Name: Cultura primária de neurônios dopaminérgicos mouse (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Aprenda a gerar culturas primárias de neurônios dopaminérgicos a partir de mesencéfalo embrionário de mouse. Este protocolo detalhado permite estudar vulnerabilidade neuronal e mecanismos da doença de Parkinson.

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Apoiado por doações do CNRS e do INSERM. PM agradece o apoio da Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC reconhece o apoio da Fondation de France.

Os ratos utilizados neste trabalho foram atendidas e tratadas de acordo com as diretrizes do Conselho da União Europeia (86/609 / UE) para o uso de animais de laboratório. 1 Preparação de soluções necessárias <ol><li> Soluções de Stock <ol><li> 10x de poli-L-ornitina (PLO) Solução: pesam-se 10 mg de bromidrato de PLO (peso molecular = 30,000-70,000) e dissolver em 70 ml de água estéril. Filtra-se a solução com uma seringa de filtro de 0,2 um, alíquota, e armazenar a -20 ° C. </li><li> 30% Solução de Glucose: pesam-se 30 g de D (+) - glicose e dissolve-se em água estéril para um volume total de 100 ml. Filter, alíquota, e armazenar a 4 ° C. </li><li> Meio de Eagle Modificado de 5x Dulbecco (DMEM) / Mistura nutriente F-12 de Ham: pesam-se 6 g de DMEM / Ham F-12 em pó e dissolve-se em água estéril para um volume total de 100 ml. Filter, alíquota, e armazenar a 4 ° C. </li><li> 7,5% de Bicarbonato de Sódio (NaHCO3) Solutiem: pesam-se 7,5 g de NaHCO 3 e dissolve-se em água estéril para um volume total de 100 ml. Filter, alíquota, e armazenar a 4 ° C. </li><li> Solução 1 M de HEPES: Pesar 23,8 g de HEPES e dissolvem-se em água estéril para um volume total de 100 ml. Filter, alíquota, e armazenar a 4 ° C. </li><li> 70% (v / v) de etanol: Diluir 70 ml de etanol absoluto, com 30 ml de água estéril. </li></ol></li><li> Salina tamponada com fosfato com glicose e antibióticos (PBS-GAB): adicionar 10 ml de solução de glucose a 30% e 5 ml de solução de penicilina-estreptomicina a 500 ml de fosfato de Dulbecco tamponado salino. Armazenar a 4 ° C. </li><li> De soro fetal bovino inactivado (ifbs): Descongelar soro bovino durante a noite a 4 ° C e inactiva a 56 ° C durante 30 min. Alíquota em 50 ml e armazenar a -20 ° C. </li><li> Meio de Cultura: Em água estéril, misturar sucessivamente 40 mL de 5x DMEM / Ham F12-, 1 ml de HEPES 1 M, 2 ml de 200 mM de L-glutamina, 2 ml de penicilina-estreptomicina, 4 ml de 30% de glicose umaº 3 ml de 7,5% de NaHCO 3 para um volume final de 180 ml. Filtra-se e usar o mesmo dia. </li><li> Hormônio Mix <ol><li> Preparar 180 ml de meio de cultura. Dissolve-se 200 mg de apo-transferrina neste meio. </li><li> Pesar 50 mg de insulina e dissolver em 2 ml de 0,1 M de HCl. Adicionar lentamente 8 ml de água estéril, enquanto se mistura com cuidado. Dilui-se esta solução no meio de cultura. </li><li> Pesar 19,3 mg de dicloridrato de putrescina e dissolver em 10 ml de água estéril. Adicionar a solução de 10 ml à mistura de hormona. </li><li> Prepara-se uma solução de selenito de sódio 3 mM em água estéril e uma solução 2 mM de progesterona em etanol absoluto. Adicionar 20 mL de cada solução para o mix de hormônios. </li><li> Filtrar a mistura hormonal, alíquota em 10 ml e armazenar a -20 ° C. </li></ol></li></ol> 2 Preparação de Pratos e Instrumentos Cultura <ol><li> FBS revestimento das placas de cultura: O dia antes da dissecção, preparar 180 ml de meio de cultura. Adicionar 10 ml deifbs para 90 ml de meio de cultura. Adicionar 300 ul / poço de meio de cultura / 10% ifbs em pré-revestidas placas