Um Sistema de coração isolado para Grandes Modelos Animais
11 de junho de 2014
A maioria dos estudos envolvendo o aparelho de Langendorff usa modelos de pequenos animais devido ao aumento da complexidade dos sistemas para mamíferos maiores. Descrevemos um sistema de Langendorff para modelos animais de grande porte que permite o uso em uma variedade de espécies, incluindo humanos, e aquisição de dados relativamente fácil.
O objetivo geral deste procedimento é medir a função cardíaca de animais grandes em um circuito ex vivo. Isso é realizado primeiramente montando o aparelho de coração funcionando. No segundo passo, o sangue é lavado, reconstituído com solução salina normal e os eletrólitos são otimizados no passo final.
O coração é mantido em funcionamento, replicando parâmetros hemodinâmicos in vivo. Em última análise, um cateter de condutância inserido no ventrículo pode ser utilizado para obter medidas quantitativas da função ventricular. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o uso de modelos de animais pequenos, é que ela produz dados clinicamente relevantes, ao mesmo tempo que evita interferências imunológicas observadas com o transplante em animais de grande porte.
Para montar o aparelho de Langendorff, comece conectando o reservatório cardíaco ao reservatório de sangue com tubo de três oitavos de polegada, garantindo que o tubo passe por uma bomba de roletes. Em seguida, conecte o reservatório de sangue ao oxigenador aquecedor com mais tubo de três oitavos de polegada e, depois, conecte o oxigenador aquecedor a um conector em Y. Conecte um braço do conector em Y à bomba centrífuga.
Em seguida, conecte a bomba centrífuga a um segundo conector em Y para criar uma armadilha de bolhas e um meio de inserir o transdutor de pressão. Fixe um pedaço de tubo de três oitavos de polegada para prender uma válvula de hemostasia ao braço voltado para cima. Em seguida, fixe um pedaço de tubo de três oitavos de polegada ao braço voltado para baixo e conecte o outro braço do conector em Y à entrada da câmara de pré-carga.
Certifique-se de que este tubo passe pela segunda bomba de roletes. Conecte primeiro a linha de pré-carga à porção de saída da câmara de pré-carga. Isso será eventualmente conectado ao átrio esquerdo.
Conecte o excesso de tubo de três oitavos de polegada à saída desta câmara e, em seguida, conecte o tanque de oxigênio e o aparelho de aquecimento ao oxigenador aquecedor. Por fim, prenda com braçadeira a linha que vai do conector em Y até a câmara de pré-carga, pois esta linha não será utilizada até que o coração seja colocado em modo de funcionamento. Agora, ligue o aparelho de aquecimento do tanque de oxigênio, a bomba de roletes, conecte os dois reservatórios e a bomba centrífuga e lave o sangue de acordo com as instruções do fabricante.
Em seguida, reconstitua os glóbulos vermelhos lavados com soro fisiológico até a concentração de hematócrito desejada. Adicione o sangue diluído ao aparelho langor e verifique o hematócrito. Ajuste as velocidades das duas bombas para iniciar o fluxo sanguíneo pelo sistema, excluindo a câmara de pré-carga.
Verifique o pH e os eletrólitos da mistura sanguínea e ajuste-os até valores fisiológicos para a espécie utilizada, a fim de prevenir a entrada prejudicial de cálcio durante a reperfusão. Mantenha inicialmente o nível de cálcio no aparelho de langendorff entre 0,3 e 0,5 milimol por litro. Após calibrar o aparelho de langendorff, remova rapidamente um coração adequadamente repousado do recipiente de armazenamento.
Retire qualquer solução de armazenamento dos ventrículos. Seque o tecido com papel absorvente e pese-o. Em seguida, devolva o coração ao recipiente de armazenamento e posicione-o com a aorta voltada para cima, a fim de ajudar a manter uma temperatura miocárdica baixa.
Em seguida, insira uma cânula de três oitavos de polegada na aorta e fixe-a com um prendedor plástico. Reduza a bomba centrífuga para um gotejamento lento e deixe o sangue gotejar para dentro da aorta até que esta esteja cheia e completamente destituída de ar. Quando a aorta estiver cheia de sangue, fixe cuidadosamente a cânula aórtica ao tubo aórtico no L endorf, anotando o horário da fixação.
Em seguida, insira o transdutor de pressão calibrado através da válvula de hemostasia até a aorta nativa. Inicie as medições de pressão e ajuste a velocidade da bomba centrífuga até atingir a pressão de reperfusão desejada. Monitore atentamente a pressão aórtica, especialmente durante a reperfusão inicial, e aumente progressivamente a temperatura na unidade de aquecimento até que a temperatura intra-miocárdica atinja 37 graus Celsius.
