Name: Rápida identificação de bactérias gram-negativas de Sangue Cultura Caldo Usando MALDI-TOF Espectrometria de Massa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 29 s
Description: Aprenda a identificar rapidamente bactérias gram-negativas diretamente de caldo de hemocultura usando espectrometria de massa MALDI-TOF. Este método acelera o diagnóstico de infecções de corrente sanguínea com alta concordância.

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<html> 1. Sangue Cultura Caldos Bandeira como &quot;positiva&quot; <ol><li> Retire a garrafa de hemocultura sinalizou a partir do contínuo monitoramento do gabinete de incubação e coloque-o em uma cabine de segurança biológica. Nota: Os frascos podem conter microorganismos perigosos e precauções universais precisam ser seguidas. Devido ao risco de aerossóis infecciosos em amostragem, todos os procedimentos de amostragem deve ser realizada em um Biossegurança Classe II câmara de fluxo laminar. </li></ol> 2. Gram Stain é preparado <ol><li> Prepare uma coloração de Gram do caldo de cultura de sangue sinalizada conforme protocolos institucionais locais. Nota: Quando organismos Gram negativos são identificados em microscopia o caldo de cultura do sangue é processada de acordo com o seguinte método. Quando os organismos Gram-positivas são identificadas, um método molecular alternativa visando a identificação genética e marcadores de resistência é aplicada ao caldo (não abordados neste artigo) 13. </li></ol>e &quot;&gt; 3. Transferência de Cultura de sangue sinalizadas Caldo de um tubo de separação do soro <ol><li> Misture suavemente o frasco de cultura de sangue invertendo 2-3x. </li><li> Dentro da cabine de segurança biológica anexar uma seringa de 10 ml para um dispositivo de transferência de sangue de segurança. </li><li> Anexar o dispositivo de transferência de sangue para o frasco de cultura de sangue e retirar 5 ml de caldo dentro da seringa. Transferir o caldo BC aspirado para um tubo de separação de soro. </li></ol> 4. Concentração de Sangue cultura Caldo <ol><li> Centrifuga-se o tubo de separação de soro a 1250 x g durante 15 min, que remove um grande volume de células vermelhas do sangue. </li><li> Aspirar e desprezar o sobrenadante utilizando uma pipeta de transferência estéril tendo o cuidado de deixar cerca de 1 ml de creme leucocitário imediatamente acima da interface gel / fluido. Nota: As garrafas aeróbias mostram uma clara separação das células vermelhas do sangue para o fundo do tubo com a interface gel / fluido aparecendo uma cor branca opaca. Em contraste, quandoaplicado ao caldo de cultura do sangue anaeróbio lítico a interface gel / fluido aparece como uma cor vermelho escuro, devido aos componentes de glóbulos vermelhos lisados ​​permanecendo suspensas no sobrenadante. </li></ol> 5. Repita os passos de lavagem Centrifugação <ol><li> Agitar suavemente as últimas 1 ml de buffy coat fluido acima da interface de gel com uma pipeta estéril e então transferir todo o volume para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifuga-se o tubo de novo a 288 xg durante 30 seg. </li><li> Transferir o sobrenadante utilizando uma pipeta de 1 ml descartável de plástico de transferência para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 mL e rejeitar o tubo com o sedimento. Nota: É essencial nesta fase que seja tomado cuidado para evitar a transferência do sedimento. Isto é particularmente importante para um espécime a ser processado a partir da garrafa BC anaeróbico como o sobrenadante permanece pigmentado e o sedimento nem sempre é vista claramente. </li></ol> 6. Lise de células residuais </p&gt; <ol><li> Centrifugar as amostras a 18.407 xg durante 1 min e, em seguida, aspirado (e descarte) do sobrenadante utilizando uma pipeta fina de transferência de ponta para deixar o mínimo de líquido residual