Name: Concentre Formação: Um Ensaio Celular para Determinar o Potencial oncogénica de um Gene (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Aprenda a realizar o ensaio de formação de focos em fibroblastos de camundongo NIH 3T3 usando vetores retrovirais para avaliar o potencial oncogênico de genes. Este método permite quantificar o crescimento independente de densidade celular.

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Este trabalho foi financiado por uma bolsa da New Innovator Award Program Director do NIH (ED). AA foi apoiado em parte por prêmios de graduação do Instituto Nacional do Câncer e da Fundação Nacional de Ciência.

1. Fazer os vetores virais As sequências de codificação para o gene de interesse, bem como os controlos positivos e negativos, são inseridos em pBABEpuro por métodos tradicionais de clonagem (amplificação por PCR, digestão de restrição e de ligação). Existem quatro locais de restrição no vector em que o DNA pode ser inserido: BamHI, SnaBI, EcoRI e Sall. <ol><li> Prepare plasmídeo DNA transfecção-grade a partir de células competentes, segundo o kit plasmídeo midi QIAGEN. </li><li> Medir a concentração de DNA usando um espectrofotômetro NanoDrop2000. </li></ol> 2. Retrovirus Produção A linha celular de empacotamento Plat-E vai ser utilizado para produzir retrovírus ecotrópico que permitirá obter o ADNc de interesse a células NIH 3T3. <ol><li> Estabelecer Plat-E culturas de células congeladas <ol><li> Rapidamente descongelar células Plat-E de um ° C banho de água 37 e transferir para um tubo de 15 ml. Lentamente, adicionar 9 ml de meio de Plat-E (DuMeio Eagle Modificado de lbecco (DMEM) + 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) + penicilina e estreptomicina). </li><li> Centrifugar o tubo em 180 x g durante 5 min e desprezar o sobrenadante. </li><li> Re-suspender as células com 10 ml de Plat-E e meio de transferência para uma placa de cultura de 10 centímetros. </li><li> Incubar as células em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2 até que eles são de 80-90% confluentes (cerca de 2 dias). </li></ol></li><li> Splitting celular <ol><li> Aspirar o meio e lave as células uma vez com PBS. </li><li> Adicionar 2 ml de 0,05% de tripsina-EDTA e incubar durante 1 minuto à temperatura ambiente. </li><li> Retire as células por finger tapping, adicione 10 ml de meio Plat-E, e transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml. </li><li> Centrifugar o tubo em 180 x g durante 5 min e desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células com 10 ml de meio Plat-E e semear-los em novas placas a 1: 4-1: 6 diluições. </li></ol></li><li> Plat-E Sementeira e Transfection <ol><li> Semente de 2 x 10 6células por 10 cm prato de cultura, utilizando meio de Plat-E sem quaisquer antibióticos. </li><li> Incubar as células S / N em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> No dia seguinte, transferir 300 ul de Opti-MEM em 1,5 ml de tubo de microcentrífuga. </li><li> Adicionar 27 ul de polietilenimina (PEI), um reagente de transfecção de baixo custo 12, o tubo preparado com Opti-MEM. Misturar suavemente batendo por dedo e incubar durante 5 min à TA. </li><li> Adicionar 9 ug de ADN plasmídeo de transfecção de grau para o tubo de Opti-MEM / PEI, misturar suavemente em vórtex e incubar durante 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar o ADN / PEI gota a gota complexo no prato Plat-E, e incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> No dia seguinte, aspirar o meio contendo o reagente de transfecção e adicione 10 ml de meio Plat-E fresco (sem antibióticos). </li><li> Retorne as células para a incubadora. </li></ol></li></ol> 3. As células NIH 3T3 e Infecção <ol><li> Estabelecer NIHCultures 3T3 e propagação <ol><li> Rapidamente descongelar células NIH 3T3 numa ° C num banho de água a 37 e transferir para um tubo de 15 ml. Adiciona-se lentamente 9 ml de meio de NIH 3T3 (DMEM + 10% FBS). </li><li> Centrifugar o tubo em 180 x g durante 5 min e desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células com 10 ml de NIH 3T3 médio e transferir para um 10 centímetros prato de cultura. </li><li> Incubar as células em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2. É muito importante que as células NIH 3T3 são sempre mantidas underconfluent (50-60%), tal como a frequência de transformação espontânea (e, por conseguinte, níveis basais de formação de focos) aumenta uma vez que uma cultura atinge a confluência. </li><li> Semente de 3 x 10 5 células por placa de 10 cm e incubar O / N para a infecção, no dia seguinte. </li></ol></li><li> Infecção <ol><li> Colher o sobrenadante retroviral do prato Plat-E usando uma seringa descartável de 10 ml, filtração através de um filtro de membrana de nylon de 0,45 um de tamanho de poro, e transferindo-o para um 15 mltubo. </li><li> Adicionar 10 ml de meio Plat-E fresco às células (sem antibióticos), e devolvê-las para a incubadora. </li><li> Aspirar o meio do prato de células NIH 3T3 de estarem infectados, e adicione 5 ml de meio de NIH 3T3 regular e 5 ml de sobrenadante filtrado que contém o vírus. </li><li> Adicionar ao prato polibreno a uma concentração de 6 ug / ml. </li><li> Incubar as células S / N a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> No dia seguinte, repita os passos 3.2.1 - 3.2.5 para uma segunda rodada de infecção. </li><li> Substituir o meio contendo vírus NIH 3T3 com meio regular. </li><li> Permitir que as células NIH-3T3 para crescer durante 2-3 semanas, substituindo o meio, conforme necessário. Verifique a expressão da proteína de interesse por electroforese e imunotransferência de proteína convencional em lisados ​​de células inteiras a partir de placas réplica. </li></ol></li></ol> 4. Coloração e Quantificação <ol><li> Violeta Cristal Coloração <ol><li> Aspirar o meio de NIH 3T3 e colocar os pratosem gelo. </li><li> Lavam-se as placas duas vezes com PBS gelado. </li><li> Fixar as células com metanol gelado durante 10 min. </li><li> Remover os pratos de gelo, aspirar o metanol, e adicionar 3 ml de solução de violeta cristal 0,5% feitos em 25% de metanol (RT). </li><li> Incubar as placas durante 5 min à TA. </li><li> Aspirar a solução de cristal violeta e lavar cuidadosamente o prato com Milli-Q H2O até sem cor sai na lavagem. </li><li> Permitir que os pratos para secar O / N em uma bancada (descoberto). </li></ol></li><li> Focos Quantificação <ol><li> Uma vez que os pratos estão secos, use uma régua para medir as coleções de cor escura de células na placa. Contar apenas aqueles que são maiores do que 5 mm de diâmetro, como &quot;focos&quot;. Anote o número de focos e calcular médias e a importância em comparação com os controles. </li></ol></li></ol>

