">Automated area calculation of histopathologic features using SIVQ.</a> Anal Cell Pathol (Amst. 34, (2011).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+vector+selection+of+SIVQ+and+parallel+computing+integration+MATLAB%3A+Innovations+supporting+large-scale+and+high-throughput+image+analysis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Automated vector selection of SIVQ and parallel computing integration MATLAB: Innovations supporting large-scale and high-throughput image analysis studies.</a> Journal of pathology. 2, 37(2011).</li>
<li>Roy Chowdhuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semiautomated+laser+capture+microdissection+of+lung+adenocarcinoma+cytology+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cytol%22%5BJournal%5D)">Semiautomated laser capture microdissection of lung adenocarcinoma cytology samples.</a> Acta Cytol. 56, 622-631 (2012).</li>
<li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Microarrays+%28IMA%29%3A+Digital+Pathology%27s+Missing+Tool%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Image Microarrays (IMA): Digital Pathology's Missing Tool.</a> Journal of pathology. 2, (2011).</li>
<li>Hanson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+microdissection+adapted+to+commercial+laser+dissection+instruments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments.</a> Nature. 6, 457-467 (2011).</li>
</ol>

Michael R. Emmert-Buck é um inventor de patentes NIH-realizadas cobrindo captura de microdissecção a laser e recebe pagamentos baseados em direitos autorais por meio do Programa de Transferência de Tecnologia NIH.

Nós apresentamos um protocolo para a aplicação de SIVQ-LCM para microdissect células epiteliais imunoistoquímica de FFPE tecido mamário humano. O uso de um algoritmo de análise de imagem, tal como SIVQ, reduz a quantidade de mão-de tempo necessário para o processo de microdissecção. Este é um avanço potencialmente importante para o campo de tempo e uma vez que o esforço do operador é tipicamente o passo limitante da velocidade para a dissecção precisa das células de interesse. No presente protocolo, especificamente adap...

Originalmente desenvolvido em meados dos anos 1990, a captura a laser microdissecção (LCM), permite ao usuário capturar com precisão células específicas ou regiões celulares de uma secção de tecido histológico via visualização microscópica 1, 2. Muitos estudos comparando a análise molecular de LCM contra arranhões tecido ilustrar o valor do método 3-12. Além disso, há três publicações de protocolo de vídeo sobre a tecnologia que está disponível para visualização 13, 14. No entanto, apesar de seu valor comprovado, LCM pode ser tedioso e trabalhoso quando o alvo de interesse é uma população de células dispersas em uma seção de tecido heterogêneo, ou quando um grande número de células são necessárias para aplicações a jusante específicas, como a proteômica. A carga colocada sobre o operador humano nos levou a desenvolver uma abordagem dissecação semi-automatizado para LCM pela combinação de um algoritmo de análise de imagem poderosa para orientar o processo LCM 15. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Em colaboração com a Universidade de Michigan, nosso laboratório no NIH estendeu o previamente desenvolvido e relatado espacialmente invariante quantização vetorial (SIVQ) algoritmo de forma a permitir que ele semi-automatizar o processo de seleção de tecido intrínseco à guiados microdissection, tornando assim disponível uma ferramenta com o patologista ou cientista vida em mente. Espacialmente invariante quantização vetorial (SIVQ) é um algoritmo que permite que o usuário simplesmente &quot;clicar&quot; sobre uma característica histológica de interesse para criar um vetor de toque (recurso de imagem predicado) que pode ser usado para procurar toda a imagem histológica, o ajuste do limiar estatístico conforme necessário 16-21. O mapa de calor resultante exibe a qualidade de jogos para o recurso inicial imagem predicado e é posteriormente convertido em uma única cor (vermelho) mapa anotação que pode ser importado para o instrumento LCM. O software de seleção automatizada, AutoScanXT, é então usada para desenhar um mapa com basena anotação do SIVQ guiar a captura das células alvo da amostra de tecido. O protocolo detalhado abaixo descreve a implementação de SIVQ no fluxo de trabalho microdissection.

