Name: Curso de modelagem em Ratos: Coagulação permanente da artéria distal Cerebral Média (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprenda a realizar oclusão permanente da artéria cerebral média distal em camundongos por eletrocoagulação. Este modelo reprodutível de AVC isquêmico apresenta baixa mortalidade e lesões corticais consistentes para pesquisa translacional.

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Este trabalho foi financiado pelo cluster de excelência da fundação de pesquisa alemão &quot;Munich Cluster para sistemas Neurologia (Sinergia)&quot; e pela fundação da Daimler-Benz para AL

Declaração de Ética As experiências relatadas neste vídeo foram conduzidos de acordo com as diretrizes nacionais para o uso de animais de laboratório e os protocolos foram aprovados pelos comitês governamentais alemãs (Regierung von Oberbayern, Munique, Alemanha). 10 semanas de idade, os ratos machos C57Bl/6J são usadas neste estudo. Os animais foram alojados sob temperatura controlada (22 ± 2 ° C), com um período de ciclo claro-escuro de 12 horas e acesso à ração peletizada e água ad libitum. Analgesia e sedação protocolos são descritos como aprovado pela comissão governamental local, mas pode ser diferente de protocolos utilizados em outros laboratórios. 1. Preparação do material e instrumentos <ol><li> Ligue o cobertor com aquecimento de modo a manter a área de operação quente e manter a temperatura do corpo do rato durante anestesia (37 ° C). </li><li> Tesoura Prepare autoclavado, forceps e algodões, dexpanthenol pomada e material de sutura. Prepara-se uma seringa com solução salina (sem agulha) para manter a área de operação hidratado. Prepare o gás de anestesia (70% de N 2 O + 30% de O2 + isoflurano). </li><li> Injectar analgésicos por via intraperitoneal: Metamizol 200 mg / kg, carprofeno 4 mg / kg e buprenorfina a 0,1 mg / kg. </li><li> Posicione o mouse na câmara de indução com uma taxa de fluxo de isoflurano de 4% para anestesiar-lo até que o movimento espontâneo de corpo e vibrissas pára. </li><li> Transfira o mouse na posição lateral com o nariz na máscara de anestesia e manter a concentração de isoflurano em 4% para cerca de um minuto, em seguida, reduzir e em approx.1.5% para manter a anestesia adequada. </li><li> Aplicar dexpantenol pomada em ambos os olhos. </li></ol> 2. Modelo MCAO distal <ol><li> Faça uma incisão na pele um centímetro entre o ouvido eo olho usando pequenas tesouras de operação após o preparo asséptico do site usin cirúrgicog desinfetante da pele. </li><li> Separa-se a pele e localizar o músculo temporal. </li><li> Selecione no gerador de alta freqüência a função de coagulação, o modo bipolar, selecione 12 W e se conectar a pinça eletrocoagulação com o cabo. </li><li> Adicionar uma gota de solução salina e usar a pinça para retirar o músculo temporal do crânio em sua parte apical e dorsal, assim, fazendo um retalho do músculo sem remover totalmente o músculo. </li><li> Identificar a MCA abaixo do crânio transparente, na parte rostral da área temporal dorsal para o seio retro-orbital (Figura 2A). Se a bifurcação MCA não é visível (devido a uma variação normal anatómica) identificar o recipiente mais rostral. </li><li> Adicione um pouco de soro fisiológico no crânio e desbastar o osso com a broca logo acima do ramo MCA até que ele tem uma textura fina e translúcida (Figura 2B). </li><li> Retire cuidadosamente o osso acima da artéria com uma pinça muito finas. </li><li> Selecione o modo bipolar in o gerador de alta frequência com a 7 W. Coagula da artéria com o electrocoagulação pinça proximal e distal em relação à bifurcação (Figura 2C). Quando a bifurcação não é visível, devido a uma variante anatómica, coagular o ramo MCA correctamente identificados (ver acima), em dois locais de aprox. Distância de 1 mm. Não é necessário para captar a artéria com as pinças para coagulação, tocando a artéria cuidadosamente com pinças em ambos os lados a partir de cima é suficiente e induz menos danos mecânicos. </li><li> Espere 30 segundos e tocar suavemente a artéria com uma pinça embotadas para verificar se há fluxo de sangue devido a recanalização espontânea. No caso de recanalização repetir a electrocoagulação uma vez. </li><li> Mudar a localização do músculo temporal para a sua posição, que cobre o orifício de trepanação. </li><li> Suturar a ferida e colocar o animal em uma caixa de enfermagem a 32 ° C para se recuperar da anestesia e devolvê-lo para a jaula. Em geral, leva 5-10 minutos para o animal a recuperar da AnesthAIAS. </li><li> Injectar analgesia pós-operatória (ip) após 24 horas e depois diariamente até o quinto dia de pós-operatório: Carprofeno 4 mg / kg. </li></ol> 3. Sham Operação Execute todos os procedimentos de forma idêntica para a operação descrita acima - incluindo o afinamento do crânio e sua remoção - exceto para não coagular a artéria exposta. 4. Cilindro de teste 13 <ol><li> Colocar o animal num cilindro de acrílico transparente de vidro (diâmetro: 8 cm, altura: 25 cm) em frente de dois espelhos e vídeo para 5 min. Ajustar a câmara central em frente dos dois espelhos e o cilindro para obter um vídeo (Figura 3A) óptima. </li><li> Para a avaliação do uso de membro anterior independente, pontuação (1) contato da parede do cilindro com um membro anterior durante traseiro completo e (2) de pouso com apenas um membro anterior no assoalho após traseiro completo. Contagem pelo menos 20 contatos para um membro anterior usando câmera lenta ou quadro-a-frame função do Cliente Vídeo Lan (VLC) software freeware ( <a href="http://www.videolan.org/vlc">http://www.videolan.org/vlc</a> ). </li><li> Para a análise da linha de base antes da cirurgia: realizar o teste duas vezes por mouse, com uma pausa de 1 hora entre os ensaios. Membro Anterior uso é expresso como uma proporção de, uso direita / esquerda e verso membro anterior independente. </li><li> Após a coagulação MCA: realizar o teste novamente duas vezes por mouse, com uma pausa de 1 hora entre os ensaios, tal como indicado acima. </li></ol> 5. Perfusão <ol><li> Anestesiar os animais (por exemplo, através de cetamina e xilazina 120/16 mg / kg de peso corporal, respectivamente). </li><li> Corrigir o animal em decúbito dorsal e abrir a cavidade abdominal com um corte mediano. Remover rasgos e esterno. Faça uma pequena incisão no átrio direito. Inserir uma cânula de perfusão no ventrículo esquerdo e lentamente perfuse com 20 ml de solução salina. </li><li> Decapitar o animal, abrir a calota craniana e retire delicadamente o cérebro a partir da base do crânio. </li><li&gt; Congelar os cérebros em -40 ° C isopentano frio durante 10 min. Depois remover os cérebros do isopentano e armazenar até análise a -80 ° C. </li></ol> 6. Infarct volumetria <ol><li> Cryosectioning: Cortar os cérebros em série num criostato a 20 mm de espessura a cada 400 um em lâminas e armazenar as lâminas a -20 ° C. </li><li> Violeta de cresilo (CV) coloração: <ol><li> Preparar a solução de coloração: Misture 0,5 g de acetato de CV em 500 ml de H 2 O. Agita-se e calor (60 ° C) até que os cristais são dissolvidos. Deixe a solução esfriar e guarde em um frasco escuro. Aquecer de novo para 60 ° C e de filtro antes de cada utilização. </li><li> Secam-se as lâminas à TA durante 30 min. Em seguida, colocá-los em etanol a 95% durante 15 min e em seguida em etanol a 70% durante 1 minuto e depois em etanol a 50% durante 1 min. </li><li> Colocar as lâminas em água destilada por 2 min, atualizar água destilada e colocá-los para 1 min. Depois coloque as lâminas em solução de coloração (60 ° C) fou 10 min e lava-se duas vezes em água destilada durante 1 min. </li><li> Colocar as lâminas em etanol a 95% por 2 min. Em seguida, colocá-los em etanol a 100% durante 5 min, actualizar o etanol a 100% e para colocá-las em 2 min. Depois cobrir as lâminas com meio de montagem. </li><li> Análise: Digitalizar slides e analisar o volume de infarto indireta pelo método Swanson 14 para corrigir edema: (Área isquêmica) = (área Cortex do lado contralateral) - (região do córtex não-isquêmica do lado ipsilateral) (Figura 4A). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm interesses conflitantes para divulgar.