de 24 poços com poli-D-lisina. Incubar durante a noite a 37 ° C. Armazene a mídia restante (com e sem OIF) a 4 ° C. </li><li> Esterilizar os instrumentos e pipetas Pasteur. Reúna os equipamentos listados na tabela de materiais, bem como uma capa de Classe II de fluxo laminar e uma incubadora de CO 2. </li></ol> 3. Dissection of Mouse Mesencéfalo <ol><li> Sacrifique um rato grávida E13.5 (de acordo com as diretrizes institucionais). Limpe o abdômen do mouse com etanol 70% e abrir a parede abdominal. Recolha os cornos uterinos, abri-los usando uma tesoura delicada, dissecar cada embrião dos cornos uterinos, e remover as membranas amnióticas. Coloque os embriões em uma placa de Petri 100 milímetros contendo PBS estéril-GAB e lavá-los por transferência em 3 sucessivos banhos idênticos usando uma pinça. Para dissecção, coloque os embriões por 3 em um 60 milímetros placa de Petri estéril. </li><li> MovÊ O prato final Petri sob o microscópio estereoscópico. Não decapitar os embriões. Com uma tesoura Vannas, extirpar os cérebros. <ol><li> Cuidadosamente retire e descarte as regiões das letras e do rombencéfalo. Para o lado rostral, cortada perto do tálamo, para o corte lateral caudal na região do istmo, remover o colículo superior. </li><li> Uma vez que o mesencéfalo ventral é isolado, retire cuidadosamente meninges usando uma pinça ultrafinas. Recolher os segmentos dissecados, sem as meninges, em um tubo estéril 13 ml cheio de PBS-GAB. </li></ol></li><li> Limpe o tubo contendo o mesencephala exaustivamente com etanol 70% e trazê-lo sob o capô. </li></ol> A dissociação 4. celular <ol><li> Lavar mesencephala 3x com PBS estéril-GAB. Permitir fragmentos do cérebro para resolver entre cada lavagem e evitar a ruptura do tecido. Após a última lavagem, retirar cuidadosamente, tanto quanto possível solução e incubar segmentos cerebrais em 3 ml de tripsina / EDTA durante 15 minutos a 37 ° C numaIncubadora de CO 2. </li><li> -Polonês fogo as pipetas de Pasteur para maximizar a sobrevivência dos neurónios como a extremidade de uma pipeta de vidro não polido é afiado e pode danificar as células, durante os passos de dissociação. Reduzir ligeiramente o diâmetro da extremidade (+ 0,5 mm) da pipeta de Pasteur, enquanto fogo polimento-lo. </li><li> Remova cuidadosamente tanta solução / EDTA tripsina possível e adicionar 10 ml de meio de cultura / 10% OIF. Segmentos cerebrais Lavar 3x com meio de cultura / 10% OIF. </li><li> Utilizando a pipeta de Pasteur polida ao fogo, começam a dissociação de mesencephala em 6 ml de meio de cultura / 10% ifbs. Triturar 10x (evitar bolhas de ar), deixe os pedaços para resolver, em seguida, recolher o meio em um novo tubo estéril 13 ml. </li><li> Adicionar 6 ml de meio de cultura, repetir o passo anterior, uma vez e recolher o meio contendo células dissociadas no mesmo tubo de 13 ml. </li><li> Centrifugar células a 160 g por 5 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em meio de cultura suplementado com10% de mistura de hormônio. </li></ol> 5. celular chapeamento <ol><li> Contar as células em suspensão numa célula de Malassez e ajustar o volume do meio a uma concentração de 600.000 células / ml. Cerca de 1,7 milhões de células podem ser obtidas a partir de um mesencéfalo do rato. </li><li> Remover FBS contendo meio de revestimento de placas de 24 cavidades e adicionar a cada cavidade 1 ml da suspensão de células (600.000 células / poço, 2-4% das células TH +). </li><li> Incubar a placa a 37 ° C e 5% de CO 2/95% ar. Nenhuma mudança de meio é necessário. Neurônios dopaminérgicos estão maduros depois de cerca