Curso de modelagem em Ratos: Coagulação permanente da artéria distal Cerebral Média

O objetivo geral deste procedimento é realizar uma oclusão permanente da artéria cerebral média distal de um camundongo, gerando um infarto que se localiza principalmente na região cortical e possui um tamanho relativamente semelhante ao dos acidentes vasculares cerebrais em humanos. Isso é alcançado inicialmente pela avaliação do valor basal de assimetria no uso dos membros antes da cirurgia. O próximo passo do procedimento consiste em realizar a cirurgia de indução do acidente vascular cerebral por eletrocoagulação da artéria cerebral média distal.

Após a cirurgia, déficits sensorimotores focais são testados por meio da pontuação da assimetria no uso dos quatro membros. Novamente, o passo final é analisar o volume do infarto utilizando coloração com violeta cristal. Em última análise, as lesões corticais resultantes são de tamanho moderado com pequena variação, o que torna esta técnica um modelo valioso para pesquisas básicas e translacionais sobre acidente vascular cerebral.

As principais vantagens desta técnica em comparação com outros modelos comuns de acidente vascular cerebral são que a taxa de mortalidade neste modelo é mínima, assim como o volume e a localização do infarto. O neocórtex representa a maioria dos acidentes vasculares cerebrais em humanos e é altamente reprodutível. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades inicialmente com a remoção suave do crânio para minimizar lesões mecânicas.

Em segundo lugar, a identificação correta e a correlação adequada da artéria sal medial distal são fundamentais para este modelo. Primeiramente, injete analgésicos 30 minutos antes de iniciar a operação. Ligue a manta térmica para o camundongo e ajuste-a a 37 graus Celsius para a operação.

Em seguida, certifique-se de que o gás anestésico composto por 70%nitrogênio, 30%oxigênio e isoflurano está pronto. Então, exponha o camundongo a 4% de isoflurano em uma câmara de indução até que pare de se mover. Em seguida, posicione o camundongo sobre a placa aquecida e administre isoflurano a 4% por mais um minuto.

Após o minuto, altere a taxa de isoflurano para 1,5%. Agora, certifique-se de que o camundongo está suficientemente anestesiado com um aperto no dedo do pé, e, caso afirmativo, aplique dafan etanol nos olhos utilizando uma tesoura. Inicie a cirurgia com uma incisão de um centímetro entre a orelha e o olho. Separe a pele e identifique o músculo temporal.

Agora, no gerador de alta frequência, configure a função para coagulação, o modo para bipolar, a potência para 12 watts e conecte a pinça. Na preparação, adicione uma gota de solução salina ao músculo temporal exposto. Em seguida, utilize a pinça de eletrocoagulação para destacar o músculo temporal do crânio nas suas partes apical e distal.

O resultado é um retalho muscular solto. Agora identifique a artéria cerebral média ou MCA abaixo do crânio transparente. Está na parte rostral da região temporal, dorsal ao seio retro-orbital.

Use uma broca para afinar o osso diretamente acima desta artéria até que fique transparente. Mantenha o crânio úmido durante a perfuração usando solução salina. Agora, com pinças muito finas, remova cuidadosamente o osso para expor o ramo da artéria cerebral média (MCA).

Altere o gerador de alta frequência para sete watts. Agora, coagule a artéria com a pinça de eletrocoagulação tocando-a suavemente, sem prender. Coagule a artéria tanto proximal quanto distalmente à bifurcação; no caso de uma variação anatômica sem a bifurcação da ACM, coagule a artéria o mais proximal possível em dois pontos, aproximadamente um milímetro distante um do outro, após a coagulação.

Aguarde 30 segundos e, em seguida, toque suavemente a artéria com pinça romba. Em seguida, reposicione o músculo na posição que cobre o orifício de trepanação. Suture o ferimento e coloque o animal em uma caixa de recuperação a 32 graus Celsius para se recuperar da anestesia, devolvendo-o depois à gaiola.

Em geral, leva de cinco a 10 minutos para o animal se recuperar da anestesia. O teste do cilindro verifica a preferência de um membro em relação ao outro. Coloque o animal em um cilindro de vidro acrílico transparente cercado por dois espelhos dispostos em ângulo reto.

Filme o animal por cinco minutos em frente ao vértice dos dois espelhos, do outro lado do cilindro. Após cada ensaio, limpe o cilindro e a superfície da mesa com etanol a 60%. Posteriormente, realize uma análise quadro a quadro.

Analise o ensaio contando o contato de uma das quatro patas com o cilindro enquanto o animal está completamente ereto, e também contando as aterrissagens com um dos quatro membros. Após uma pontuação de elevação completa, pelo menos 20 contatos de um dos quatro membros por ensaio seção criogenada, cada cérebro seriamente em secções de 20 micrômetros de espessura tomadas em intervalos de 400 micrômetros. Colete as secções em lâminas para armazenamento a menos 20 graus Celsius.

Utilizando este protocolo de corte, todas as lâminas que cobrem a área de infarto de um cérebro podem ser colocadas em uma única lâmina. Corar as secções utilizando um protocolo padrão de violeta cresta para delinear a área do tecido infartado de cada secção cerebral. As lâminas podem então ser montadas, digitalizadas e analisadas utilizando o método de Swanson para edema.

A mortalidade corrigida devido à cirurgia de oclusão da artéria cerebral média foi inferior a 5%, devido principalmente a hemorragia subaracnóidea ou anestesia incorreta. Nenhum animal morreu durante o período. Para esta análise para uso de PA, a assimetria foi medida utilizando o teste do cilindro após a indução do acidente vascular cerebral e comparada aos valores basais obtidos antes da oclusão da ACM; detectou-se assimetria significativa dos membros em 24 horas, que se recuperou parcialmente durante a primeira semana após o acidente vascular cerebral, uma semana após o acidente vascular cerebral.

O infarto induzido com coloração por violeta de cresil apresentou volume médio de infarto medido em 15,4 milímetros cúbicos, representando aproximadamente 12% de um hemisfério cerebral. O desvio padrão deste modelo é muito baixo. Além disso, a localização do infarto apresentou variabilidade mínima.

Uma vez preparado, este procedimento pode ser concluído em até 10 minutos se for realizado corretamente. Além dos testes demonstrados com cilindros e da coloração com violeta de genciana, outros testes comportamentais e métodos histológicos estabelecidos podem ser utilizados para caracterizar mais detalhadamente o resultado e responder questões de pesquisa específicas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar uma oclusão permanente da artéria cerebral média distal em camundongos.

Recomendamos fortemente o uso de procedimentos operacionais padronizados e documentação detalhada para manter a reprodutibilidade do método.