O presente protocolo descreve o modelo experimental de acidente vascular cerebral distal, OACM permanente por eletrocoagulação transcraniana - o chamado &quot;modelo de coagulação&quot;. Este modelo, entretanto, tornar-se um dos modelos animais mais utilizados em pesquisa do curso experimental 12. Em comparação com outros modelos de isquemia cerebral focal, o modelo de coagulação, tal como apresentado neste vídeo tem a vantagem de um tempo muito curto, a operação de aproximadamente 10 min, quando realizado por um cientista treinado. Assim, os tempos breves de anestesia pode ser conseguida neste modelo, o que é uma característica favorável de um modelo de acidente vascular cerebral experimental porque o impacto dos anestésicos em neuroprotecção e derrame resultado é bem conhecido 15. Além disso, como anteriormente descrito por Carmichael et ai. 11, que demonstram que o volume do enfarte resultante e localização após distal coagulação permanente do MCA corresponde às lesões cerebrais isquémicas, na maioria dos humanosderrames em proporção ao tamanho do cérebro. Acidente vascular cerebral humano é principalmente de tamanho pequeno com lesões de, aproximadamente, 5-15% de hemisfério, com base em estudos populacionais anteriores e os ensaios clínicos de imagem 16-18, em contraste com lesões extensas com acidente vascular cerebral edema cerebral compressão que ocorrem em menos de 10% de cursos clínica 19. Deste modo, as lesões de AVC do território da ACM de cerca de 12% do hemisfério alcançado pelo modelo apresentado pode ser considerado como um volume de curso relevantes em translação. No entanto, tem que ser tomado em consideração que diferentes estirpes de ratos ou protocolos utilizados para anestesia pode afectar o volume da lesão que resulta 20. A mortalidade durante o período de observação após a indução AVC neste modelo é praticamente ausente. A mortalidade total de menos de 5% é constituída principalmente de mortes durante a operação por causa de complicações anestesiológicas ou sacrifício porque chegando de critérios de exclusão. A fim de justificar a baixa variability deste modelo e sua excelente reprodutibilidade, sugerimos os seguintes critérios de exclusão: 1) Qualquer hemorragia subaracnóide durante a operação. 2) Tempo de operação mais de 15 min. 3) A recanalização da MCA depois de duas tentativas para eletrocoagulação com apenas OACM transitória. Além disso, os animais devem ser examinados diariamente após MCAO (comportamento fisiológico básico, a aparência da pele eo peso corporal) para controlar a dor, desconforto ou comportamento doentio. Várias medidas podem ser implementadas para a análise do resultado do curso como medida speckle laser, ressonância magnética, testes comportamentais ou análise histológica. Neste protocolo, fornecer métodos exemplares para análise do comportamento e análise de volume de infarto. Vários teste para análise de comportamento após a isquemia cerebral focal têm sido desenvolvidos e utilizados em pesquisa do curso experimental. Testes adequados para a disfunção sensório-motor usado anteriormente pelo nosso grupo neste modelo AVC 21,22 nósre o teste Rotarod 23, teste de etiqueta adesiva 24, Canto teste 25 eo teste do cilindro 13, o que é demonstrado neste vídeo. O teste do cilindro consistentemente descreve assimetria do motor na fase aguda após distal MCAO permanente e também detecta recuperar consecutivo da função motora. Apesar das vantagens óbvias, algumas limitações deste modelo de acidente vascular cerebral tem que ser tida em conta. Em primeiro lugar, é necessária uma trepanação do crânio, a fim de coagular a artéria, produzindo, assim, um acesso potencial de peri-operacionais infecções do cérebro, embora as infecções bacterianas da ferida cirúrgica, músculo temporal ou o próprio cérebro nunca ter sido detectado por nós mesmos ou documentados por outros usando esse modelo. Além disso, os danos mecânicos para o córtex e de coagulação, durante a preparação não pode ser excluída, mas pode ser limitada pela perfuração cuidadosa e remoção do crânio, humidificação constante do local de cirurgia e ne mínimo<html> eletrocoagulação sário (ver critérios de exclusão). Embora o campo da MCA, conforme ilustrado na Figura 2 encontra-se na maioria dos ratinhos C57BL / 6, nós descrevemos o protocolo como proceder em variações normais do rumo do navio para minimizar a variabilidade modelo. Além disso, sugerimos o uso de múltiplas (3 no caso de bifurcação; 2 sem bifurcação dos MCA) sites de oclusão para minimizar o risco de recanalização parcial da MCA, que em nossa experiência é um fator importante para a variabilidade deste modelo. Em termos de testes comportamentais, apenas os déficits comportamentais menores podem ser detectados nos testes comportamentais acima mencionados e regeneração funcional pode ser observado na primeira semana após o acidente vascular cerebral. Assim, os sistemas de teste mais avançados, com maior sensibilidade e parâmetros de teste qualitativo como o teste atingindo qualificados 27 pode ser mais adequado para detectar o resultado funcional a longo prazo neste modelo. EOR &quot;&gt; Finalmente, devido à coagulação permanente do MCA não reperfusão pode ser obtido, que é uma característica observada numa percentagem substancial de pacientes com AVC, devido a lise de coágulos espontâneos ou terapia 28. No entanto, um modelo de acidente vascular cerebral tromboembólico anteriormente descrito 26 fornece a opção por um modelo de curso gratuito com a reperfusão de isquemia cerebral cortical. Tomados em conjunto, a alta reprodutibilidade, a possível observação a longo prazo devido à mortalidade mínimo eo volume de infarto em relação comparável e localização em relação ao acidente vascular cerebral humano distinguir o &quot;modelo de coagulação&quot; como um modelo valioso para a pesquisa básica e translacional derrame.