quanto possível, sem perturbar o sedimento. </li><li> Ressuspender o sedimento residual em 1 ml de DNAse e RNAse estéril livre de água por pipetagem cima e para baixo. Nota: Alguns autores descreveram o uso de soluções de álcool em vez de água estéril para ressuspender o sedimento que torna as bactérias não-viáveis. </li><li> Centrifugar a solução ressuspensas a 18.407 xg durante 1 min. </li></ol> 7. Extração de Proteínas de Bactérias <ol><li> Aspirar e desprezar o sobrenadante, novamente por meio de aspiração com uma pipeta de ponta fina assegurar que tanto líquido quanto possível seja removida. </li><li> Ressuspender o sedimento em 10 mL de ácido fórmico (70% v / v). Nota: O ácido fórmico pode afetar o corpo, se for inalado ou se entrar em contacto com a pele. Ao preparar ou manipular soluções é recommended que o pessoal usar um gabinete de fumo, além de equipamentos de proteção individual. </li><li> Misturar bem utilizando a pipeta para assegurar uma solução homogénea ressuspensas. Com a ponta da pipeta para perturbar fisicamente o sedimento pode ser necessário para assegurar uma solução mais homogénea. </li></ol> 8. Preparação de MALDI-TOF-alvo Placa <ol><li> Inocular um prato limpo alvo de MALDI-TOF com 2 mL da suspensão preparada por local alvo. Prepare três sítios-alvo para cada amostra para superar o problema ocasional de não lê. </li><li> Permitir que a placa-alvo MALDI-TOF para secar. A taxa de secagem pode ser aumentada colocando o prato na extremidade do exaustor de fumos para maximizar o fluxo de ar ao longo da placa. </li><li> Overlay cada local seco com 1 ul da solução de matriz (10 mg / ml de ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (HCCA), 50% de acetonitrilo, ácido trifluoroacético a 2,5%). Nota: solução de matriz pode afectar o corpo se inalada ou se entra em Contact com a pele. Ao preparar ou manipular soluções recomenda-se que o pessoal usar um gabinete de fumo, além de equipamentos de proteção individual. </li><li> Permitir que a placa alvo de MALDI-TOF para secar sobre a extremidade da câmara de exaustão tal como descrito acima. Certifique-se de uma preparação homogênea preenche cada um dos pontos de destino na placa. </li></ol> 9. Lugar MALDI-TOF-alvo Placa para o Espectrômetro de Massa <ol><li> Insira a placa-alvo MALDI-TOF para espectrômetro de massa MALDI-TOF. Verifique se a placa está sentado nivelado com as placas de mola. Nota: não insira a placa alvo até que todos os pontos-alvo estão secos. </li><li> Verifique se a borracha de vedação está limpa de fiapos, poeira e cabelo para permitir que as condições de vácuo exigidas pode ser criado. </li><li> Feche a tampa fase MALDI-TOF e pressione o botão &quot;in / out&quot; na parte da frente do instrumento. A tampa agora irá bloquear e permitir que o vácuo necessário para ser criado. </li></ol> 10. MALDI-TOF MS Spectra Aquisição <ol><li> Abra o MALDI Biotipagem e software FlexControl. </li><li> Dentro do software Typing selecione &quot;nova classificação&quot; no menu suspenso chamado &quot;arquivo&quot;. Nomeie o projeto e em seguida, selecione &quot;novo&quot;. Selecione &quot;Next&quot; para concluir a instalação do software de digitação. </li><li> Dentro da janela do software de Controle identificar o gráfico na tela da placa-alvo. Destaque os pontos-alvo MALDI-TOF que estão em uso, movendo o mouse sobre os pontos inoculados, mantendo pressionado o botão esquerdo do mouse. </li><li> Use o botão direito do mouse para clicar em qualquer lugar nas posições de destino selecionadas e, em seguida, selecione &quot;adicionar Analitos&quot; a partir do menu suspenso. </li><li> Adicionar hemocultivos detalhes de identificação para a coluna &quot;ID&quot; para cada um dos pontos de destino e clique em &quot;next&quot; quando terminar. </li><li> Selecione a opção &quot;taxonomia&quot; banco de dados