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<li>Barisone, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+MXD3+in+proliferation+of+DAOY+human+medulloblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells.</a> PloS One. 7, e38508(2012).</li>
<li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112, 193-205 (2003).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A FFA fornece um método rápido e fácil de avaliar a transformação maligna in vitro. É passível de exibição de um número relativamente grande de genes candidatos e seus requisitos técnicos modestos torná-lo rentável. Além disso, dois ou mais genes pode ser co-expressa (por vezes referido como um ensaio de &quot;cooperação&quot;) para avaliar o potencial tumorigénico de combinação. As vantagens deste ensaio contar com a sua técnica simples, a sua facilidade de quantificação e a sua relativamente curto tempo de ro...

As células tumorais podem ser distinguidos dos seus homólogos normais por uma ampla gama de alterações, a partir de padrões de expressão de genes para epigenomics a alterações morfológicas e proliferativas. Entre estes últimos, redução da dependência do soro, a perda de contacto (densidade) de inibição, a aquisição de proliferação independente de ancoragem e, em última análise, a capacidade de formar tumores quando injectadas em animais são indicadores úteis, mensuráveis ​​de transformação maligna 3. Vários in vitro e em ensaios in vivo têm sido desenvolvidos para a transformação celular. Os ensaios in vitro por objectivo a identificação e medindo alterações na morfologia da cultura (ensaio de formação de foco), dinâmica de cultura (taxa de crescimento, a densidade de saturação) e o factor de crescimento (crescimento em soro reduzido) ou ancoradouro (crescimento em agar mole) requisitos. O padrão de ouro para a determinação do carácter maligno de um tipo de célula permanece a formação de tumores (xenoenxertos) em animais experimentais. No entanto, tele custa e comprimento de estudos in vivo nem sempre fazê-los justificável como uma primeira etapa de validação ou screening de oncogenes candidatos. Embora nenhum ensaio in vitro fornece uma avaliação definitiva do potencial oncogénico de um gene, que não fornecem informações sobre potencial oncogénico que pode afinar futuro em estudos in vivo. Um dos sistemas mais utilizados para a avaliação do potencial oncogênico in vitro é o foco Formação Ensaio 2. Esta abordagem baseia-se na utilização de NIH 3T3 de fibroblastos de rato, uma linha de células não transformadas que mostram forte inibição de contacto. A sobre-expressão de um oncogene resulta em perda do crescimento dependente de densidade; As células transformadas podem então crescer em múltiplas camadas, formando &quot;focos&quot;, facilmente visualizado contra a monocamada de células não transformadas fundo. O Ensaio de formação de focos, em seguida, mede a capacidade de um oncogene candidato para induzir a transformação maligna, como evidenciado pela perda de contacto Inibiç como um fenótipo mensurável. O FFA tem sido utilizado para avaliar a sobre-expressão por transformação de proteína-quinases (por exemplo, Src 4, 5 BRAF), factores de transcrição (por exemplo, N-myc 6) receptores, L-acoplados à proteína (por exemplo, P2RY8 7) e GTPases (p.ex. , Ras 1), entre outros. A relativa facilidade deste ensaio faz-se uma boa escolha que vai proporcionar uma resposta rápida e visualmente claro para se sobre-expressão do gene é suficiente para transformar células de fibroblastos NIH 3T3 de rato in vitro. O FFA descrito neste protocolo utiliza a linha celular de empacotamento Plat-E 8, o qual fornece as proteínas virais de empacotamento, e o vector retroviral pBABEpuro 9 (Addgene plasmídeo 1764) para a produção de retrovírus. Após transfecção com a construção pBABEpuro contendo o gene de interesse, a linha celular Plat-E vai produzir retrovírus ecotrópico que pode ser utilizado para infectar as células NIH 3T3. Tseu método de entrega gene viral é mais eficiente do que os métodos de transfecção química tradicionais e oferece uma maneira de expressar de forma sustentável o gene 10. Uma vez incorporado no genoma das células NIH 3T3, a sobre-expressão do gene de interesse é impulsionado pelo repetições terminais longas virais (LTR) 11. Esta expressão constante pode ser usado para determinar se o gene de interesse tem actividade oncogénica, tal como medido pela formação de focos, sobre as células NIH 3T3.

<table><tbody><tr><td>pBABE-puro vetor</td><td>Addgene</td><td>Plasmid 1764</td><td>vetor de clonagem</td></tr><tr><td>Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic</td><td>Cell Biolabs, Inc.</td><td>Linha celular RV-101</td><td>para produção viral</td></tr><tr><td>NIH 3T3 Linha celular murina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93061524</td><td>linha celular para ensaio de formação de foco</td></tr><tr><td>Seringa de ponta BD Luer-Lok de 10 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td>reagente de produção viral</td></tr><tr><td>0,45 &mu; m Filtro de Seringa Puradisc</td><td>Reagente de produção viral</td>de polietilenonimina (PEI) <td>da Whatman</td><td>6750-2504Polysciences</td></tr><tr><td></td><td>, Inc.</td><td>23966-2</td><td>reagente de transfecção de células</td></tr><tr><td>Infecção de Polybrene / Reagente de transfecção</td><td>EMD Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td>reagente de transfecção de células</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Fisher Scientific</td><td>C581-25</td><td>reagente de coloração de células</td></tr><tr><td>Plasmid Plus Midi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12945</td><td>purificação de plasmídeos Placas</td></tr> de <tr><td>cultura de tecidos BD Falcon</td> BD <td>Biosciences</td><td>353003</td><td>Suprimentos para cultura de células</td></tr><tr><td>Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>meio de cultura celular</td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>suprimentos de cultura de células</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Meio de Soro Reduzido</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>meio de cultura de células</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>meio de cultura de células</td></tr></tbody></table>

concentre formação: um ensaio celular para determinar o potencial oncogénica de um gene