AVC é a terceira causa mais comum de morte e um dos principais motivos de incapacidade em adultos adquirido em países desenvolvidos 1. Cerca de 80% desta doença neurológica aguda é causada por isquemia cerebral resultante de uma obstrução do fluxo sanguíneo cerebral, enquanto cerca de 15% é causada por uma hemorragia intracerebral 2. Apesar de a investigação em curso, a administração intravenosa de ativador do plasminogênio tecidual é o único tratamento farmacológico aprovado para AVC isquêmico até agora e só está disponível para uma minoria de pacientes com AVC devido à janela de 4,5 horas após o AVC aparecimento 3,4 tempo curto aprovado. Como não existem modelos in vitro, que podem modelar corretamente as complexas interações entre o cérebro, vasos e mecanismos fisiopatológicos sistêmicos durante o curso, os modelos animais são essenciais para a pesquisa do curso pré-clínico. Portanto, vários modelos de derrame isquêmico foram desenvolvidos em uma variáveledade de espécies. Um dos modelos de AVC mais vulgarmente utilizado é o &quot;Modelo de filamento&quot;, em que um fio de sutura é transitoriamente introduzido na artéria carótida interna e encaminhada até a ponta oclui a origem da artéria cerebral média (MCA), resultando numa paragem do fluxo sanguíneo e posterior infarto cerebral de também regiões corticais e subcorticais no caso de oclusão prolongada 5,6. Em modelos photothrombotic de acidente vascular cerebral isquêmico, oclusão fotoquímica do navio cortical irradiado é alcançada após a injeção de um fotossensibilizador, resultando em pequenas lesões 7, circunscritos localmente. A oclusão permanente da MCA distais das artérias lenticulostriatal pode ser conseguida por uma ligação da artéria, a sua compressão transitória ou por 8,9 coagulação permanente. O enfarte resultante neste modelo afecta predominantemente o neocórtex 10 porque a oclusão da MCA neste modelo é distai ao lênticaulostriatal artérias, que fornecem os gânglios basais. Uma vez que a maior parte das lesões de AVC humanos estão localizados no território da artéria cerebral média, todos os modelos comuns tempos assemelham oclusões da MCA ou de um dos seus ramos 11. A MCA é uma das principais artérias que proporciona o fornecimento de sangue para o cérebro; que surge a partir da artéria carótida interna, rotas ao longo do sulco lateral, onde, em seguida, filiais e projetos para os gânglios da base e as superfícies laterais do frontal, parietal e lobos temporais, incluindo o motor primário e córtex sensorial. A direita ea esquerda MCA estão conectados às artérias cerebrais anterior e posterior artérias, que se conectam com as artérias cerebrais posteriores comunicação, criando o círculo de Willis (Figura 1). Como relatado anteriormente por Carmichael et al. 11, infartos modelados pela distal Cerebral Média Artery Oclusão (MCAO) modelo em camundongos abranger cerca de 10-15% do hemisfério, imitando assim a maioria das lesões tempos humanos, que estão localizados no território cortical MCA 11,12. Em 1981, Tamura et al. Descrito um modelo de coagulação transcraniana permanente, MCAO em ratos 8. No entanto, o modelo descrito por Tamura envolveu uma oclusão proximal da MCA, a fim de contornar a bifurcação mais distal da artéria. Assim, o &quot;modelo Tamura&quot; original induz não só as lesões corticais, mas também do corpo estriado, semelhantes às lesões obtidos por &quot;modelo de filamento&quot; 6. Aqui, descrevemos o modelo permanente OACM distal por eletrocoagulação transcraniana em camundongos. Além disso, relatamos histológica relacionada e métodos funcionais para analisar o resultado AVC neste modelo. Todos os métodos são baseados em procedimentos operacionais padrão desenvolvidos e utilizados em nossos laboratórios.

