Name: Imagens de células vivas de primários de ratos neonatos Cardiomyocytes Após Adenoviral e Transdução Lentivirus Usando confocal Spinning Disk Microscopia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Aprenda a realizar imagens de células vivas de cardiomiocitos primários de ratos neonatos após transdução lentiviral e adenoviral usando microscopia confocal de disco giratório. Este método permite observar dinâmicas celulares em tempo real.

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Gostaríamos de agradecer ao Dr. Alengo Nyamay'antu e à Dra. Ilse Timmerman por seus conselhos sobre embalagens lentivirais. Este trabalho é apoiado por uma Bolsa de Desenvolvimento de Cientistas da American Heart Association 10SDG4170137.

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Os autores não têm nada a divulgar.

Cardiomiócitos primários isolados de ratos recém-nascidos têm sido usados ​​para estudar as funções de cardiomiócitos in vitro. Este protocolo descreve um método para o isolamento de cardiomiócitos neonatais de filhotes de rato usando um método de digestão enzimática de dois passos, primeiro digestão com tripsina O / N a 4 ° C e, em seguida, colagenase purificada. Uma vantagem de se empregar o passo colagenase purificada é que o mesmo tipo de enzima é utilizado para todos os isolamentos. Assim, a qualidade e qu...

Cardiomiócitos neonatais de ratos primárias têm sido muito utilizados para investigar a função de cardiomiócitos in vitro 1. Eles são fáceis de isolar a partir de crias de ratos por vários métodos bem estabelecidos 2-4. O método mais comum emprega colagenase ou tripsina para digerir o tecido conjuntivo do coração antes do isolamento de células. Os investigadores também foram desenvolvidos métodos para isolar os cardiomiócitos de roedores adultos 5-8, bem como ratinhos neonatais 9,10. Este protocolo descreve um método para o isolamento de cardiomiócitos de crias de ratos recém-nascidos, empregando um procedimento de digestão com enzimas de duas etapas. A tripsina é usado pela primeira vez O / N a 4 ° C, e, em seguida, colagenase purificada a 37 ° C. A incubação do tecido do coração com tripsina O / N a 4 ° C reduz os passos necessários para colheita de células, em comparação com os métodos que utilizam as incubações sequenciais em uma solução de enzima quente 2. Além disso, através da utilização de co purificadallagenase em vez de enzimas em bruto, a variabilidade de lote para lote pode ser eliminada, proporcionando assim melhorada a reprodutibilidade. Estudos funcionais de uma proteína particular, muitas vezes empregue um sistema de expressão de proteína utilizando um adenovírus 11-13 e / ou um lentivírus 14-16. [NOTA PREVENTIVAS] A produção e manipulação viral deve ser realizada de acordo com as directrizes de NIH. O adenovirus não se integra no genoma do hospedeiro. Tem uma elevada eficiência de transdução na maioria dos tipos de células, incluindo as células que se dividem e células que não se dividem, como bem como células primárias e as linhas de células estabelecidas. Isso faz com que o adenovírus de um vector de confiança para a expressão do gene. Níveis elevados da proteína codificada pelo vector de adenovírus desenvolver dentro de 48 horas a seguir a transdução, e pode durar várias semanas 17. No entanto, uma desvantagem do uso de um adenovírus para expressão de proteína é que o desenvolvimento de um ade recombinanteadenovírus é complicado e demorado. Este inconveniente explica em parte por que muitos pesquisadores têm se voltando para lentivírus para a expressão do gene recombinante. Ao contrário de construções de adenovírus, gerando uma construção lentiviral é rápido e fácil. Embora lentivírus geralmente têm eficiências inferiores de transdução do que os adenovírus, tanto em células em divisão e que não se dividem, eles se integram no genoma do hospedeiro. Consequentemente, a expressão do gene transduzido é mais estável para os lentivírus do que para os adenovírus. Devido aos avanços tecnológicos no campo da microscopia, é muito mais fácil de capturar imagens de células vivas de células que expressam proteínas recombinantes. Isto é válido mesmo em velocidades de taxa de vídeo de aquisição. Isto permite que o investigador como para determinar alterações específicas na proteína de interesse funcionalmente impacto na célula em tempo real. O microscópio confocal disco giratório tem várias características que o tornam uma técnica ideal para livimagem e celular 18,19. O disco giratório Yokogawa permite muito mais rápida aquisição de imagem, e, ao mesmo tempo, utilizando muito menos energia do laser de microscopia confocal de varredura ponto. Ambas estas características especiais são devidos ao disco giratório, que contém várias perfurações confocal através do qual o laser passa simultaneamente com as amostras. Durante a aquisição, o próprio disco gira rapidamente e continuamente 18-20. Ao utilizar o sistema de focagem do microscópio, o foco é mantida estável durante longos períodos de tempo. Isso permite que os pesquisadores para captar imagens de células vivas bem focados. Imagens adquiridas são reproduzidas como um arquivo de filme. As imagens são analisadas usando o software de análise de imagem como o ImageJ 21,22, FIJI 23, ou outro software disponível comercialmente.