<table><tbody><tr><td>Lâminas de Vidro Carregadas Positivas</td><td>Thermo Scientific</td><td>4951Plus-001</td><td></td></tr><tr><td>Xilenos, reagente ACS, &ge; 98,5% xilenos + etilbenzeno à base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>247642</td><td>CUIDADO: USE OS PROCEDIMENTOS DE SEGURANÇA ADEQUADOS.</td></tr><tr><td>Álcool etílico, prova de U.S.P. 200, anidro</td><td>The Warner-Graham Company</td><td>6.505E+12</td><td>CUIDADO: USE OS PROCEDIMENTOS DE SEGURANÇA ADEQUADOS.</td></tr><tr><td>Arcturus CapSure Macro LCM Caps</td><td>Life Technologies</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>ArcturusXT Laser Microdissection Instrument</td><td>Life Technologies</td><td>Software ARCTURUSXT</td><td></td></tr><tr><td>AutoScanXT</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Um programa opcional de análise de imagem para o dispositivo de microdissecação a laser ArcturusXT. Este software é necessário para o SIVQ-LCM.</td></tr><tr><td>Quantização de vetores espacialmente invariantes (SIVQ)</td><td>Universidade de Michigan</td><td></td><td>Este conjunto de ferramentas está disponível publicamente para colaborações acadêmicas. Para acessar o algoritmo SIVQ, entre em contato com o Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu]</td></tr></tbody></table>

protocolo sivq-lcm para o instrumento arcturusxt

SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

SIVQ-LCM é uma nova metodologia que automatiza e simplifica o, o processo de dissecação de laser mais tradicional dependente do usuário. O objetivo é criar uma, rapidamente personalizável tecnologia laser avançada plataforma de dissecção. Neste relatório, nós descrevemos a integração do software de análise de imagem e espacialmente invariantes Quantização Vetorial (SIVQ) sobre o instrumento ArcturusXT. O sistema contém um ArcturusXT infravermelho (IV) e ultravioleta (UV) de laser, permitindo celular específico ou grandes dissecações da área. O objetivo principal é melhorar a velocidade, precisão e reprodutibilidade da dissecção de laser para aumentar a produtividade de amostras. Esta nova abordagem facilita microdissection de animais e tecidos humanos em investigação e fluxos de trabalho clínicos.

A secção de tecido FFPE materno foi histoquímica para citoqueratina AE1/AE3 usando um protocolo padrão IHC 23. Após a coloração, o tecido foi colocado deslizante na fase ArcturusXT e o protocolo SIVQ-LCM foi iniciado como descrito acima. Uma vez que o tecido não pode ser lamínulas por microdissecção, as células coradas + IHC pode ser difícil de discernir visualmente (Figura 1A). Assim, para proporcionar um melhor índice correspondente e uma melhoria da imagem, xilenos foram adicionados à secç...

SIVQ-LCM é uma abordagem inovadora que utiliza um algoritmo de computador, espacialmente invariantes Quantização Vetorial (SIVQ), para conduzir o processo a laser microdissection captura (LCM). O fluxo de trabalho SIVQ-LCM melhora a velocidade e precisão da microdissecção, com aplicações tanto na pesquisa e na clínica.

Protocolo SIVQ-LCM para o Instrumento ArcturusXT

SIVQ-LCM is a new methodology that automates and streamlines the more traditional, user-dependent laser dissection process.&#160;It aims to create an ...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar a análise de imagens por quantização vetorial invariante espacial, ou SIVQ, em combinação com microdissecção a laser, ou LCM, para identificar características teciduais de interesse e realizar rapidamente microdissecção direcionada. Isso é realizado primeiramente capturando imagens do tecido-alvo para o SIVQ. Em seguida, a análise SIVQ é realizada e a anotação SIVQ é importada para o dispositivo de microdissecção para processamento.Por fim, as células de interesse podem ser isoladas por S-I-V-Q-L-C-M para análise molecular subsequente. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes é que a S-I-V-Q-L-C-M simplifica o processo de seleção e microdissecção de grandes áreas-alvo que, de outra forma, seriam difíceis e demoradas por meio das técnicas tradicionais de microdissecção a laser. O procedimento será demonstrado pelo Dr. Avi Rosenberg, pesquisador clínico em nosso laboratório, para imagens dos espécimes teciduais de interesse.Primeiro, carregue as lâminas na platina motorizada do instrumento de microdissecção e inicie o software correspondente. Em seguida, selecione as caixas de seleção apropriadas para designar

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui apresentamos um protocolo para construir um espectrómetro de Brillouin rápida. Cascata matriz fase praticamente fotografada (Vipa) etalons alcançar uma velocidade de medição mais de 1.000 vezes mais rápido do que de digitalização tradicional espectrômetros Fabry-Perot. Este melhoramento proporciona os meios para análise de Brillouin de tecido e biomateriais em níveis baixos de potência in vivo.