espectros comercial e selecione &quot;Avançar&quot;. Nota: Labotórios pode utilizar adicional in-house ou bases de dados comerciais para aumentar o número de espectros de referência. </li><li> Clique em &quot;Finish&quot; e MALDI-TOF MS começará gerar espectros. Nota: As configurações de MALDI-TOF foram conforme as definições do fabricante (modo linear positivo, 60 freqüências de laser Hz, 20 kV de tensão de aceleração, 16,7 kV de tensão IS2, 170 ns de atraso extração e 2,000-20,137 faixa m / z). </li><li> Se o software de controlo de MALDI não permite gerar picos, aquisição manual dos espectros podem ser realizados (método não descrito). </li></ol> 11. Análise Pós Interpretação de MALDI-TOF MS Scores <ol><li> Uma vez que os espectros são adquiridos e análise estiver concluída, selecione o botão &quot;+&quot; ao lado de identificação das espécies sobre o software de digitação para expandir a lista de identificação para cada alvo. </li><li> Estude os top 5 identificações, observando se o top 5 são semelhantes. Discordantes top 5 gêneros com pontuação ≥ 1,7 do mesmo alvolocal levantou a possibilidade de caldos mistos. Nota: tecnologia MALDI-TOF tem pouca sensibilidade para a detecção de caldos mistos. Por exemplo, quando um caldo contém espécies mista uma pontuação elevada confiança pode ser identificado por apenas uma das espécies mistas. </li><li> Quando uma pontuação ≥ 2,0 é anotado para o maior jogo em um local de destino, informar a espécie. </li><li> Quando a maior pontuação em um ponto alvo é ≥ 1,7, mas &lt;2,0, informe apenas os gêneros. Se os critérios adicionais dos top 5 identificações são concordantes, em seguida, informar ao nível de espécie. </li></ol> 12. Remoção de MALDI-TOF-alvo Placa <ol><li> Quando todos os espectros são de imprensa completo o botão &quot;in / out&quot; na máquina MALDI-TOF. </li><li> Abra o MALDI-TOF placa-alvo recipiente e retire a placa de alvo MALDI-TOF. </li><li> Se estiver usando uma placa-alvo MALDI-TOF reutilizável, limpar todos os pontos de destino usando álcool e armazenar a placa de MALDI-TOF na RT, uma vez que está limpa e seca. </li></ol>

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<li>Novel,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((improved+sample+preparation+for+rapid%2C+direct+identification+from+positive+blood+cultures+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+%28MALDI-TOF%29+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">improved sample preparation for rapid, direct identification from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry.</a> J. Mol. Diagn. 13 (6), 701-706 (2011).</li>
<li>Fothergill, A., Kasinathan, V., Hyman, J., Walsh, J., Drake, T., Wang, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Identification+of+Bacteria+and+Yeasts+from+Positive-Blood-Culture+Bottles+by+Using+a+Lysis-Filtration+Method+and+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization-Time+of+Flight+Mass+Spectrum+Analysis+with+the+SARAMIS+Database%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Identification of Bacteria and Yeasts from Positive-Blood-Culture Bottles by Using a Lysis-Filtration Method and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrum Analysis with the SARAMIS Database.</a> J. Clin. Microbiol. 51 (3), 805-809 (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

É importante quando se aplica MALDI-TOF MS para caldo de cultura de sangue que as etapas de pós centrifugação são realizados com o cuidado suficiente para não remixar os componentes separados. É particularmente importante para remover os constituintes de culturas de sangue e as proteínas celulares humanas, incluindo a hemoglobina, o que pode produzir picos interferindo com o espectro de MALDI-TOF. Embora MS fabrica recomendo cortar de pontuação ≥ 2,0 para as espécies e ≥ 1,7 para identificaç...

