Plano Monte imagem de Rato pele e sua aplicação à análise do folículo piloso Padronização e Sensorial Axon Morfologia

O objetivo geral deste procedimento é visualizar estruturas da pele, como folículos pilosos e terminações nervosas, em sua totalidade, sem seccionar fisicamente a amostra. Isso é realizado primeiramente coletando pele de diversas regiões do corpo, incluindo a pata traseira e a cauda. O segundo passo é achatamento e limpeza das amostras de pele.

Em seguida, as amostras de pele são submetidas à fixação apropriada. O passo final é realizar imunomarcação ou histoquímica nas amostras de pele. Por fim, a obtenção de imagens com um microscópio estereoscópico ou confocal é utilizada para visualizar a geometria de várias estruturas da pele.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o preparo de cortes hormonais epidérmicos, é que ela pode ser aplicada à pele em qualquer local do corpo e não requer a separação da epiderme da derme. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no estudo da polaridade celular em plantas. Como a geometria bidimensional da pele e o arranjo peculiar dos folículos pilosos tornam a pele um sistema ideal para estudar esse processo, este método não apenas pode fornecer informações sobre a polaridade celular em plantas, mas também pode ser aplicado para investigar outros aspectos do desenvolvimento da pele, como a definição de tipos de neurônios somatossensoriais com base na visualização direta de atos individuais em morfologias superiores.

A demonstração visual deste método é fundamental, pois a dissecação da pele de algumas regiões, como os pés e a cauda, é difícil de aprender, sendo importante nivelá-las perfeitamente e evitar rugas e estiramento excessivo. Nesta demonstração, a pele dorsal será coletada de três camundongos eutanasiados com isoflurano. Utilizando lâminas, faça um corte horizontal a partir da base da cauda ao longo de cada flanco, passando pelo lado dorsal da base de cada membro, seguindo lateralmente até as orelhas e terminando no nariz.

Retire suavemente a pele do tecido subjacente, avançando de posterior para anterior, segurando a pele entre os dedos com luvas para que não seja pinçada pela pinça. Ao descamar a pele ao nível das orelhas, corte primeiro as orelhas com uma tesoura e prossiga especialmente devagar, pois a pele pode rasgar nesse local. A partir desse ponto, posicione a pele com a face interna voltada para cima.

Fixe a pele ao S Guard com cerca de 20 alfinetes entomológicos espaçados uniformemente ao longo da periferia. Não estique excessivamente a pele. Cubra a pele com 10 a 20 mililitros de PBS utilizando pinças anguladas ou curvas.

Disseque a gordura associada à pele e o tecido conjuntivo. Posicione a extremidade pontiaguda da pinça horizontalmente para minimizar o risco de perfuração da pele. Remova quaisquer bolhas de ar aprisionadas sob a pele rolando suavemente um aplicador de algodão sobre a superfície da pele.

O próximo passo é fixar a pele do espécime. Se a pele for utilizada para imagem de melanina ou histoquímica de fosfatase alcalina, adicione 20 mililitros por placa de cigarro de 10 centímetros de PFA a 4% recém-preparado em PBS ou formalina tamponada a 10%. Se a pele for utilizada para imunomarcação ou visualização de uma queratina transgênica, KRT 17 GFP, adicione 20 mililitros por placa de cigarro de 10 centímetros de PFA a 2% recém-preparado em PBS, gire suavemente durante a noite em câmara fria e, no dia seguinte, lave em PBS por mais de 10 minutos.

O procedimento de histoquímica de fosfatase alcalina não será demonstrado neste vídeo. Para a imagem de melanina, desidrate a pele por meio de uma série de etanol progressiva por um dia em cada etapa, com rotação horizontal suave à temperatura ambiente. Três dias depois, remova os tecidos conjuntivos residuais da pele desidratada com a pele em etanol a 100%.

Remova os alfinetes de inseto e transfira a pele para um recipiente de vidro com diâmetro de 10 centímetros. Para o sucesso deste procedimento, a amostra de pele deve ser coletada como uma peça intacta e achatada perfeitamente. Coloque duas lâminas de microscópio de vidro sobre a pele para aplainá-la e impedir que se enrole.

Adicione 20 mililitros de benzoato de benzila e álcool benzílico ou BBBA, que endurecerá rapidamente o tecido nas próximas horas. Levante as lâminas da pele por alguns segundos para permitir que o BBBA escorra sobre a pele. A pele dos pés para a análise do padrão dos folículos capilares é tipicamente dissecada de P1 a P8 dos animais. Após a eutanásia, corte os pés acima da articulação do tornozelo e faça um único corte reto ao longo da superfície ventral através das solas dos pés.

Retire cuidadosamente a pele do tecido subjacente, procedendo de forma proximal para distal. Corte os dedos para soltar a pele e fixe-a em uma tábua com a superfície interna voltada para cima. Há pouco tecido conjuntivo no pé.

Transgênico da pele. A pele KRT17 GFP está agora pronta para a aquisição de imagens para análise de melanina. Fixe e processe a pele conforme demonstrado anteriormente para a pele dorsal. Após a eutanásia do animal P21, remova os pelos esfregando removedor de pelos.