Alta velocidade Spectrometer Sub-GHz para Brillouin Scattering Análise

Este artigo fornece um guia detalhado para a montagem e operação de um microscópio de iluminação estruturada operando com iluminação de fluorescência de reflexão interna total (TIRF-SIM) para obter imagens de processos biológicos dinâmicos com super-resolução óptica em várias cores.

Um Guia para Estruturado iluminação TIRF microscopia de alta velocidade com várias cores

espectros de raios-X fornecem uma riqueza de informações sobre plasmas de alta temperatura. Este manuscrito apresenta o funcionamento de uma alta resolução de comprimento de onda espacialmente Imaging Spectrometer de raios-X utilizado para visualizar os íons a hidrogénio e hélio-como de elementos de número atómico médio em um plasma de tokamak.

Aplicando raios-X de imagem de cristal Spectroscopy para uso como uma alta temperatura do plasma de diagnóstico

A determinação da estrutura da solução de proteína por um pequeno ângulo de dispersão de raios-X (SAXS) requer amostras monodispersas. Aqui, apresentamos duas possibilidades para assegurar atrasos mínimos entre a preparação da amostra e aquisição de dados: cromatografia em linha de exclusão de tamanho (SEC) e cromatografia de troca iônica em linha (IEC).

On-line Tamanho-exclusão e cromatografia de troca iônica em uma SAXS Beamline

São descritos detalhes da geração e otimização de sinais, medição, aquisição de dados e manuseio de dados para um espectrômetro de Raman estimulado por tempo femtosegundo. Um estudo de Raman quase infravermelho estimulado sobre a dinâmica de estado animado de β-caroteno no tolueno é mostrado como uma aplicação representativa.

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Fornecemos um esboço geral de métodos quantitativos de microanálise para estimar as ocupações do local de impurezas e seus estados químicos, aproveitando fenômenos de canalização eletrônica sob condições de agitação de raios-elétron incidentes, que extraem informações confiáveis de espécies minoritárias, elementos de luz, vagas de oxigênio e outros defeitos point/line/planar.

Análise quantitativa do local atômico de defeitos funcionais/pontos em materiais cristalinos por Microanálise Aprimorada por Canalização eletrônica

Aqui, apresentamos um protocolo para preparação de amostras criogênicas e transferência de cristais para a estação final de vácuo na linha de luz I23 na Diamond Light Source, para experimentos de cristalografia de raios-X de comprimento de onda longa.

Protocolo de preparação e transferência de amostras para cristalografia de comprimento de onda longa no vácuo na linha de luz I23 na Fonte de Luz de Diamante

A espectrometria de mobilidade de íons (IMS) é um complemento interessante à espectrometria de massa para a caracterização de biomoléculas, notadamente por ser sensível ao isomerismo. Este protocolo descreve um experimento tandem IMS (IMS/IMS), que permite o isolamento de uma molécula e a geração dos perfis de mobilidade de seus fragmentos.

Usando um espectrômetro de mobilidade de íons cíclicos para experimentos de mobilidade de íons tandem

Este artigo compara diretamente os contrastes de resolução, sensibilidade e imagem da dispersão estimulada de Raman (SRS) e da dispersão coerente anti-Stokes Raman (CARS) integrada à mesma plataforma de microscópio. Os resultados mostram que o CARS tem uma melhor resolução espacial, o SRS dá melhores contrastes e resolução espectral, e ambos os métodos têm sensibilidade semelhante.

Comparação direta da dispersão de Raman estimulada hiperespectral e microscopia de dispersão de Raman coerente para imagem química

Aqui, usamos um estabilizante polimérico para preparar suspensões metal-orgânicas (MOF) que exibem dispersão marcadamente diminuída em seus espectros de absorção no estado fundamental e transitório. Com essas suspensões de MOF, o protocolo fornece várias diretrizes para caracterizar os MOFs espectroscopicamente para produzir dados interpretáveis.

Um Guia Técnico para a Realização de Medições Espectroscópicas em Estruturas Metal-Orgânicas

Aprenda a técnica SIVQ-LCM para microdissecção a laser de tecidos com análise de imagem espacialmente invariante. Este método acelera a identificação e isolamento preciso de células para análise molecular em pesquisa biomédica.

Protocolo SIVQ-LCM para o Instrumento ArcturusXT

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