<table><tbody><tr><td>1 Tesoura para decapitação</td><td>WPI</td><td>501749</td><td>Autoclave antes do uso</td></tr><tr><td>1 Tesoura fina para isolamento do coração e corte</td><td>WPI</td><td>14393</td><td>Autoclave antes do uso</td></tr><tr><td>2 Pinças finas (Dumont No. 5)</td><td>Sigma</td><td>F6521</td><td>Autoclave antes do uso</td></tr><tr><td>3 Pratos de plástico esterilizados de 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Para isolamento cardíaco</td></tr><tr><td>3,5 cm Fundo de vidro placas de cultura</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>Para o revestimento final de cardiomiócitos para futuras imagens de células vivas. Os micro-pratos da ibidi são uma alternativa aceitável.</td></tr><tr><td>Pratos de cultura com fundo de vidro de 3,5 cm</td><td>MatTek</td><td>P35G-0.17-14-C</td><td>Para TIRF ou imagem de alta resolução</td></tr><tr><td>Solução de etanol, 70% (v/v) em água</td><td>Sigma</td><td>E7148</td><td></td></tr><tr><td>2% Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>1 Prato de plástico esterilizado de 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Para tripsinização</td></tr><tr><td>Folha de alumínio</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7543</td><td></td></tr><tr><td>Dois pratos de cultura de células de plástico de 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Para seleção</td></tr><tr><td>Autopipeta</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-300</td><td>Para trituração</td></tr><tr><td>Contador</td><td></td><td></td><td></td>de células</tr><tr><td>Celómetro, contador de células automatizado</td><td>nexcelom</td><td></td><td>Para verificar e contar células</td></tr><tr><td>Microscópio e hematocitómetro</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Para verificar e contar células</td></tr><tr><td>Solução azul de tripano, 0,4%</td> <td>invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubadora</td><td>Sanyo</td><td>MCO-19AIC</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora orbital agitadora</td><td>Sigma</td><td>Z673129</td><td>Para agitar o tecido cardíaco com colagenase a 37 &deg; C a 170-200 rpm</td></tr><tr><td>10 mg/ml BrdU solução</td><td>BD Pharmingen</td><td>550891</td><td></td></tr><tr><td>DMEM,</td><td>invitrogen</td> com alto teor de glicose <td>41965039</td><td>Misture o meio conforme indicado no protocolo e aqueça antes do uso</td></tr><tr><td>MEM</td><td>invitrogen</td><td>31095029</td><td>Misture o meio conforme indicado no protocolo e aqueça antes do uso</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml)&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Seção 2 Transdução</td><td></td><td></td><td></td>lentiviral</tr><tr><td>3 Plasmídeos</td><td></td><td></td><td></td>de embalagem</tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene</td><td>12251</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>O vetor de transferência lentiviral, pLVX-IRES-Puro</td><td>Clontech</td><td>632183</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (meio sem soro)</td> <td>invitrogen</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Reagente</td><td></td><td></td><td></td>de transfecção</tr><tr><td>polietilenoimina" Max", (MW 40.000) - PEI linear de alta potência (equivalente a Mw 25.000 na forma de base livre)&nbsp;</td><td>Policiências</td><td>24765-2</td><td>Pode ser substituído por X-tremeGENE 9 da Roche</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365779001</td><td>substituto do PEI como reagente de transfecção</td></tr><tr><td>Cloroquina</td><td>Sigma</td><td>C6628</td><td>Dissolver em água e fazer solução estoque 100 mM. A inibição da acidificação endossômica pode ser alcançada com 10-100 &mu; M Cloroquina.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Luer-Lok de 10 ml, BD esterilizada</td><td></td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; </td><td>Filtros Sigma</td><td>F8677</td><td>Use apenas filtros de acetato de celulose ou polietersulfona (PES) (baixa ligação às proteínas). Não use filtros de nitrocelulose. A nitrocelulose se liga às proteínas de superfície no envelope lentiviral e destrói o vírus.</td></tr><tr><td>Brometo de hexadimetrina</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>Dissolva em água e faça 8 mg / ml de solução estoque, depois filtre-a para esterilizar.</td></tr><tr><td>Polietilenoglicol 6.000</td><td>Sigma</td><td>81260</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Seção 3 Transdução</td><td></td><td></td><td></td>adenoviral</tr><tr><td>Células HEK 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Algumas placas de cultura de células de 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de 96 poços com tampa, fundo plano, cultura de tecidos, estéril</td><td>BD Falcon</td><td>353072</td><td>Para titulação</td></tr><tr><td>Pipeta multicanal, 10-100 &mu; l, 8 canais</td><td>eppendorf</td><td>3122 000.035</td><td></td></tr><tr><td>Seção 4 Imagem de</td><td></td><td></td><td></td>células</tr><tr><td>vivas Microspopy confocal de disco giratório</td><td>PerkinElmer</td><td>L7267000</td><td></td></tr><tr><td>Uma câmara com temperatura controlada</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Para manter a temperatura em 37 &deg; C</td></tr><tr><td>A CO2 sistema ambiental</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Opcional para manter a concentração ideal de CO2</td></tr> CO<tr><td>2 Meio independente, sem glutamina</td><td>invitrogen</td><td>18045-054&nbsp; &nbsp;</td><td>Para imagens de lapso de tempo de longa duração</td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta, HEPES, sem invitrogen vermelho de fenol</td><td></td><td>21063-029</td><td>Para imagens de lapso de tempo de longa duração</td></tr></tbody></table>