Os pacientes com infecção de corrente sanguínea (BSI), devido a bactérias continuam a ter alta taxa de mortalidade intra-hospitalar, que vão 6-48% 1. A entrega de antibiótico empírico adequado promove a sobrevivência e no subgrupo de pacientes com sepse grave, a cada hora de atraso para a terapêutica adequada se relaciona à diminuição da sobrevivência de 2,3. Assim, um objectivo-chave do laboratório clínico é detectar rapidamente, identificar e comunicar a presença de bactérias em hemoculturas para informar as decisões clínicas. Tem sido demonstrado que o laboratório microbiológico tem a maior influência sobre a terapia antimicrobiana no momento de relatar a coloração de Gram e 4 recentemente, um estudo de observação demonstraram que o tempo de dessorção a laser assistida por matriz / ionização de voo de espectrometria de massa (MALDI-TOF MS) realizado diretamente em caldos de cultura de sangue influenciar a prescrição em mais de um terço da BSI causada por bactérias Gram negativas 5. 6,7. A tecnologia está agora bem estabelecida e tem sido integrado em muitos laboratórios para a identificação rápida e precisa dos microorganismos isolados em 6,8 meios sólidos. A aplicação direta de MALDI-TOF MS para hemocultura (BC) caldo que sinalizaram &quot;positivo&quot; para microorganismos apela para os clínicos e gestores de laboratório por causa do potencial para obter a identificação precoce de microorganismos com baixo custo. A utilidade clínica da aplicação directa de MALDI-TOF MS para caldo de cultura de sangue tem sido limitada pela ampla gama de sensibilidades observadas quando comparado com os métodos baseados cultura fenotípica padrão de identificação, com relatos de uma identificação bem sucedida de bactérias Gram-negativas variam 47-98,9 9-11%. A variação na sensibilidade provávelrelaciona-se com a composição BC caldo, a concentração bacteriana inicial, a variação dos métodos de preparação da amostra, bem como a gama de organismos gram-negativos encontrados em populações de estudo 9. Em comparação com estes outros protocolos publicados pelo método aqui apresentado evita a utilização de etanol, cloreto de amónio ou (não-matriz) acetonitrilo adicional. Como resultado, o pellet bacteriano permanecerá viável (até o ponto de extração de proteínas) permitindo potenciais métodos de análise fenotípica de susceptibilidade para ser aplicado diretamente a estes organismos em caldo. Além disso, o método apresentado tem sido mostrado a ser barato, fiável e rápida, com a identificação de bactérias disponíveis dentro de 25 min dos resultados de cultura de sangue Gram mancha, com o mínimo &#39;mãos no tempo 12. Este método é um protocolo simples em casa spin-lise utilizando extração ácido fórmico aplicados diretamente para caldos de cultura de sangue positivos para identificar Gram negativo bacteria com tecnologia de MALDI-TOF MS.

<table><tbody><tr><td>BACTEC Plus Aeróbica / F Médio</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, EUA</td><td>442192</td><td></td></tr><tr><td>BACTEC Lítico/10 Anaeróbico/F Médio</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, EUA</td><td>442265</td><td></td></tr><tr><td>BACTEC Peds Plus Médio</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, EUA</td><td>442194</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer - Dispositivo de transferência de sangue</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>364880</td><td>Dispositivo de amostragem de uso único reduzindo o risco de ferimentos por picada de agulha</td></tr><tr><td>Vacutainer SST 5,0 ml, Advance plus</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, EUA</td><td>367954</td><td>Seringa de tubo de separação de soro</td></tr><tr><td>10 ml</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, EUA</td><td>302143</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferência</td><td>Samco, EUA</td><td>222-20S</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferência (ponta fina)</td><td>Samco, EUA</td><td>232-20S</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga (2,0 ml)</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemanha</td><td>0030.120.094</td><td></td></tr><tr><td>Água estéril (livre de DNAse e RNAse)</td><td>Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, EUA</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>Solução de matriz&nbsp;</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha,</td><td>285074</td><td>10 mg/ml de ácido &alfa;-ciano-4-hidroxicinâmico, 50% de acetonitrila, 2,5% de ácido trifluoroacético</td></tr><tr><td>Microflex de bancada LT MALDI-TOF MS</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha</td><td></td><td>Utilizando os softwares BioTyper 3.1 (Build 65) e FlexControl 3.3 (Build 99)</td></tr></tbody></table>

rápida identificação de bactérias gram-negativas de sangue cultura caldo usando maldi-tof espectrometria de massa

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Um papel importante do laboratório de microbiologia clínica é proporcionar a rápida identificação de bactérias que causam infecção na corrente sanguínea. Identificação tradicional exige a sub-cultura do sinalizou caldo de cultura de sangue com a identificação disponível somente depois colônias em agar sólido amadureceram. MALDI-TOF MS é um método fiável, rápido para a identificação da maioria das bactérias clinicamente relevantes, quando aplicado para colónias em meios sólidos. A aplicação de MALDI-TOF MS diretamente ao caldo de cultura de sangue é uma abordagem atraente, pois tem potencial para acelerar a identificação de espécies de bactérias e melhorar a gestão clínica. No entanto, um problema importante para superar é a remoção de pré-análise de interferentes resinas, proteínas e hemoglobina contidos em amostras de cultura do sangue, que, se não for removido, interferem com os espectros de MS e pode resultar em pontuações suficientes ou baixos de identificação de discriminação. Além disso, é necessário concentrar a bactériaia para desenvolver espectros de qualidade suficiente. O método apresentado descreve a concentração, purificação e extração de bactérias Gram negativas que permitem a identificação precoce de bactérias a partir de um caldo de cultura de sangue sinalizado.