<table><tbody><tr><td>Câmera Canon Eos 500D</td><td></td><td></td><td>Canon Optics: 18-55 mm; 30 fps; função de vídeo 640 x 480</td></tr><tr><td>Espelho</td><td>Kristallform</td><td>2677089</td><td>30 x 30 cm&nbsp;</td></tr><tr><td>Cilindro de vidro acrílico transparente</td><td>H& S Kunststofftechnik</td><td></td><td>Diâmetro: 8 cm,&nbsp; altura: 25 cm</td></tr><tr><td>Manta de aquecimento</td><td>FHC DC Controlador de Temperatura</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Fina</td><td>FST</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Mayo</td><td>FST</td><td>1410-15</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>FST</td><td>11616-15</td><td></td></tr><tr><td>Algodões</td><td>NOBA Verbondmitel Danz</td><td>974116</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina</td><td>Braun</td><td>131321</td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen pommade</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbot</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de anestesia para isoflurano</td><td>Drager</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo eletrocirúrgico</td><td>ERBETOM ICC 80/50 HF-Chirurgieger&auml; t</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Proxxon</td><td>D-34343</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Inresa Arzneimittel GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylacine</td><td>Albrecht</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 5ml&nbsp;</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline PH: 7.4</td><td>Porca Innestadt Uni München</td><td>P32799</td><td></td></tr><tr><td>Isopentano</td><td>Fluka</td><td>59070</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Scientific CryoStarNX70</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Cresyl violet</td><td>Sigma Life Science</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma Life Science</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>521005</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>522078</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 99%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>ETO-5000-99-1</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histokit meio de montagem</td><td>Roth</td><td>6638.1</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos C57Bl / 6J</td><td>Charles River</td><td>000664</td><td></td></tr></tbody></table>

curso de modelagem em ratos: coagulação permanente da artéria distal cerebral média