Obtenha uma amostra basal no tempo zero do reservatório de sangue venoso para medir o pH, eletrólitos e outras análises bioquímicas. Em seguida, insira uma sonda de temperatura no septo e monitore a temperatura miocárdica. Colete amostras de sangue a cada 15 minutos, ajustando os parâmetros fisiológicos conforme desejado para o experimento e adicionando aproximadamente um milimol de cálcio à solução sanguínea a cada cinco minutos.
Garantir que o cálcio iônico seja maior que 0,8 milimol por litro antes da iniciação do modo de trabalho. Após colocar o coração em modo de trabalho, utilize um fio de polipropileno 3-0 para colocar um ponto em bolsa de purse no ápice do ventrículo esquerdo. Em seguida, utilize uma agulha 16 para fazer uma incisão perfurante dentro do ponto em bolsa de purse.
Insira o cateter de condutância de volume e pressão na incisão apical. Observe a saída dos dados para determinar quantos segmentos de volume estão ativos. Se todos os segmentos não estiverem ativos, ajuste a posição do cateter até que o estejam; pode ser necessário um leve giro do cateter para otimizar a morfologia do laço.
Em seguida, utilizando um cateter devidamente calibrado, obtenha pelo menos 30 segundos de dados de pressão e volume na linha de base para determinar as medidas de função cardíaca dependentes do volume. Após a obtenção de loops suficientes, utilize um prendedor de tubo para ocluir lentamente o tubo de pré-carga. Os loops de pressão-volume devem começar a ficar menores e deslocar-se para baixo e para a esquerda.
Isso é chamado de "walk down". Após obter de 10 a 15 segundos de dados de "walk down", solte o prendedor do tubo para permitir que a pré-carga retorne ao átrio esquerdo e para obter medidas independentes de volume da função cardíaca. Por fim, clique no botão de parada para encerrar a coleta de dados e obter medidas replicadas.
Após cinco minutos, repita o procedimento. A partir da etapa de oclusão, alterações na resistência coronariana podem causar flutuações na pressão de perfusão. Essas variações podem ser leves e corrigir-se gradualmente ao longo do tempo.
No entanto, em alguns casos, essas variações podem ser abruptas e exigir ajuste do fluxo pela bomba centrífuga para manter a pressão de reperfusão desejada. Neste experimento, após a introdução inicial do cateter de pressão-volume em um coração de suíno que havia sido armazenado a quatro graus Celsius por duas horas, os laços apresentavam baixa qualidade, com múltiplas áreas de sobreposição e sem componentes do ciclo cardíaco discerníveis. Contudo, com manipulação mínima do cateter dentro do ventrículo, a morfologia dos laços melhorou drasticamente, permitindo a obtenção de medidas apesar da otimização da posição do cateter.
Os laços adquiridos no circuito ex vivo podem ter uma morfologia diferente dos laços in vivo, provavelmente devido à orientação distinta do coração no circuito em comparação com a de um animal em posição supina, bem como à ausência de fixações anatômicas presentes em um animal vivo. Além disso, o uso de fios de estimulação para ajudar a regular a frequência cardíaca introduz uma corrente elétrica externa, resultando no pico observado na porção inferior direita dos laços ex vivo. No entanto, desde que esses laços ainda apresentem os componentes do ciclo cardíaco, ainda podem fornecer dados interpretáveis.
Após este procedimento, outros métodos como eletrocardiografia e ecocardiografia podem ser realizados para examinar outras propriedades físicas do coração, incluindo a condução.
Visão Geral
Este artigo descreve um sistema Langendorff projetado para modelos de animais grandes, permitindo a medição da função cardíaca ex vivo. O método possibilita a aquisição de dados em diversas espécies, incluindo humanos, evitando fatores de confusão imunológicos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Fisiologia cardíaca
- Medição da função cardíaca ex vivo
- Projeto do aparelho Langendorff
Contexto
- Estudos tradicionais frequentemente utilizam modelos com animais pequenos.
- Modelos com animais grandes fornecem dados mais clinicamente relevantes.
- Confoundores imunológicos complicam estudos de transplante em animais grandes.
- O aparelho de Langendorff pode ser adaptado para espécies maiores.
Objetivo do Estudo
- Medir a função cardíaca em animais grandes utilizando um circuito ex vivo.