de 5-7 dias in vitro (expressão consistente do transportador de dopamina). Manter as células em cultura até 15 dias sem substituição médio. </li></ol> 6. Imunofluorescência Protocolo <ol><li> A limpeza das Lamelas <ol><li> O dia antes da dissecação, adicionar 10 ml de HCl 1 M em uma placa de Petri. Colocar a superfície dos líquidos 12-15 lamelas de vidro e esperar 15 minutos. </li><li> Afundar a tampaescorregar para o líquido e esperar 15 min. </li><li> Remover HCl e lavar 3x com água. </li><li> Lavam-se as lamelas com etanol puro rapidamente uma vez, em seguida, adicionar etanol puro para o prato e para aguardar 30 minutos. </li><li> Sob o capô, remova lamelas limpas a partir de etanol e adicionar uma lamela por poço de 12 poços da placa de cultura de células usando uma pinça esterilizada. </li><li> Lavar lamelas duas vezes com água estéril (1 ml / poço). Em seguida, lavá-los uma vez com PBS estéril. </li></ol></li><li> Revestimento das Lamelas <ol><li> Remover PBS e adicionar 500 uL / ​​poço de 2x PLO (diluído em PBS). Incuba-se durante 4 horas a 37 ° C na incubadora de CO 2. </li><li> Remover a solução de PLO e lavar 3x com PBS estéril. </li><li> Remover PBS e adicionar 500 uL / ​​poço de 20% ifbs / 1 g / ml de laminina. Incubar durante a noite a 37 ° C na incubadora de CO 2. </li></ol></li><li> Plaqueamento das células de Imunofluorescência <ol><li> Remover o meio de revestimento a partir de placas de 12 poços. </li><li> Adicionar 900,000 células / cavidade em 2 ml de volume e crescer as células a 37 ° C na incubadora. As células podem ser mantidas em cultura 15 dias sem substituição médio. </li></ol></li><li> Imunocoloração <ol><li> Remover o meio de placas de 12 poços e lava-se com 500 ul / poço de DMEM pré-aquecido a 37 ° C. </li><li> Adicione 500 ^ l / poço de DMEM pré-aquecido a 37 ° C, em seguida, adicionar cuidadosamente 160 ul / poço de 8% de paraformaldeído (PFA, 2% de concentração final) e incubar durante 10 min a 37 ° C. </li><li> Remover PFA e lavar 3x com PBS / 0,1 M de glicina durante 10 min. </li><li> Remover PBS, adicionam-se 300 ul / poço de PBS / 0,05% de Triton X-100/20% de soro de cabra e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Remover o meio, adicionam-se 300 ul / poço de anticorpo primário diluído em PBS / 0,05% de Triton X-100/1% de soro de cabra e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente. Os anticorpos primários que podem ser utilizados para a detecção de neurónios dopaminérgicos e caracterização da cultura estão indicados na tabela Materiais. Mantenha1 bem sem anticorpo primário para avaliar a base dos diferentes anticorpos secundários. </li><li> Remover o meio e lava-se 3x com PBS / 0,2% de gelatina durante 10 minutos. </li><li> Remover o meio, adicionam-se 300 ul / poço de anticorpo secundário diluído em PBS / 0,05% de Triton X-100/1% de soro de cabra e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente, no escuro. Anticorpos secundários utilizados são indicados na tabela de Materiais. </li><li> Remover o meio e lava-se 3x com PBS / 0,2% de gelatina durante 10 minutos. </li><li> Remover o meio e lava-se 3x com PBS. </li><li> Montar as lamelas do lado vidro desliza célula para baixo em uma gota de Vectashield. Mantenha as lâminas à temperatura ambiente durante a noite para deixar a montagem meio seco, em seguida, armazená-los, a 4 ° C. </li><li> Adquirir imagens usando um microscópio confocal ou um microscópio de contraste de fase equipado para epifluorescência. Imagens representativas foram adquiridos com um microscópio confocal Leica SP2 UV. </li></ol></li></ol>