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

AVC é a terceira causa mais comum de morte e uma das principais causas de incapacidade em adultos adquirida em países desenvolvidos. Opções terapêuticas muito limitados estão disponíveis para uma pequena proporção de pacientes com AVC na fase aguda. A pesquisa atual está intensamente em busca de novas estratégias terapêuticas e está cada vez mais focados na fase sub-aguda e crônica após o AVC porque mais pacientes possam ser elegíveis para intervenções terapêuticas em uma janela de tempo prolongado. Estes mecanismos incluem atraso caminhos fisiopatológicos importantes, tais como a inflamação pós-acidente vascular cerebral, a angiogênese, a plasticidade neuronal e regeneração. Para analisar esses mecanismos e avaliar posteriormente alvos de novas drogas, os modelos AVC experimentais com relevância clínica, baixa mortalidade e alta reprodutibilidade são procurados. Além disso, os ratos são os mais pequenos mamíferos em que uma lesão acidente vascular cerebral focal pode ser induzida e para que um largo espectro de modelos transgénicos sãodisponível. Assim, descrevemos aqui o modelo de ratinho de transcraniana, coagulação permanente da artéria cerebral média por meio de electrocoagulação distais das artérias lenticulostriatal, o chamado &quot;modelo de coagulação&quot;. O infarto resultando neste modelo está localizado principalmente no córtex; o volume de enfarte em relação em relação ao tamanho do cérebro corresponde à maioria dos acidentes vasculares cerebrais humanos. Além disso, o modelo de preencher os critérios de reprodutibilidade e baixa mortalidade acima mencionados. Neste vídeo podemos demonstrar os métodos cirúrgicos de indução AVC no &quot;modelo de coagulação&quot; e denunciar as ferramentas de análise histológica e funcional.