imagens de células vivas de primários de ratos neonatos cardiomyocytes após adenoviral e transdução lentivirus usando confocal spinning disk microscopia

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Cardiomiócitos primários de rato neonatal são úteis na investigação básica em cardiovascular in vitro, porque eles podem ser facilmente isolados em grande número em um único procedimento. Devido aos avanços na tecnologia de microscópio é relativamente fácil para capturar imagens de células vivas com a finalidade de investigar eventos celulares, em tempo real, com preocupação mínima sobre fototoxicidade para as células. Este protocolo descreve como tirar imagens timelapse células vivas de ratos primário cardiomiócitos neonatais usando um microscópio confocal disco giratório seguinte transdução lentiviral e adenovírus para modular as propriedades da célula. A aplicação de dois tipos diferentes de vírus facilita a alcançar um nível de taxas de transdução e de expressão apropriados para dois genes diferentes. Imagens de células vivas bem focado pode ser obtido usando o sistema de focagem automática do microscópio, que mantém o foco estável por longos períodos de tempo. Aplicando este método, as funções de engenheiro exogenamenteed proteínas expressas em células primárias de cultura pode ser analisado. Além disso, este sistema pode ser usado para examinar as funções de genes através do uso de siRNAs, bem como de moduladores químicos.

Para ilustrar a técnica, a codificação de EGFP lentivírus (reforçada proteína fluorescente verde) marcado com Cx43 (Connexin43) ou um Cx43 mutante 32 foi utilizado para expressar proteínas EGFP-marcado em células, e um adenovírus codificador FGFR1DN (receptor do factor de crescimento do fibroblasto 1 negativo dominante ) foi utilizado para fechar a sinalização do FGF-se na célula de 33-35. Três dias após o isolamento de cardiomiócitos, os cardiomiócitos foram isolados transduzidas com lentivírus, a...

Este protocolo descreve um método de imagem de células vivas usando cardiomiócitos neonatais primários de ratos após transdução lentiviral e adenoviral usando microscopia de disco giratório confocal. Isso permite observações detalhadas dos processos celulares em cardiomiócitos vivos.

Imagens de células vivas de primários de ratos neonatos Cardiomyocytes Após Adenoviral e Transdução Lentivirus Usando confocal Spinning Disk Microscopia

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens com lapso de tempo de cardiomiócitos neonatais primários de rato após transdução por lentivírus e adenovírus, utilizando microscopia confocal de disco giratório. Isso é realizado primeiramente coletando cardiomiócitos de filhotes de rato e semeando as células em placas com fundo de vidro. O próximo passo é realizar a transdução da Conexina 43 marcada com EGFP por lentivírus, seguida pela transdução do fgfr dominante negativo, um por adenovírus, nos cardiomiócitos.O passo final é obter imagens de lapso de tempo usando microscopia confocal de disco giratório. Em última análise, pode-se obter um filme reproduzido a partir das imagens de lapso de tempo adquiridas. Isso mostra a distribuição da proteína marcada com EGFP expressa por genes lentivirais em cardiomiócitos primários vivos sob condições celulares alteradas por uma proteína expressa por adenovírus, dominante negativa para fgfr1.Uma das principais vantagens desta técnica é que é possível realizar imagens de lapso de tempo em células vivas utilizando um microscópio confocal de disco giratório e uma condição desejada após a expressão gênica induzida por adenovírus ou posteriorme

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Biology

Biologia

Adulto miócitos cardíacos são células primárias que podem ser isoladas de corações de animais e cultivados por vários dias. Dentro deste período a cultura de transferência de gene adenoviral podem ser usadas para expressar biossensores geneticamente codificado (GEBS) ou proteínas de fusão fluorescente. Ambas as abordagens permitem investigações celular por meio de microscopia confocal.