Espalhe o gel sobre a superfície da pele com o dedo indicador e o polegar enluvados e aguarde 10 minutos. Lave a superfície da pele com água da torneira. Posteriormente, dissecar e fixar a pele do pé ao suporte S conforme mostrado anteriormente.

Fixe com 1% P-F-A-P-B-S por 30 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, lave com PBS. Para preparar a pele da cauda, faça um corte circular ao redor da base da cauda e, depois, um corte longitudinal que percorra todo o comprimento da cauda ao longo de sua face ventral. Retire a pele da cauda começando pela ponta, segurando firmemente a ponta do osso da cauda e/ou o tecido conjuntivo com um par de pinças e a pele com um segundo par de pinças.

Fixe a pele da cauda ao suporte de SIL para análise da distribuição de melanina e orientação dos folículos pilosos. Fixe e processe a pele conforme demonstrado para a pele dorsal para análise das glândulas sebáceas antes da fixação. Corte a pele da cauda em uma série de segmentos com cerca de 0,5 a um centímetro de comprimento e incube os pedaços de pele em PBS com EDTA 5 milimolar durante a noite a 37 graus Celsius.

Para enfraquecer a adesão entre derme e epiderme no dia seguinte, desprenda suavemente a epiderme da derme. Fixe a interface da epiderme voltada para cima no S guard e fixe em PFA a 4% em PBS por uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, lave a epiderme com PBS e cora com vermelho de óleo O conforme descrito no texto do protocolo.

Um microscópio estereoscópico é utilizado para imaginar peles de patas dorsais ou caudas submersas em BBBA, achatadas sob a lâmina de vidro e ainda dentro do recipiente de vidro. Esta abordagem minimiza a contaminação do microscópio por BBBA. Ilumine o recipiente por baixo para minimizar a variação espacial na intensidade da luz ao longo do campo de visão.

Eleva o recipiente de vidro a uma altura de cerca de 10 centímetros acima da superfície de trabalho padrão do microscópio estereoscópico e coloque uma placa de plástico ou vidro difusora sobre a fonte de luz. Quando a obtenção de imagens for concluída, devolva a pele ao etanol a 100% para armazenamento de longo prazo a menos 20 graus Celsius. Para preparar a pele corada para fosfatase alcalina para a obtenção de imagens, coloque-a entre duas lâminas de vidro do tipo utilizado para géis de proteínas pequenas.

Tendo o cuidado de evitar a introdução de bolhas de ar entre as placas e a pele. Remova cuidadosamente qualquer excesso de BBBA com uma toalha de papel. Coloque este sanduíche de placa-pele-placa sobre a platina de um microscópio.

Utilize iluminação em campo claro ou contraste de fase diferencial com uma objetiva de 10 x e passos Z de dois ou cinco micrômetros. Use uma platina XY mecanizada para capturar uma montagem de imagens XY que são unidas para criar um único conjunto de dados tridimensional em escala de cinza. Realize o rastreamento semi-automatizado de arborizações axônicas com qualquer um dentre diversos pacotes de software.

A imagem em campo claro de preparações planas da pele pode ser utilizada para visualizar uma única arborização sensorial cutânea, mostrada aqui com sua imagem rastreada. A imagem em campo claro também permite a visualização dos padrões dos folículos pilosos com base na pigmentação por melanina. Essas imagens mostram pele do dia um de camundongos selvagens e de camundongos com nulificação do frizzled seis, e pele do dia sete de camundongos com nulificação do frizzled seis.

A imagem obtida por microscopia de luz de preparações planas da pele pode ser utilizada para definir a geometria das glândulas sebáceas e dos folículos pilosos. A pele visualizada com vermelho de óleo mostra glândulas sebáceas desorganizadas em um camundongo com nulagem do frizzled seis, em comparação com um pé dorsal de tipo selvagem. A pele coletada de camundongos de tipo selvagem e com nulagem do frizzled seis, portadores de uma queratina GFP marcada KRT 17 GFP e corada com vermelho de óleo.

O Red O revelou que a pele com gene derrubado possui um redemoinho capilar em seu centro. A imagem confocal de preparações planas da pele também pode definir a geometria dos folículos pilosos visualizados com GFP KRT17 e imunomarcação anti-GFP e eretor pili. Músculos oculares visualizados com imunomarcação anti-actina de músculo liso.

Os agrupamentos de células de Merkel são visualizados com anticorpo anti-citoceratina 8 ou com captação do corante AM 1-43, e seu folículo piloso central é visualizado com KRT 17 GFP. Em vez de estarem abertos em direção ao anterior, os agrupamentos de células de Merkel em camundongos knockout para Frizzled seis formam um círculo fechado. Uma vez dominada, uma dissecação pode ser realizada em aproximadamente 30 minutos, se realizada corretamente, e diferentes preparações podem ser feitas em alguns dias a uma semana. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como coletar pele de várias regiões do corpo e como prepará-las para visualizar diferentes estruturas cutâneas no formato de pele inteira. Imagens de espessura total e alta resolução de estruturas cutâneas podem ser obtidas por microscopia óptica convencional e por microscopia confocal.

Não se esqueça de que trabalhar com paraformaldeído e BBBA pode ser extremamente perigoso. A inalação de vapores deve ser minimizada mantendo essas soluções em recipientes fechados, e o contato com a pele deve ser evitado. Não permita que o BBBA entre em contato com plástico.