Devido ao tempo e moderada anestesia danos cerebrais curto, cerca de 10 min após a transferência para as suas gaiolas de todos os animais eram acordados, movendo-se livremente na gaiola e interagindo com a mesma ninhada. A mortalidade durante a cirurgia MCAO foi inferior a 5%, principalmente como resultado de hemorragia subaracnóidea acidental ou incorreta anestesia. A mortalidade durante o tempo de observação de 7 dias após a indução de derrame ocorre apenas muito raramente em cerca de 1-2% dos animais. Na série de operação de 10 animais para este relatório todos os animais sobreviveram à operação eo período de observação de 7 dias, nenhum deles teve de ser excluído devido a critérios de exclusão. Déficits comportamentais após a MCA coagulação foram avaliados pelo teste do cilindro uso 13 analisar forepaw assimetria. Neste teste, o índice de utilização das patas dianteiras esquerda e direita independente é medida em pontos de tempo indicados após a indução e acidente vascular cerebral em comparação com os valores de base obtidos 24hr antes de MCAO (Figura 3B). Os animais apresentaram uma mudança significativa no uso do membro assimetria para a exploração parede combinados no teste do cilindro de 24 horas (1,72 ± 0,326, p &lt;0,05) e 3 dias (1,36 ± 0,17, p &lt;0,05) após a MCAO. Embora a relação melhorou durante o período de observação de 1 semana, a assimetria do motor era ainda significativo de 7 dias após MCAO (1,35 ± 0,29, p &lt;0,05) em relação aos valores basais. Realizamos infarto volumetria usando cresil violeta manchado seções cerebrais coronais de série 7 dias após a indução do AVC (Figura 4B). A média de volume de infarto foi de 15,4 mm 3, representando, assim, 12% de um hemisfério cerebral (Figura 4C). A variabilidade deste modelo AVC é excepcionalmente baixo, com um desvio padrão de aproximadamente 10%. A área abrange a lesão somatossensorial e do córtex motor com afeto apenas menor de estruturas subcorticais. Além disso, a localização do infartoárea é altamente previsível com apenas variabilidade mínima como mostrado no diagrama esquemático de distribuição (Figura 4D). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51729/51729fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Representação esquemática do Círculo de Willis. The Circle arterial de Willis é formado pelas artérias cerebral média (MCA) e as artérias cerebrais anteriores (ACA) que se ramificam a partir da artéria carótida interna (ACI), bem como pelo posterior artérias cerebral (APC) e a posterior artérias comunicantes (PComA). O MCA é executado no sulco lateral onde se ramifica para o córtex cerebral. O ramo MCA dominante fornecer a maior parte do córtex motor e parte do córtex somatossensorial é permanentemente ocluído pela modelo demonstrou (artéria comunicante Acoma = Anterior; BA = artéria basilar; Suca = cerebel Superiorartéria lar). <img alt="Figura 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51729/51729fig2highres.jpg" width="400" /> Figura 2. Vista transcraniana após remoção do músculo temporal e vista esquemática de oclusão MCA. (A) Depois de retirar o músculo temporal artérias corticais pode ser visto através do crânio do rato parcialmente translúcida (em camundongos 8-12 semanas de idade). O ramo dominante MCA pode ser identificado na parte rostral da visão temporal, bem como outras artérias corticais ramificação do MCA e do PCA na parte caudal. (B) Representação esquemática no ramo MCA dominante em sua variação predominante com uma bifurcação no córtex temporal lateral, após a perfuração de um orifício e a remoção do crânio. (C) Os quadrados pretos representam os sítios de coagulação MCA nas proximais e distais lados da bifurcação. Figura 3. Análise de défices comportamentais. (A) teste do cilindro set-up: o mouse é colocado em um cilindro vertical e espelhos são colocados atrás a fim de registrar todos os movimentos usando uma câmera de vídeo (B) uso Membro Anterior assimetria foi analisada utilizando o teste do cilindro.. Rácios de esquerda / direita de uso independente membro anterior foram calculados 24 horas antes MCAO e nos momentos indicados após a indução derrame. N = 10, * p &lt;0,05 entre o ponto de tempo indicado e basal valor (controlo). <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51729/51729fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Volumétrica análise infarto e resultado do infarto após distal MCAO. (A) Imagem representativa de uma violeta cresil sutiã coronal manchadona seção 7 dias após MCAO. A linha amarela é o que indica a seleção do córtex contralateral (direito) ea linha vermelha é a seleção do córtex não infartado (manchado) do cérebro ipsilateral. A área pálida no hemisfério esquerdo descreve a área do tecido infartado. (B) a análise do volume de infarto 10 cérebros (cada ponto representa um cérebro individual) 24 horas, 3 dias e 7 dias após a coagulação distal MCA. A linha vermelha representa a média horizontal, barras de erro indicam o desvio padrão. (C) representativas violeta cresil secções cerebrais coronais coradas cada 400 um a 7 dias após a MCA. Coagulação (D) distribuição esquemática do tecido cerebral enfartado 7 dias após a MCAO. Cada slide mostra a informação acumulada de distribuição infarto (codificados por cores, conforme indicado) na seção dada em relação ao bregma (imagem modificada a partir de:. Liesz A et al, Brain, 2011; com permissão de Oxford University Press). &lt;a href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/51729/51729fig4highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vários modelos murinos de oclusão da artéria cerebral média (MCAO) são amplamente utilizados em pesquisas sobre o cérebro experimental. Aqui, demonstramos o modelo de transcraniana permanente distal MCAO que produz enfarte cortical consistente de um tamanho correspondente ao dano imposto pela maioria dos acidentes vasculares cerebrais isquémicos humanos.

Curso de modelagem em Ratos: Coagulação permanente da artéria distal Cerebral Média