- Fornecer um método confiável para a aquisição de dados entre espécies.
- Otimizar parâmetros fisiológicos para medições precisas.
Métodos Utilizados
- Montagem do aparelho cardíaco funcional.
- Lavagem e reconstituição do sangue com solução salina normal.
- Calibração do aparelho Langendorff para espécies específicas.
- Inserção de um cateter de condutância para medições quantitativas.
Resultados Principais
- Medição bem-sucedida da função ventricular em modelos animais grandes.
- Estabelecimento de condições fisiológicas para prevenir problemas de influxo de cálcio.
- A coleta de dados forneceu informações clinicamente relevantes sobre o desempenho cardíaco.
- Demonstrou a viabilidade do uso do aparelho Langendorff em espécies maiores.
Conclusões
- O sistema Langendorff pode medir efetivamente a função cardíaca em animais grandes.
- Este método fornece dados valiosos enquanto minimiza os efeitos imunológicos.
- Estudos futuros podem aproveitar esta abordagem para pesquisas cardíacas adicionais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este sistema isolado de coração trabalhando permite a medição ex vivo da função cardíaca em modelos de animais grandes, fornecendo dados clinicamente relevantes enquanto evita interferências imunológicas inerentes a estudos de transplante. O sistema oferece aplicabilidade entre espécies por meio da regulação ajustável da pressão de perfusão, facilitando a pesquisa cardiovascular translacional. Ao gerar dados quantitativos de pressão-volume, ele aprimora a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas nos processos de descoberta pré-clínica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da medição direta da função ventricular em modelos animais grandes fisiologicamente relevantes.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica ao fornecer dados de desempenho cardíaco relevantes para humanos, sem interferências imunológicas.
- Valor Preditivo: Gera loops quantitativos de pressão-volume que aumentam a confiança nas avaliações de engajamento do alvo e modulação de vias.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Produz medições padronizadas e reprodutíveis de pressão-volume ventricular adequadas para campanhas de triagem de compostos.
- Saída Quantitativa: Fornece leituras hemodinâmicas contínuas em tempo real, permitindo análise de resposta à dose e perfil de eficácia.
- Escalabilidade: Sistema de perfusão adaptável permite execução consistente do ensaio em diferentes tamanhos cardíacos e espécies.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Relevância para a Doença: Mantém parâmetros hemodinâmicos que replicam condições in vivo, sustentando a validade do modelo pré-clínico.
- Continuidade Tradutiva: Conecta descobertas da pesquisa à validação pré-clínica por meio de desfechos funcionais mensuráveis.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Fornece dados para orientar decisões de avanço ou interrupção com base em sinais de segurança cardíaca e eficácia.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a avaliação pré-clínica, fornecendo dados cardíacos funcionais que orientam a otimização do fármaco líder e a avaliação de segurança.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias por meio de medições diretas da função ventricular em sistemas relevantes para a doença.
- Triagem: Permite a preparação de ensaios por meio da coleta padronizada e reprodutível de dados de pressão-volume sob condições controladas de perfusão.
- Análises: Fornece medições quantitativas de variáveis dependentes (por exemplo, pressão final sistólica, trabalho sistólico) que permitem comparação entre condições e classificação de compostos.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se ao trabalho pré-clínico ao fornecer saídas funcionais relevantes para humanos que se alinham com avaliações de biomarcadores e segurança.
- Reutilização Corporativa: O aparelho configurável atua como uma plataforma reutilizável para múltiplos alvos cardiovasculares e espécies, reduzindo o desenvolvimento redundante de modelos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista na validação de alvos cardíacos.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio da regulação rigorosa da pressão de perfusão coronariana e manutenção fisiológica de eletrólitos.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência de capital ao permitir a identificação precoce de riscos de cardiotoxicidade, reduzindo a eliminação em fases tardias.
- Impacto no Portfólio: Facilita a priorização ajustada ao risco de compostos com base em limiares quantitativos de desempenho cardíaco.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em fisiologia cardiovascular e técnicas de perfusão ex vivo.
- Depende de bombas centrífugas, transdutores de pressão e cateteres de condutância para controle e medição hemodinâmicos precisos.
- Necessita padronização entre equipes nos protocolos de preparação do sangue, regulação da temperatura e aquisição de dados.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes tamanhos cardíacos, requisitos iônicos específicos de espécies e otimização do posicionamento do cateter.
- É limitado pelo design de sistema aberto, o qual complica a regulação da temperatura em longo prazo, apesar de permitir a coleta de dados de efluente e de pressão-volume.