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<li>Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pitx3+is+required+for+development+of+substantia+nigra+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).</li>
<li>Ferri, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxa1+and+Foxa2+regulate+multiple+phases+of+midbrain+dopaminergic+neuron+development+in+a+dosage-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner.</a> Development. 134, 2761-2769 (2007).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este protocolo apresenta os procedimentos e reagentes necessários para a preparação de uma cultura primária de neurónios do mesencéfalo do rato embrionário e o procedimento para a detecção de imunofluorescência neurónios dopaminérgicos. As etapas críticas do processo são a dissecção dos embriões ea dissociação mecânica dos fragmentos cerebrais coletados. Instrumentos de dissecção de alta qualidade ajuda a dominar a técnica de dissecação. Neurónios DA constituem uma pequena percentagem do mesencéfalo. Assim, a recolha da...

A dopamina, um dos neurotransmissores cerebrais essenciais 1,2, é libertada principalmente por dopaminérgicos do mesencéfalo (AD) neurónios. A maioria dos neurónios DA residir na parte ventral do mesencéfalo 2-6. Esquematicamente, neurônios DA mesencéfalo podem ser divididos em três sistemas distintos de projeção anatômica e funcionalmente: mesostriatal, mesolímbico, e caminhos mesocorticais 2,5. A via nigroestriatal está envolvida no comportamento do motor, as vias mesolímbica desempenhar um papel importante no reforço, a motivação, aprendizagem e, ao passo que as vias dopaminérgicas que se projectam para o córtex pré-frontal estão implicados na cognição 2. Neurônios DA estão envolvidos em diversas doenças neurológicas humanas, como a esquizofrenia, déficit de atenção, transtorno de hiperatividade, e doença de Parkinson (DP) de 2,4. A DP é caracterizada por uma degeneração progressiva e selectiva dos neurónios DA ligar substantia nigrapars compacta (SNC) para o estriado. A perda de Nigro-estriatal da neurônios resulta na depleção de dopamina no corpo estriado grave que é responsável de os sintomas motores da DP (bradicinesia, tremor de repouso, rigidez e) 7. A causa inicial da DP idiopática não foi estabelecida e os tratamentos atuais são apenas sintomático, com o objetivo de restaurar o nível de dopamina no corpo estriado. A droga mais prescrita é L-Dopa (Levodopa), o precursor natural da dopamina. Embora a administração de Levodopa compensa a perda de dopamina por um certo tempo, complicações motoras ocorrer após tratamentos de longa duração (discinesia e liga / desliga estados) 8,9. Pesquisa sobre neurônios dopaminérgicos e PD está em progressão constante e estão sendo feitos intensos esforços para desenvolver tratamentos baseados em transplante de células, a terapia gênica, ou agentes neuroprotetores 10,11. No entanto, um grande problema permanece não elucidado: o que é a causa da extrema vulnerability de neurônios DA? Parte da resposta pode ser encontrada na actividade dos neurónios DA. A redução da atividade elétrica e da excitabilidade dos neurônios de DA parece aumentar sua propensão a se degenerar 12. No entanto, a complexidade do PD patogênese requer mais estudos para identificar os mecanismos envolvidos na degeneração de neurônios DA 13-15. As culturas primárias são especialmente relevantes para estudar propriedades DA neurônio 16-19 e desafiar esses neurônios para várias tensões para avaliação de agentes neuroprotetores 20-24. Modelos de rato de cultura são os mais frequentemente utilizados, como a dissecação do mesencéfalo de embriões de rato é mais fácil, em comparação com o rato, e maiores quantidades de neurónios podem ser obtidos na ratazana. No entanto, a geração de modelos transgênicos da doença 25 aumentou consideravelmente o interesse da comunidade neurocientista para culturas primárias do rato 26-29. Embora a cultura da prepared de animais recém-nascidos podem ser utilizados, é preferível prepará-los a partir de embriões na fase de pós-mitótico (E13.5 mesencéfalo de neurónios), quando os neurónios mantiveram a sua capacidade de se diferenciar. O protocolo a seguir apresenta os neurónios do mesencéfalo isoladas em cultura primária a partir de embriões de rato (E13.5), as quais são as mais difíceis de preparar. Nomeadamente, é proporcionado um protocolo utilizando meio de cultura isento de soro para uma melhor reprodutibilidade. As duas etapas mais críticas na preparação cultura (dissecção e dissociação mecânica) será cuidadosamente detalhado no vídeo associado.