A MALDI-TOF MS espectros gerados são comparados com a base de dados de espectros de referência integrada. A pontuação logarítmica é atribuído pela confiança do jogo entre o isolado de teste eo banco de dados de referência isola, com a recomendação de uma pontuação ≥ 1.7 necessário para provável identificação ao nível de gêneros (Figura 1) e ≥ 2.0 para provável identificação de espécies (Figura 2). Comunicar ao nível de espécie, quando a pontuação ≥ 1,7 e os 5 primeiros identificações co...

A aplicação de matriz assistida por laser de dessorção / ionização por tempo de voo (MALDI-TOF), espectrometria de massa (MS) directamente ao caldo de cultura do sangue acelera a identificação de bactérias. O método apresentado é um método rápido e fiável para a identificação de bactérias Gram-negativas directamente do caldo de cultura do sangue.

Rápida identificação de bactérias gram-negativas de Sangue Cultura Caldo Usando MALDI-TOF Espectrometria de Massa

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar organismos gram-negativos diretamente de caldo de cultura sanguínea utilizando a tecnologia maloff. Para isso, cinco mililitros de um caldo de cultura sanguínea positivo são transferidos para um tubo com separador sérico e centrifugados. Após a centrifugação, a camada líquida contendo as bactérias é transferida para um tubo de microcentrífuga e então centrifugada em baixa velocidade. O sobrenadante é então transferido para um novo tubo de microcentrífuga e centrifugado em alta velocidade.O pellet resultante é ressuspenso em ácido fórmico e analisado por MALDI para identificar as espécies bacterianas presentes. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o cultivo tradicional, é a identificação mais precoce de bactérias gram-negativas. As implicações desta técnica estendem-se à microbiologia clínica, pois um diagnóstico de bacteriemia influencia a escolha do antimicrobiano prescrito pelo clínico.Demonstrando este procedimento estará Leonardo Bascu, que é um dos técnicos do nosso departamento que regularmente realiza este procedimento. Frascos de hemocultura aeróbicos ou anaeróbicos coletados a critério da equipe clínica, geralmente em casos de doença febril, são incubados em máquinas automatizadas que monitoram continuamente o crescimento bacteriano. Quando há evidência de crescimento em um frasco de hemocultura, a máquina identificará o frasco sinalizado.Inicie este procedimento removendo o frasco de hemocultura sinalizado do incubador. Coloque-o em uma cabine de segurança biológica. Prepare uma coloração de Gram a partir do caldo de hemocultura sinalizado de acordo com os protocolos institucionais locais e examine-o por microscopia, caso sejam identificados organismos gram-negativos.Processe o caldo de cultura seguindo o método descrito aqui. Se organismos gram-positivos forem identificados, um método molecular rápido alternativo poderá ser utilizado. Inverta o frasco de hemocultura duas a três vezes para homogeneizar.Em seguida, na cabine de segurança biológica, acople uma seringa de 10 mililitros a um dispositivo de transferência sanguínea de segurança. Conecte o dispositivo de transferência sanguínea ao frasco de hemocultura e retire cinco mililitros do caldo para dentro da seringa de transferência.Aspire o caldo da cultura sanguínea para um tubo com separador de soro e centrifugue a 1.250 × g durante 15 minutos para remover os glóbulos vermelhos. Após a centrifugação, a cultura sanguínea proveniente dos frascos aeróbicos mostra uma separação nítida dos glóbulos vermelhos na parte inferior do tubo, com a interface gel-fluido apresentando-se como uma cor branca opaca. Em contraste, a cultura sanguínea proveniente do frasco anaeróbio lítico apresenta uma cor vermelha intensa na interface gel-fluido.Como os componentes das hemácias lisadas permanecem suspensos no sobrenadante em qualquer tipo de aspirado, descarte o sobrenadante utilizando uma pipeta de transferência estéril, tomando cuidado para deixar aproximadamente um mililitro da camada de buffy coat imediatamente acima da interface com o gel. Em seguida, usando uma pipeta estéril, misture suavemente o último mililitro do fluido de buffy coat acima da interface do gel e, então, transfira todo o volume para um tubo de microcentrífuga. Centrifugue o novo tubo a 288 vezes G por 30 segundos, utilizando uma pipeta plástica descartável de um mililitro.Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga e descarte o tubo com o pellet. É fundamental nesta etapa evitar a transferência do pellet. Isso é particularmente importante em espécimes de hemocultura anaeróbica porque o sobrenadante permanece pigmentado e o pellet nem sempre é claramente visível.Centrifugue a amostra a 18.407 × g durante um minuto e, em seguida, utilizando uma pipeta de ponta fina, aspire e descarte o sobrenadante, deixando o menor volume residual possível sem perturbar o pellet. Adicione um mililitro de água estéril livre de DNA e RNA e pipete para cima e para baixo para ressuspender o pellet residual. Centrifugue a solução ressuspensa a 18.407 × g durante um minuto.Após a centrifugação, use uma pipeta de ponta fina para aspirar e descartar o sobrenadante. Novamente, tomando cuidado para remover o máximo de líquido possível. Resuspenda o pellet em 10 microlitros de ácido fórmico 70%.Para pellets grandes, pode ser necessário aumentar o volume de ácido fórmico em 50 a 100%. Com o auxílio da pipeta, misture bem para garantir uma solução homogênea; se necessário, use a ponteira da pipeta para romper fisicamente o pellet. A solução resultante contém bactérias concentradas isoladas do caldo de hemocultura, relativamente livre de células humanas e de resinas da garrafa de hemocultura. Usando uma pipeta, inocular uma placa MALDI TOF limpa com dois microlitros da suspensão preparada por localização na placa. Prepare três locais na placa para cada amostra para contornar eventuais problemas de leituras falhas.Coloque a placa na borda da capela para maximizar o fluxo de ar sobre ela, de modo que seque rapidamente; em seguida, cubra cada ponto seco com um microlitro de solução matriz. Deixe a placa alvo para MALDI secar na borda da capela. Como antes, assegure-se de que a preparação seja homogênea, preenchendo cada um dos pontos-alvo na placa.Insira a placa-alvo no espectrômetro de massas maloff. Certifique-se de que a placa esteja bem ajustada às placas com mola. Não insira a placa-alvo até que todos os pontos-alvo estejam secos.Verifique a vedação de borracha para garantir que esteja livre de fiapos, poeira e cabelos. Isso permitirá que as condições de vácuo necessárias sejam criadas. Em seguida, feche a tampa do estágio maloff e pressione o botão entrada-saída na frente do instrumento.A tampa será travada e um vácuo será criado. Abra o software de controle do MALDI-TOF e o software flex control dentro do software do TOF. No menu suspenso denominado arquivo, selecione nova classificação, nomeie o projeto e, em seguida, selecione novo.Selecione o próximo. Para concluir a configuração na janela do software de controle flex, identifique o gráfico na tela da placa-alvo mantendo pressionado o botão esquerdo do mouse. Mova o mouse sobre os pontos inoculados e destaque os pontos-alvo que estão em uso.Clique com o botão direito do mouse em qualquer local das posições-alvo selecionadas e, em seguida, selecione adicionar analitos no menu suspenso. Para cada um dos pontos-alvo, adicione os detalhes de identificação do cultivo de sangue na coluna ID e clique em próximo. Ao concluir, selecione a base de dados de espectros de Taxonomia Comercial e clique em próximo; os laboratórios podem utilizar bases de dados adicionais internas ou comerciais para aumentar o número de espectros de referência, clique em finalizar e o MALDI TOF MS iniciará a geração de espectros.Ocasionalmente, pontuações mais altas no MALDI-TOF podem ser obtidas utilizando a aquisição manual de