Isolamento e manipulação genética de adultos miócitos cardíacos for Imaging Confocal

Aqui vamos desenvolver as ferramentas necessárias...

Ex vivo imagens ao vivo de divisões celulares simples no mouse neuroepithelium

Culturas rato cardiomiócitos primários são uma das ferramentas fundamentais para a investigação da organização e função miofibrilar. O protocolo a seguir descreve o isolamento e cultura de cardiomiócitos primários de corações neonatais do mouse. As culturas de cardiomiócitos resultantes podem ser subsequentemente utilizados para uma variedade de biomecânicas, ensaios bioquímicos e celulares biológica.

Isolamento e Cultura de Neonatais rato Cardiomyocytes

O isolamento de cardiomiócitos de ratos neonatais é um procedimento demorado e imprevisível.  Este estudo descreve métodos de criopreservação e descongelamento de cardiomiócitos de ratos neonatais que permitem o uso mais eficiente das células. Os NRCMs descongelados podem ser usados para vários experimentos sem a necessidade de realizar isolamentos a cada vez.

O isolamento e criopreservação de Neonatais Rato Cardiomyocytes

Este protocolo descreve um método passo a passo para o isolamento reprodutível e cultura de longo prazo de cardiomiócitos de camundongos adultos com alto rendimento, pureza e viabilidade.

Isolamento, cultura e Transdução de rato adulto Cardiomyocytes

Descrevemos um protocolo para obter imagens volumétricas de células marcadas com proteínas fluorescentes profundamente dentro de corações embrionários e pós-natais intactos. Utilizando métodos de limpeza de tecido em combinação com coloração de montagem inteira, células marcadas com proteína fluorescente única dentro de um coração embrionário ou pós-natal podem ser visualizadas com clareza e precisão.

Imagiologia Cleared embrionário e pós-natal Corações na resolução de célula única

Para distinguir a divisão celular das variações do ciclo celular em cardiomiócitos, apresentamos protocolos usando duas linhagens de camundongos transgênicos: camundongos transgênicos Myh6-H2B-mCh, para a identificação inequívoca de núcleos de cardiomiócitos, e camundongos CAG-eGFP-anilina, para distinguir a divisão celular das variações do ciclo celular.

Visualização de Variações do ciclo celular e Determinação de Nucleação no pós-natais Cardiomyocytes

Este manuscrito descreve um protocolo passo a passo para a geração e quantificação de diversos subtipos cardíacos reprogramados usando uma entrega mediada por retrovírus de Gata4, Hand2, Mef2c e Tbx5.

Avaliando cardiomiócitos subtipos Seguindo Reprogramação Fator de Transcrição mediada por embrionárias de camundongos Fibroblastos

Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento, transfecção e cultura de longo prazo de cardiomiócitos adultos de camundongos e ratos.

Isolamento, Transfecção e Cultura de Longo Prazo de Cardiomiócitos de Ratos Adultos e Ratos

Aqui, apresentamos um método para investigar morfogênese neurita em explantes de retina de camundongos pós-natal por microscopia confocal de lapso de tempo. Descrevemos uma abordagem para rotulagem e aquisição esparsa de tipos de células da retina e seus processos finos usando vetores de vírus associados a adeno recombinantes que expressam proteínas fluorescentes direcionadas à membrana de forma dependente de Cre.

Imagem de lapso de tempo da arborização neuronal usando rotulagem de vírus associado adeno esparsa de populações de células de retina geneticamente direcionadas

Um conjunto de protocolos são apresentados que descrevem a medida da função contrátil via detecção do comprimento do sarcômero juntamente com a medição transitória de cálcio (Ca2+) em miócitos isolados de ratos. A aplicação desta abordagem para estudos em modelos animais de insuficiência cardíaca também está incluída.

Análise da disfunção contrátil cardíaca e dos transientes de Ca2+ em miócitos de roedores

Aprenda a realizar imagens de células vivas de cardiomiocitos primários de ratos neonatos após transdução lentiviral e adenoviral usando microscopia confocal de disco giratório. Este método permite observar dinâmicas celulares em tempo real.

Imagens de células vivas de primários de ratos neonatos Cardiomyocytes Após Adenoviral e Transdução Lentivirus Usando confocal Spinning Disk Microscopia (Vídeo) | JoVE Journal

Imagens de células vivas de primários de ratos neonatos Cardiomyocytes Após Adenoviral e Transdução Lentivirus Usando confocal Spinning Disk Microscopia

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