<table><tbody><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Lonza</td><td>14-801F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4,5 g/L glicose com L-glutamina</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA (1x), vermelho de fenol</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina, solução de 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>25030123</tr><tr><td>Dulbecco' s Tamponamento de fosfato Salino</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia Modificada' s Mistura Média/Nutriente F-12 Ham</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D0547</td><td>Laminina em Pó</td></tr><tr><td>- 1 mg/ml em NaCl Tampolado Tris</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Hidrobrometo de poli-L-ornitina</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Insulina do pâncreas suíno</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>I5523</td><td></td></tr><tr><td>apo-Transferrina humana</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Dicloridrato de putrescina</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Selenito de sódio</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H4034&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G7126</td><td>Solução de estoque 1 M em água</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G9391</td><td>Solução estoque 2% (p/v) em água</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído 16% em água</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>RT 15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio (NaHCO3)</td><td>Merck Millipore</td><td>106329</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glicose, Monohidratado</td><td>Merck Millipore</td><td>4074-2</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) Titripur</td><td>Merck Millipore</td><td>109057</td><td></td></tr><tr><td>Água estéril - Aqua B. Braun</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagente analítico NORMAPUR absoluto de etanol</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri estéreis</td><td>VWR</td><td>82050-566</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur de vidro liso - Wilhem Ulbrich GdbR.</td><td>VWR</td><td>612-2297</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de contagem Malassez</td><td>VWR</td><td>631-0975</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa Acrodisc de soro com membrana de supor, estéril, GF/0.2 &micro; m, 37 mm</td><td>PALL Ciências da vida</td><td>4525</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica - reta, afiada-afiada, 14,5 cm de comprimento</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>14002-14</td><td>Para abrir a parede abdominal</td></tr><tr><td>Tesoura - Reta, pontiaguda, delicada, 10 cm de comprimento</td><td>MORIA</td><td>4877A</td><td>Para abrir a parede uterina</td></tr><tr><td>Fórceps - Maxilares curvos, usuais, serrilhados 1 mm</td><td>MORIA</td><td>2183</td><td>Para manipular embriões</td></tr><tr><td>Tesoura Vannas - Curva, pontiaguda, lâminas de 7 mm</td><td>MORIA</td><td>MC50</td><td>Para retirar o mesencéfalo</td></tr><tr><td>Fórceps Ultra Fino - Curvo, delicado, 13 cm de comprimento</td><td>MORIA</td><td>9987</td><td>Para remover meninges</td></tr><tr><td>BD BioCoat Poly-D-Lysine Placas Multipoços de 24 poços</td><td>BD Bioscience</td><td>356414</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células BD Falcon de 12 poços, fundo plano com tampa</td><td>BD Bioscience</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio SuperFrost, Bordas retificadas 90&ordm;</td><td>MENZEL-GL&Auml; SER</td><td>AG00008032E</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura de precisão espessura nº 1,5H circular 18 mm &Oslash;</td><td>MARIENFELD</td><td>117580</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Policlonal de Proteína 2 Associada a Microtúbulos de Coelho (MAP2)</td><td>Chemicon Millipore</td><td>AB5622</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Anticorpo Monoclonal de Camundongo Anti-Glutamato Descarboxilase (GAD67), clone 1G10.2</td><td>Chemicon Millipore</td><td>MAB5406</td><td>1/400</td></tr><tr><td>Anticorpo Monoclonal de Transportador de Dopamina de Rato (DAT), clone DAT-Nt&nbsp;</td><td>Chemicon Millipore</td><td>MAB369</td><td>1/500</td></tr><tr>Anticorpo <td></td><td></td> de<td>camundongo monoclonal anti-5-HT</td><td>1/8,000 - Presente generoso de Yves Charnay (Suíça, Yves.Charnay@hcuge.ch)</td></tr> <tr><td>Soro de cabra, origem da Nova Zelândia</td><td>Life Technologies</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 405 Anticorpo Anti-Coelho IgG (H+L) de cabra</td><td>Life Technologies</td><td>A-31556</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anti-Rato de Cabra IgG (H+L) Anticorpo</td><td>Life Technologies</td><td>A-11001</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Anti-Rato de Cabra IgG (H+L) Anticorpo</td><td>Life Technologies</td><td>A-11007</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>VECTASHIELD HardSet Montagem Média</td><td>Estereomicroscópio Vector Laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microscopia Carl Zeiss</td><td>Stemi-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Queimador de Bunsen FIREBOY</td><td>VWR</td><td>451-0136</td><td></td></tr></tbody></table>

cultura primária de neurônios dopaminérgicos mouse

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Neurónios dopaminérgicos representam menos de 1% do número total de neurónios no cérebro. Esta baixa quantidade de neurônios regula funções importantes do cérebro, como controle motor, motivação e memória de trabalho. Neurônios dopaminérgicos nigrostriatal degenerar seletivamente na doença de Parkinson (DP). Esta perda neuronal progressiva é inequivocamente associado aos motores sintomas da patologia (bradicinesia, tremor de repouso, rigidez muscular e). O principal agente responsável dos neurônios dopaminérgicos degeneração ainda é desconhecida. No entanto, esses neurônios parecem ser extremamente vulneráveis ​​em diversas condições. As culturas primárias constitui um dos modelos mais relevantes para investigar as propriedades e características de neurónios dopaminérgicos. Estas culturas podem ser submetidos a vários agentes estressores que imitam PD patologia e compostos neuroprotetores, a fim de parar ou abrandar a degeneração neuronal. Os inúmeros modelos de camundongos transgênicos do PD que foram generciados durante a última década aumentou ainda mais o interesse dos pesquisadores para as culturas de neurónios dopaminérgicos. Aqui, o protocolo de vídeo concentra-se na dissecação delicada de cérebros embrionárias de rato. Excisão precisa do mesencéfalo ventral é crucial para obter culturas neuronais suficientemente ricos em células dopaminérgicas para permitir estudos posteriores. Este protocolo pode ser realizado com camundongos transgênicos embrionárias e é adequado para imunofluorescência, PCR quantitativo, segundo quantificação mensageiro, ou avaliação morte / sobrevivência neuronal.