espectros MALDI-TOF no software Flex Control. Após os espectros serem adquiridos e a análise for concluída no software de tipagem, selecione o botão de adição ao lado da identificação de espécies. Para expandir a lista de identificações para cada alvo, examine as cinco principais identificações, observando se as cinco primeiras são semelhantes.Se os cinco principais gêneros apresentarem discordância com escores maiores ou iguais a 1,7 para o mesmo ponto-alvo, pode estar presente uma mistura de espécies. Observe que a tecnologia OV possui baixa sensibilidade para detecção de espécies mistas. Quando for observado um escore maior ou igual a 2,0 para a melhor correspondência em um ponto-alvo, relatar a espécie; quando o escore mais alto em um ponto-alvo for maior ou igual a 1,7, mas menor que 2,0, relatar o gene.Somente se critérios adicionais das cinco identificações principais forem concordantes, informe no nível de espécie. Quando todos os espectros estiverem completos, pressione o botão entrada-saída no MALDI para a máquina, abra o compartimento da placa-alvo e remova a placa. Se estiver usando uma placa-alvo MALDI TOF reutilizável, utilize álcool para limpar todos os pontos-alvo e armazene a placa MALDI a temperatura ambiente assim que estiver limpa e seca para identificar bactérias gram-negativas a partir de caldo de hemocultura; ciclos de centrifugação e lavagem foram empregados para concentrar e isolar as bactérias, que foram então analisadas por espectrometria de massas MALDI TOF.Como descrito neste artigo em vídeo, aqui é mostrado o espectro gerado por MALDI TOF MS para Escherichia coli com um escore logarítmico de 1,86. À direita, estão as primeiras cinco correspondências identificadas pelo software de tipagem. Observe que a espécie é consistentemente relatada como Escherichia coli com um escore de 1,861.Como as cinco principais correspondências são E. coli, a identificação é considerada confiável até o nível de espécie. Os espectros gerados por MALDI-TOF MS para Pseudomonas aeruginosa são mostrados aqui. O escore logarítmico é de 2,216; à direita estão as cinco primeiras correspondências identificadas pelo software de tipagem.Observe que a espécie é consistentemente relatada como pseudomonas aerogen com um escore alto de 2,216. A identificação é considerada confiável até o nível de espécie. Os espectros gerados por MALDI-TOF MS para um caldo de cultura sanguínea mista contendo esia coli e SIO marsens são mostrados aqui à direita, sendo os cinco primeiros resultados correspondentes ao software de tipagem, que relata tanto Reiki coli quanto SIO marsan.Nos primeiros cinco espectros correspondentes. Este gene misto é identificado apenas em aproximadamente um terço das culturas mistas em caldo. Esta tabela resume os resultados previamente publicados do estudo de verificação deste método, no qual 91,8% dos caldos monomicrobianos alcançaram um escore maldi inferior a 1,7, com concordância de 100% e 97% para gênero e espécie, respectivamente.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como preparar um frasco de hemocultura para identificação utilizando MALDI-TOF. Ao seguir este método, podemos usar o mesmo pellet preparado para identificação bacteriana para preparar um inóculo mais padronizado para testes automatizados de suscetibilidade. Por exemplo, esta técnica permite que os laboratórios forneçam um diagnóstico precoce aos clínicos, com potencial impacto na conduta terapêutica.Não se esqueça de que trabalhar com frascos de hemocultura pode ser perigoso, e precauções, incluindo o uso de uma cabine de segurança biológica, devem sempre ser adotadas ao manipular frascos de hemocultura.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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subtipagem de<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Isolados Utilizando PhyloProteomics baseados em espectrometria de massa (MSPP)

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