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar uma oclusão permanente da artéria cerebral média distal de um camundongo, gerando um infarto que se localiza principalmente na região cortical e possui um tamanho relativamente semelhante ao dos acidentes vasculares cerebrais em humanos. Isso é alcançado inicialmente pela avaliação do valor basal de assimetria no uso dos membros antes da cirurgia. O próximo passo do procedimento consiste em realizar a cirurgia de indução do acidente vascular cerebral por eletrocoagulação da artéria cerebral média distal.Após a cirurgia, déficits sensorimotores focais são testados por meio da pontuação da assimetria no uso dos quatro membros. Novamente, o passo final é analisar o volume do infarto utilizando coloração com violeta cristal. Em última análise, as lesões corticais resultantes são de tamanho moderado com pequena variação, o que torna esta técnica um modelo valioso para pesquisas básicas e translacionais sobre acidente vascular cerebral.As principais vantagens desta técnica em comparação com outros modelos comuns de acidente vascular cerebral são que a taxa de mortalidade neste modelo é mínima, assim como o volume e a localização do infarto. O neocórtex representa a maioria dos acidentes vasculares cerebrais em humanos e é altamente reprodutível. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades inicialmente com a remoção suave do crânio para minimizar lesões mecânicas.Em segundo lugar, a identificação correta e a correlação adequada da artéria sal medial distal são fundamentais para este modelo. Primeiramente, injete analgésicos 30 minutos antes de iniciar a operação. Ligue a manta térmica para o camundongo e ajuste-a a 37 graus Celsius para a operação.Em seguida, certifique-se de que o gás anestésico composto por 70%nitrogênio, 30%oxigênio e isoflurano está pronto. Então, exponha o camundongo a 4% de isoflurano em uma câmara de indução até que pare de se mover. Em seguida, posicione o camundongo sobre a placa aquecida e administre isoflurano a 4% por mais um minuto.Após o minuto, altere a taxa de isoflurano para 1,5%. Agora, certifique-se de que o camundongo está suficientemente anestesiado com um aperto no dedo do pé, e, caso afirmativo, aplique dafan etanol nos olhos utilizando uma tesoura. Inicie a cirurgia com uma incisão de um centímetro entre a orelha e o olho. Separe a pele e identifique o músculo temporal.Agora, no gerador de alta frequência, configure a função para coagulação, o modo para bipolar, a potência para 12 watts e conecte a pinça. Na preparação, adicione uma gota de solução salina ao músculo temporal exposto. Em seguida, utilize a pinça de eletrocoagulação para destacar o músculo temporal do crânio nas suas partes apical e distal.O resultado é um retalho muscular solto. Agora identifique a artéria cerebral média ou MCA abaixo do crânio transparente. Está na parte rostral da região temporal, dorsal ao seio retro-orbital.Use uma broca para afinar o osso diretamente acima desta artéria até que fique transparente. Mantenha o crânio úmido durante a perfuração usando solução salina. Agora, com pinças muito finas, remova cuidadosamente o osso para expor o ramo da artéria cerebral média (MCA).Altere o gerador de alta frequência para sete watts. Agora, coagule a artéria com a pinça de eletrocoagulação tocando-a suavemente, sem prender. Coagule a artéria tanto proximal quanto distalmente à bifurcação; no caso de uma variação anatômica sem a bifurcação da ACM, coagule a artéria o mais proximal possível em dois pontos, aproximadamente um milímetro distante um do outro, após a coagulação.Aguarde 30 segundos e, em seguida, toque suavemente a artéria com pinça romba. Em seguida, reposicione o músculo na posição que cobre o orifício de trepanação. Suture o ferimento e coloque o animal em uma caixa de recuperação a 32 graus Celsius para se recuperar da anestesia, devolvendo-o depois à gaiola.Em geral, leva de cinco a 10 minutos para o animal se recuperar da anestesia. O teste do cilindro verifica a preferência de um membro em relação ao outro. Coloque o animal em um cilindro de vidro acrílico transparente cercado por dois espelhos dispostos em ângulo reto.Filme o animal por cinco minutos em frente ao vértice dos dois espelhos, do outro lado do cilindro. Após cada ensaio, limpe o cilindro e a superfície da mesa com etanol a 60%. Posteriormente, realize uma análise quadro a quadro.Analise o ensaio contando o contato de uma das quatro patas com o cilindro enquanto o animal está completamente ereto, e também contando as aterrissagens com um dos quatro membros. Após uma pontuação de elevação completa, pelo menos 20 contatos de um dos quatro membros por ensaio seção criogenada, cada cérebro seriamente em secções de 20 micrômetros de espessura tomadas em intervalos de 400 micrômetros. Colete as secções em lâminas para armazenamento a menos 20 graus Celsius.Utilizando este protocolo de corte, todas as lâminas que cobrem a área de infarto de um cérebro podem ser colocadas em uma única lâmina. Corar as secções utilizando um protocolo padrão de violeta cresta para delinear a área do tecido infartado de cada secção cerebral. As lâminas podem então ser montadas, digitalizadas e analisadas utilizando o método de Swanson para edema.A mortalidade corrigida devido à cirurgia de oclusão da artéria cerebral média foi inferior a 5%, devido principalmente a hemorragia subaracnóidea ou anestesia incorreta. Nenhum animal morreu durante o período. Para esta análise para uso de PA, a assimetria foi medida utilizando o teste do cilindro após a indução do acidente vascular cerebral e comparada aos valores basais obtidos antes da oclusão da ACM; detectou-se assimetria significativa dos membros em 24 horas, que se recuperou parcialmente durante a primeira semana após o acidente vascular cerebral, uma semana após o acidente vascular cerebral.O infarto induzido com coloração por violeta de cresil apresentou volume médio de infarto medido em 15,4 milímetros cúbicos, representando aproximadamente 12% de um hemisfério cerebral. O desvio padrão deste modelo é muito baixo. Além disso, a localização do infarto apresentou variabilidade mínima.Uma vez preparado, este procedimento pode ser concluído em até 10 minutos se for realizado corretamente. Além dos testes demonstrados com cilindros e da coloração com violeta de genciana, outros testes comportamentais e métodos histológicos estabelecidos podem ser utilizados para caracterizar mais detalhadamente o resultado e responder questões de pesquisa específicas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar uma oclusão permanente da artéria cerebral média distal em camundongos.Recomendamos fortemente o uso de procedimentos operacionais padronizados e documentação detalhada para manter a reprodutibilidade do método.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Filamentosas de oclusão da artéria cerebral média é um modelo comum para o estudo de AVC isquêmico em ratos.