Um fluxograma que ilustra os passos de cultura de mesencéfalo é mostrado na Figura 1. Resumidamente, após a recolha de embriões a partir de um rato E13.5 Swiss grávida, mesencéfalo ventral é dissecado a partir de todo o embrião. Os fragmentos isolados do cérebro são submetidos sucessivamente a digestão enzimática e dissociação mecânica. As células dissociadas foram sedimentadas por centrifugação, ressuspensas em meio de cultura e semeados em placas de 12 ou de 24 poços pré-revestidos. As células são man...

Os neurônios dopaminérgicos desempenham um papel regulador vital no cérebro. Sua perda está associada à doença de Parkinson. Neste vídeo, mostramos como gerar culturas primárias de neurônios dopaminérgicos centrais a partir de mesencéfalo embrionário de camundongo. Tais culturas são úteis para estudar a extrema vulnerabilidade desses neurônios a vários estresses.

Cultura primária de neurônios dopaminérgicos mouse

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como gerar uma cultura primária de neurônios dopaminérgicos a partir de cérebros de camundongos embrionários. Isso é realizado primeiramente coletando embriões de camundongo E 13,5. O segundo passo consiste em dissecar os cérebros embrionários de camundongo e isolar o mesencéfalo.Em seguida, uma dissociação enzimática e uma dissociação mecânica são aplicadas ao mesencéfalo coletado. O passo final é o plaqueamento de células neuronais dissociadas. Por fim, a coloração por imunofluorescência é utilizada para demonstrar a presença de neurônios dopaminérgicos na cultura.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área dos transtornos neurológicos e psiquiátricos, como esquizofrenia, transtorno do déficit de atenção e hiperatividade e doença de Parkinson. A demonstração visual deste método é essencial, pois os passos de dissecação e dissociação celular são difíceis de aprender, já que exigem gestos precisos e identificação anatômica exata da estrutura; demonstrar o procedimento será feito por Florence, engenheira do meu grupo, para iniciar este procedimento. Após sacrificar um camundongo prenhe de E 13,5, limpe o abdômen com etanol 70%.Em seguida, abra a parede abdominal e colete os cornos uterinos. Disseque cada embrião dos cornos uterinos e remova as membranas amnióticas. Em seguida, transfira os embriões para uma placa de Petri de 100 milímetros contendo P-B-S-G-A-B estéril.Lave-os transferindo-os para três banhos idênticos sucessivos. Em seguida, transfira os embriões para uma placa de Petri estéril de 60 milímetros para dissecação. Coloque a placa de Petri sob o microscópio estereoscópico.Em seguida, excise o cérebro utilizando tesoura de Vann. Remova e descarte cuidadosamente as regiões do quarto ventrículo e do mielencéfalo. Faça um corte próximo à região tálamo na porção rostral e outro corte na região ssus no lado coddle.Em seguida, remova o colículo superior. Uma vez que o mesencéfalo ventral esteja isolado, remova cuidadosamente as meninges usando pinças ultrafinas e colete os segmentos dissecados sem as meninges em um tubo estéril de 13 mililitros contendo P-B-S-G-A-B. Limpe bem o tubo contendo o mesencéfalo com etanol a 70%.Em seguida, coloque-o sob a câmara neste passo. Lave o mesencéfalo três vezes com P-B-S-G-A-B estéril. Deixe os fragmentos cerebrais sedimentarem entre cada lavagem e evite perturbar o tecido após a última lavagem.Remova cuidadosamente o máximo de solução possível e incube os segmentos cerebrais em três mililitros de tripsina EDTA por 15 minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono. Enquanto isso, pola as ponteiras de pipeta com chama para maximizar a sobrevivência dos neurônios, pois a extremidade de uma ponteira de vidro não polida é afiada e pode danificar ligeiramente as células durante as etapas de dissociação. Reduza o diâmetro da extremidade da ponteira de PE durante o polimento com chama.Agora, remova cuidadosamente o máximo possível da solução de tripsina-EDTA. Em seguida, adicione 10 mililitros de meio de cultura, 10% IFBS, e lave os segmentos cerebrais três vezes com essa solução. Usando a pipeta de PE polida ao fogo, inicie a dissociação do mesencéfalo em seis mililitros de meio de cultura.Médio, taxa de triagem de 10% IFBS 10 vezes e tente evitar bolhas de ar. Em seguida, deixe os fragmentos sedimentarem. Colete o meio em um novo tubo estéril de 13 mililitros.Adicione seis mililitros de cultura, meio e tri, agitando 10 vezes mais. Deixe os fragmentos sedimentarem e colete o meio contendo as células dissociadas no mesmo tubo de 13 mililitros. Em seguida, centrifugue as células a 160 Gs por cinco minutos.Após isso, descarte o sobrenatante e ressuspenda. Suspenda as células em meio de cultura suplementado com 10% de