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

A transformação maligna das células está tipicamente associada ao aumento da proliferação, perda da inibição de contato, aquisição de potencial de crescimento independente de ancoragem e capacidade de formar tumores em animais experimentais1. Nas células NIH 3T3, a via de transdução de sinal Ras é conhecida por desencadear muitos desses eventos, o que é conhecido como transformação Ras. A introdução de um gene superexpresso em células NIH 3T3 pode promover transformação morfológica e perda de inibição de contato, o que pode ajudar a determinar o potencial oncogênico desse gene de interesse. Um ensaio que fornece um método direto para avaliar um aspecto do potencial transformador de um oncogene é o Ensaio de Formação de Foco (FFA)2. Quando as células NIH 3T3 se dividem normalmente em cultura, elas o fazem até atingirem uma monocamada confluente. No entanto, na presença de um oncogene superexpresso, essas células podem começar a crescer em focos1 densos e multicamadas que podem ser visualizados e quantificados por cristal violeta ou coloração Hema 3. Neste artigo, descrevemos o protocolo FFA com transdução retroviral do gene de interesse em células NIH 3T3 e como quantificar o número de focos por meio de coloração. A transdução retroviral oferece um método mais eficiente de entrega de genes do que a transfecção, e o uso de um retrovírus murino ecotrópico fornece um controle de biossegurança ao trabalhar com potenciais oncogenes humanos.

MXD3 é um fator fundamental zipper hélice-alça-hélice leucina (bHLHZ) de transcrição que é um membro da MYC / MAX / network MAD. Ele é um membro da família atípica MAD 13-15, e tem sido referida como estando envolvida na carcinogénese 16,17. Quando comparado com pBABEpuro (controlo negativo) e MYC (controlo positivo), os pratos de NIH 3T3 que sobre-expressas foi MXD3 tinham significativamente menos focos (Figura 1A). Os dados na Figura 1B foram recolhidos a partir ...

O ensaio de formao de foco fornece um método simples para avaliar o potencial de transformação de um oncogene candidato.