Curso de modelagem em Ratos - Oclusão da Artéria Cerebral Média com o modelo de Filamento

Demonstramos no vídeo um método para produzir uma oclusão da artéria cerebral média em ratos adultos utilizando um monofilamento intraluminal. Também mostramos como avaliar a extensão do infarto cerebral por 2,3,5-trifeniltetrazólio cloreto de coloração (TTC).

Modelo do rato de Oclusão da Artéria Cerebral Média

O intraluminal cerebral média de oclusão da artéria modelo (MCAO) é o modelo mais freqüente dentre os modelos experimentais acidente vascular cerebral isquêmico. Aqui vamos demonstrar todo o modelo em detalhes com o guia de Laser Doppler fluxometria, e os resultados do seu representante.

Intraluminal artéria cerebral média Oclusão Model (MCAO) para Acidente Vascular Cerebral Isquêmico com Laser Doppler Fluxometria Orientação em Ratos

Ligadura da artéria cerebral média (MCA) é uma técnica para estudo da isquemia cerebral focal em modelos animais. Neste método, o da artéria cerebral média é exposto por craniotomia e ligados por cauterização. Este método dá volumes infarto altamente reprodutível e aumentou as taxas de sobrevivência pós-operatória em comparação com outros métodos disponíveis.

A aplicação de ligadura da artéria Cerebral Média Permanente no mouse

O modelo de oclusão intraluminal cerebral média em ratinhos é aqui apresentada. A extensão do enfarte cerebral é avaliada por uma pontuação neurológica e coloração com violeta de cresilo, a coloração de uma alternativa ao TTC, que oferece a grande vantagem de testar em paralelo marcadores de interesse muitos.

Modelo de Rato OACM Intraluminal: Avaliação infarto cerebral por coloração violeta Cresyl

Oclusão de filamento intraluminal da artéria cerebral média é o modelo mais frequentemente utilizadas na vivo do acidente vascular cerebral experimental em roedores. Uma abordagem alternativa cirúrgica para permitir a reparação de artéria carótida comum é realizada aqui, que permite a reperfusão da artéria carótida comum e uma reperfusão completa no território da artéria cerebral média.

Oclusão de artéria Cerebral média, permitindo a reperfusão através de reparação de artéria carótida comum em ratos

Descrito aqui é o modelo de derrame fototrombótico, onde um derrame é produzido através do crânio intacto induzindo a oclusão microvascular permanente usando iluminação laser após a administração de um corante fotossensível.

Modelagem de AVC em Camundongos: Lesões Corticais Focais por Fototrombose

Diferentes modelos de oclusão da artéria cerebral média (MCAo) são usados em pesquisas experimentais de derrame. Aqui, é descrito um modelo experimental de AVC de MCAo transitório através da artéria carótida externa (ECA), que visa imitar o AVC humano, no qual o trombo cerebrovascular é removido devido à lise espontânea de coágulo ou terapia.

Modelagem de AVC em Camundongos: Oclusão da Artéria Cerebral Média Transitória através da Artéria Carótida Externa

Este protocolo demonstra um modelo único de acidente vascular cerebral em camundongo com um infarto de tamanho médio e uma excelente taxa de sobrevida. Esse modelo permite que os pesquisadores pré-clínicos do AVC estendam a duração da isquemia, usem camundongos envelhecidos e avaliem os resultados funcionais a longo prazo.

Modelo de Oclusão Transcraniana da Artéria Cerebral Média Modificada para Estudo de Resultados de Acidente Vascular Cerebral em Camundongos Idosos

Este protocolo descreve o modelo de isquemia cerebral focal transitória em camundongos através da oclusão intraluminal da artéria cerebral média. Além disso, exemplos de avaliação de resultados são mostrados usando ressonância magnética e testes comportamentais.

Modelo de Oclusão Transitória da Artéria Cerebral Média do Acidente Vascular Encefálico

Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer um modelo de oclusão da artéria cerebral média distal (dMCAO) por meio de eletrocoagulação transcraniana em camundongos C57BL/6J e avaliar o comportamento neurológico subsequente e as características histopatológicas.

Indução de AVC Isquêmico Agudo em Camundongos Usando a Técnica de Oclusão Distal da Artéria Média

Aprenda a realizar oclusão permanente da artéria cerebral média distal em camundongos por eletrocoagulação. Este modelo reprodutível de AVC isquêmico apresenta baixa mortalidade e lesões corticais consistentes para pesquisa translacional.

Curso de modelagem em Ratos: Coagulação permanente da artéria distal Cerebral Média

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