hormônio. Misture e conte as células em suspensão em uma câmara de Neubauer, e ajuste o volume do meio para uma concentração de 600.000 células por mililitro.Em geral, cerca de 1.700.000 células podem ser obtidas de um mesencéfalo de camundongo. Agora, remova o meio de revestimento contendo SFB de uma placa de 24 poços. Adicione um mililitro de suspensão celular a cada poço.Em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em atmosfera de 95% de ar. Os neurônios dopaminérgicos amadurecem após cerca de cinco a sete dias in vitro, e as células podem ser mantidas em cultura por até 15 dias sem troca de meio. No dia anterior à dissecação, adicionar 10 mililitros de HCL 1 molar em uma placa de Petri. Colocar 12 a 15 lamínulas de vidro sobre a superfície do líquido e aguardar 15 minutos.Em seguida, pressione as lamínulas no líquido e aguarde mais 15 minutos. Depois, remova o HCL e lave as lamínulas três vezes com água, seguido por uma lavagem rápida com etanol puro. Em seguida, adicione etanol puro ao recipiente e aguarde 30 minutos sob a capela.Remova as lamínulas limpas do etanol. Em seguida, transfira as lamínulas para uma placa de cultura celular de 12 poços. Lave as lamínulas duas vezes com água estéril, seguido por uma lavagem com PBS estéril.Em seguida, remova o PBS e adicione dois XPLO com 500 microlitros por poço, incubando por quatro horas a 37 graus Celsius no incubador de dióxido de carbono. Após quatro horas, remova a solução de PLO e lave três vezes com PBS estéril. Depois disso, remova o PBS e adicione 500 microlitros de laminina em 20% IFBS a uma concentração de um micrograma por mililitro em cada poço, incubando durante a noite a 30 graus Celsius no incubador de dióxido de carbono.Para imunofluorescência. Remova o meio de revestimento da placa de 12 poços. Adicione dois mililitros de células a 900.000 células por poço e cultive-as no incubador a 37 graus Celsius.As células podem ser mantidas em cultura por até 15 dias sem substituição do meio. Apresentadas aqui estão as imagens de contraste de fase da cultura em diferentes estágios de desenvolvimento. Esta figura mostra a coloração para tirosina hidroxilase em neurônios dopaminérgicos no 8º dia in vitro (DIV). Os neurônios D foram detectados utilizando anticorpo anti-TH.O número de neurônios positivos para TH no cultivo de mesencéfalo é uma função da idade do cultivo. Abaixo estão as células representativas de neurônios e astrócitos no cultivo. No DIV quatro, neurônios dopaminérgicos foram detectados utilizando anticorpos anti-DAT ou anti-TH e os neurônios GABAérgicos.Neurônios serotoninérgicos e astrócitos foram detectados usando os anticorpos anti GAD 67, anti serotonina e anti GFAP, respectivamente. As células neuronais foram coradas com um anticorpo anti map dois. Abaixo está a coloração representativa de várias populações celulares da cultura do mesencéfalo.Um neurônio dopaminérgico foi detectado pela coloração de DAT no nono dia in vitro (DIV) e esses neurônios GABAérgicos foram visualizados pela coloração de GAD 67 no nono dia in vitro (DIV). O neurônio serotoninérgico foi corado com um anticorpo antisserotonina no nono dia in vitro (DIV). Os neurônios foram identificados pela coloração de mapeamento após seu desenvolvimento no início da década de oitenta.Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de neurociência explorarem o desenvolvimento de células dopaminérgicas em cultura primária e pode ser empregada para investigar os mecanismos moleculares subjacentes aos estados fisiológicos e patológicos dos neurônios dopaminérgicos. A ausência de vídeos apresentando a delicada dissecação pode ter limitado os pesquisadores no desenvolvimento desse modelo de cultura em camundongo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar com precisão células funcionais do cérebro embrionário de camundongo e realizar etapas dedicadas de dissociação para obter uma boa cultura primária de dopaminérgicos murinos.

primary-culture-of-mouse-dopaminergic-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo descreve o método utilizado para o isolamento de neuroprecursors desenvolvimento do córtex de ratos embrionárias. O procedimento para a remoção de embriões do útero, dissecando o tecido cortical, e digerindo o córtex cerebral isolado é mostrado.

Cultura de rato precursores das células-tronco neurais

Principal dissociada mesencéfalo culturas de células de dopamina permitir o estudo das características pré-sináptica dos neurônios dopaminérgicos. Eles podem ser usados ​​para monitorar em tempo real a cinética de liberação de dopamina e proteína / mRNA níveis de reguladores de exocitose dopamina. Aqui, nós mostrar-lhe como gerar essas culturas de recém-nascidos de roedores.