Concentre Formação: Um Ensaio Celular para Determinar o Potencial oncogénica de um Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar o ensaio de formação de focos em linhagens celulares de fibroblastos de camundongo, utilizando um retrovírus para determinar o potencial oncogênico de um gene. Isso é realizado primeiramente clonando a sequência do gene de interesse em um vetor retroviral. O segundo passo é produzir partículas retrovirais utilizando o vetor viral e células embaladoras PLA e.Em seguida, o retrovírus é utilizado para infectar células de fibroblastos murinos NIH 3T3 com o objetivo de avaliar o potencial transformante do gene de interesse. O passo final consiste em permitir que as células NIH 3T3 se dividam por duas a três semanas, seguido de coloração com violeta cristal para quantificar o número de focos formados. Em última análise, o ensaio de formação de focos é usado para demonstrar se a superexpressão de um gene de interesse é suficiente para induzir crescimento independente da densidade em células de fibroblastos murinos.Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área da biologia do câncer, como a triagem do potencial oncogênico de um gene. Para começar, prepare o vetor viral conforme descrito no protocolo textual. Em seguida, estabeleça culturas de plat E a partir de células congeladas descongelando rapidamente as células plat E em banho-maria a 37 graus Celsius e, depois, transferindo-as para um tubo cônico de 15 mililitros.Adicione lentamente nove mililitros de meio PLA E ao tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue o tubo a 180 ×g por cinco minutos e descarte o sobrenadante. Re-suspenda as células com 10 mililitros de meio plat E e transfira para uma placa de cultura de 10 centímetros.Em seguida, incubar as células em um incubador a 37 graus Celsius com 5% de CO2 até que atinjam de 80 a 90% de confluência. Realizar a repicagem das células aspirando primeiro o meio, depois lavar as células uma vez com PBS antes de adicionar dois mililitros de tripsina 0,05% com EDTA e incubar por um minuto à temperatura ambiente, destacando as células com leves batidas com o dedo. Em seguida, adicionar 10 mililitros de meio plat E e transferir a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros.Centrifugue o tubo como anteriormente e ressuspenda as células com 10 mililitros de meio plat E. Em seguida, semeie 2 milhões de células por placa de cultura de 10 centímetros utilizando meio plat E sem quaisquer antibióticos e deixe as células incubarem durante a noite. No dia seguinte, transfira 300 microlitros de óptimo para um tubo micro de 1,5 mililitro.Adicione 27 microlitros de amina de polietileno ao tubo preparado com Optum. Misture suavemente batendo com o dedo e incube por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione nove microgramas de DNA plasmidial de grau para transfeção ao tubo, misturando suavemente em vórtex e incube por 15 minutos à temperatura ambiente.Em seguida, adicione a mistura gota a gota na placa de cultura antes da incubação durante a noite. No dia seguinte, aspire o meio contendo o reagente de transfeção e adicione 10 mililitros de meio fresco para placa E antes de retornar as células ao incubador para estabelecer culturas de NIH 3T3. Primeiro, descongele rapidamente as células em banho-maria a 37 graus Celsius e transfira para um tubo de 15 mililitros.Adicione lentamente nove mililitros do meio NIH três, T três às células, centrifugue o tubo a 180 vezes G durante cinco minutos e descarte o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda as células com 10 mililitros do meio NIH três, T três e transfira para uma placa de cultura de 10 centímetros. Incube as células em uma estufa a 37 graus Celsius com 5% de CO2, mantendo-as subconfluentes, pois a frequência de transformação espontânea aumenta. Uma vez que a cultura atinja confluência, após atingir uma densidade de três vezes 10 à quinta NIH/3T3 por placa de 10 centímetros, incubar durante a noite para infecção no dia seguinte. No dia seguinte, colete o sobrenadante retroviral da placa de Plat E utilizando uma seringa descartável de 10 mililitros, filtre-o através de um filtro de membrana de nylon com porosidade de 0,45 mícrons e transfira-o para um tubo de 15 mililitros. Adicione 10 mililitros de meio fresco de Plat E às células antes de devolvê-las ao incubador.Em seguida, aspire o meio do recipiente de células NIH 3T3 a serem infectadas e adicione cinco mililitros de meio regular NI H três T três e cinco mililitros de sobrenadante filtrado contendo vírus. A seguir, adicione polibrena ao recipiente. Adicione uma concentração de seis microgramas por mililitro.Incube as células durante a noite antes de repetir os passos de infecção para uma segunda rodada de infecção. Após a infecção, substitua o vírus pelo meio regular IH three T three. Deixe as células IH three T three crescerem por dois a três dias, substituindo o meio conforme necessário para a coloração com violeta de cresilo.Aspire o meio NIH três T três e coloque as placas sobre gelo. Lave as placas duas vezes com PBS gelado. Fixe as células com metanol gelado por 10 minutos.Em seguida, retire as placas do gelo e aspire o metanol. Adicione três mililitros de solução de violeta cristal a 0,5% preparada em metanol a 25% e incube as placas por cinco minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, aspire a solução de violeta cristal e enxágue cuidadosamente a placa com água Milli Q até que não saia mais cor no enxágue.Deixe as placas secarem descobertas durante a noite sobre uma bancada. Após a secagem das placas, utilize uma régua para medir as focos e conte aqueles com diâmetro maior que cinco milímetros. O número MXD três é um fator de transcrição do tipo helix-loop-helix com zíper de leucina, que é um membro atípico da família MAD, e tem sido relatado como envolvido na carcinogênese quando comparado ao controle negativo e ao controle positivo.As placas de NIH três T três nas quais MXD três foi superexpresso apresentaram significativamente menos focos. Os dados foram coletados a partir de múltiplos experimentos para determinar a significância, e as mesmas tendências foram observadas neste ensaio. Os resultados sugerem que MXD três não funciona como um oncogene após este procedimento.Outros métodos, como o ensaio de formação de focos com combinações de genes, a proliferação em agarose macia e a análise do ciclo celular, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre a avaliação do papel de um gene de interesse na patogênese da oncogênese.

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