Concentre Formação: Um Ensaio Celular para Determinar o Potencial oncogénica de um Gene

O objetivo geral deste procedimento é realizar o ensaio de formação de foco em linhagens celulares de fibroblastos de camundongos, usando um retrovírus para determinar o potencial oncogênico de um gene. Isso é feito primeiro clonando a sequência do gene de interesse em um vetor retroviral. O segundo passo é produzir partículas retrovirais usando o vetor viral e células de empacotamento de PLA e.

Em seguida, o retrovírus é usado para infectar células de fibroblastos de camundongo NIH três T, a fim de avaliar o potencial transformador do gene de interesse. A etapa final é permitir que as três células T três do NIH se dividam por duas a três semanas, seguidas de coloração com cristal violeta para quantificar o número de focos formados. Em última análise, o ensaio de formação de foco é usado para mostrar se a superexpressão de um gene de interesse é suficiente para induzir o crescimento independente da densidade em células de fibroblastos de camundongos.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia do câncer, como a triagem do potencial oncogênico de um gene. Para começar, faça o vetor viral conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, estabeleça culturas de plat E a partir de células congeladas descongelando rapidamente as células plat E em banho-maria de 37 graus Celsius e, em seguida, transferindo para um tubo cônico de 15 mililitros.

Adicione lentamente nove mililitros de meio PLA E ao tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar o tubo a 180 vezes G durante cinco minutos e rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda as células com 10 mililitros de meio plat E e transfira para uma placa de cultura de 10 centímetros.

Em seguida, incube as células em uma incubadora de 5% de CO2 a 37 graus Celsius até que estejam entre 80 e 90% confluentes. Realize a divisão das células aspirando primeiro o meio, depois lave as células uma vez com PBS antes de adicionar dois mililitros de 0,05% de tripsin EDTA e incubar por um minuto em temperatura ambiente, retire as células tocando com os dedos. Em seguida, adicione 10 mililitros de meio plat E e transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros.

Centrifugue o tubo como antes e ressuspenda as células com 10 mililitros de meio plat E. Em seguida, semee, 2 milhões de células por placa de cultura de 10 centímetros usando meio plat E sem antibióticos e deixe as células incubarem durante a noite. No dia seguinte, transfira 300 microlitros de optimum para um microtubo de 1,5 mililitro.

Adicione 27 microlitros de amina de polietileno ao tubo preparado com Optum. Misture delicadamente batendo com os dedos e incube por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione nove microgramas de DNA de plasmídeo de grau de transfecção no tubo misturado suavemente por vórtice e incube por 15 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, adicione a mistura gota a gota no prato plat E antes de incubar durante a noite. No dia seguinte, aspire o meio contendo o reagente de transfecção e adicione 10 mililitros de meio fresco plat E antes de retornar as células à incubadora para estabelecer NIH três T três culturas. Primeiro, descongele rapidamente as células em um banho-maria a 37 graus Celsius e transfira para um tubo de 15 mililitros.

Adicione lentamente nove mililitros de NIH três, T três meio às células, centrifugue o tubo a 180 vezes G por cinco minutos e descarte o snat. Em seguida, ressuspenda as células com 10 mililitros de NIH três, T três médio e transfira para uma placa de cultura de 10 centímetros. Incube as células em uma incubadora de 37 graus Celsius 5% CO2, mantendo-as sob confluência à medida que a frequência da transformação espontânea aumenta.

Uma vez que uma cultura atinge a cofluência, uma vez cultivada a semente três vezes 10 elevado ao quinto nih, três T três células por prato de 10 centímetros e incubar durante a noite para infecção no dia seguinte. No dia seguinte, colha o sobrenadante retroviral do prato plat E usando uma seringa descartável de 10 mililitros, filtrando-o através de um filtro de membrana de náilon de tamanho de poro de 0,45 mícron e transferindo-o para um tubo de 15 mililitros. Adicione 10 mililitros de meio E fresco às células antes de devolvê-las à incubadora.

Em seguida, aspire o meio do NIH três T três placas de células a serem infectadas e adicione cinco mililitros de NI H regular três, T três meios e cinco mililitros de vírus contendo sobrenadante filtrado. Em seguida, adicione poli cérebro ao prato. Adicione uma concentração de seis microgramas por mililitro.

Incube as células durante a noite antes de repetir as etapas de infecção para uma segunda rodada de infecção. Após a infecção, substitua o vírus, contenha meio com IH regular três T três meio. Permita que as células IH três T três cresçam por duas a três, substituindo o meio conforme necessário para a coloração violeta cristalina.

Aspire o NIH três T três médio e coloque os pratos no gelo. Lave a louça duas vezes com PBS gelado. Fixe as células com metanol gelado por 10 minutos.

Em seguida, retire os pratos do gelo e aspire o metanol. Adicione três mililitros de solução de violeta a 0,5% de cristal feita em 25% de metanol e incube os pratos por cinco minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, aspire a solução de cristal violeta e lave cuidadosamente o prato com água Milli Q até que nenhuma cor saia no enxágue.

Deixe a louça secar descoberta durante a noite em uma bancada. Quando os pratos estiverem secos, use uma régua para medir os focos e conte aqueles que têm mais de cinco milímetros de diâmetro. O número MXD três é um fator básico de transcrição de zíper de leucina helicoidal que é um membro atípico da família MAD, e foi relatado que está envolvido na carcinogênese quando comparado ao controle negativo e ao controle positivo.

As três antenas do NIH T três onde MXD três foi superexpresso tiveram significativamente menos focos. Os dados foram coletados de vários experimentos para determinar a significância e as mesmas tendências foram observadas neste ensaio. Os resultados sugerem que o MXD três não funciona como um oncogene após este procedimento.

Outros métodos, como ensaio de formação de foco com combinações de genes, crescimento na proliferação de trado mole e análise do ciclo celular, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais Para avaliar o papel de um gene de interesse na patogênese da oncogênese.