Principal Dissociated Midbrain dopamina culturas de células de recém-nascidos de roedores

Este protocolo descreve os passos necessários para dissecar, transfectar via de eletroporação e neurônios do hipocampo e da cultura do mouse cortical. Curto prazo, as culturas podem ser utilizados para estudos sobre crescimento do axônio e orientação, enquanto culturas a longo prazo podem ser usados ​​para estudos de sinaptogênese e análise espinha dendrítica.

Nucleofection e Cultura Primária de Neurônios do hipocampo do rato embrionárias e Cortical

Este artigo descreve métodos para derivar populações enriquecidas de células precursoras de oligodendrócitos murino (OPCs) em cultura primária, que se diferenciam para produzir oligodendrócitos maduros (MQO). Além disso, este relatório descreve as técnicas para produzir murino myelinating co-culturas semeando OPCs do mouse sobre uma cama de neurite do mouse neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRGNs).

Derivação de Enriquecido Culturas oligodendroglial e Neuron / oligodendroglial Myelinating Co-culturas de tecidos pós-natais murino

Este vídeo descreve um método para cultivar neurônios dopaminérgicos a partir de tecido cerebral embrionário de camundongo. O processo inclui o tratamento do mesencéfalo com uma enzima proteolítica, destacando as células e cultivando-as em lamínulas revestidas de polímero em um meio rico em nutrientes com antibióticos para seu crescimento e viabilidade a longo prazo.

Cultura e manutenção de neurônios dopaminérgicos do tecido cerebral embrionário de camundongos

O vídeo demonstra o processo de isolamento e cultura de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo de embriões de camundongos. Os assoalhos do mesencéfalo ventral isolados são dissociados usando enzimas. Os neurônios dopaminérgicos resultantes são colhidos e transferidos para micro-ilhas dentro de placas de vários poços. As células são incubadas com um meio de neurônio dopaminérgico para manter as células em alta densidade dentro das micro-ilhas.

Isolamento e cultura de neurônios dopaminérgicos embrionários primários do mesencéfalo de camundongos

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a produção simultânea de culturas de células precursoras neurais, quer como monocamadas aderentes ou neuroesferas, a partir da zona subventricular e giro dentado de ratinhos adultos individuais.

Um rato, duas culturas: isolamento e cultivo de células-tronco neurais Adulto de as duas zonas neurogênica Individual Ratos

As causas da degeneração dos neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo durante a doença de Parkinson não são totalmente compreendidas. Os sistemas de cultura celular fornecem uma ferramenta essencial para o estudo das propriedades neurofisiológicas desses neurônios. Aqui apresentamos um protocolo otimizado, que pode ser utilizado para modelagem in vitro da neurodegeneração.

Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic

Na doença de Parkinson (PD), substância negra (SNC) neurónios dopaminérgicos degenerar, conduzindo a disfunção motora. Aqui nós relatamos um protocolo para a cultura de neurônios do mesencéfalo ventral de um ratinho expressando eGFP impulsionado por uma sequência de promotor de tirosina hidroxilase (TH), a colheita neurônios fluorescentes individuais das culturas, e medir o seu transcriptoma usando RNA-seq.

A identificação fiável de Vida neurônios dopaminérgicos em culturas mesencéfalo Usando RNA Sequenciamento e TH-driven-promotor eGFP Expression

Realizar experimentos in vitro para refletir as condições in vivo da forma mais adequada possível não é uma tarefa fácil. O uso de culturas celulares primárias é um passo importante para a compreensão da biologia celular em um organismo inteiro. O protocolo fornecido descreve como crescer com sucesso e cultura embrionária mouse neurônios cerebelares.

Cultura primária de neurônios isolados do cerebelo embrionário do rato

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para estudar o acúmulo neuronal de α-sinucleína em neurônios primários de dopamina de camundongos. Os agregados fosforilados de α-sinucleína em neurônios são induzidos com fibrilas pré-formadas de α-sinucleína. Imagens automatizadas de células imunofluorescentamente rotuladas e análise de imagem imparcial tornam este protocolo robusto adequado para a triagem de rendimento médio a alto de drogas que inibem o acúmulo de α-sinucleína.

Estudando o acúmulo de α-sinucleína induzida por fibril pré-formado em neurônios de dopamina de cérebro médio do camundongo embrionário primário

Aprenda a gerar culturas primárias de neurônios dopaminérgicos a partir de mesencéfalo embrionário de mouse. Este protocolo detalhado permite estudar vulnerabilidade neuronal e mecanismos da doença de Parkinson.

Cultura primária de neurônios dopaminérgicos mouse

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