Nanogold Labeling do Sistema de levedura Endossomal de Análises ultraestruturais

O objetivo geral do experimento a seguir é visualizar no nível ultraestrutural os compartimentos endossômicos da levedura Saccharomyces cei. Isso é conseguido preparando o plast Sphera de levedura, que então sofre absorção endocítica de partículas de nano ouro carregadas positivamente. Como segunda etapa, a amostra é fixada e seccionada para obter seções criogênicas ultrafinas das células.

Em seguida, as seções criogênicas são submetidas à reação de realce de prata. Com o objetivo de ampliar e visualizar a endocitose de nanopartículas de ouro carregadas positivamente, são obtidos resultados que mostram a morfologia dos diferentes compartimentos endossômicos de levedura com base na marcação específica deste procedimento. A principal vantagem dessa técnica de nossos métodos existentes, como a marcação de seção ImmunoGold, é que ela não depende de anticorpos que muitas vezes não funcionam na preparação da eletromicroscopia.

Embora este método possa nos mostrar insights sobre o sistema lisossômico da levedura sarchi ESIS vei, ele também pode ser aplicado a outros modelos eucarióticos, como outras leveduras e células de mamíferos. A levedura a partir da qual o Sphero Plast será preparado é incubada primeiro durante a noite a 30 graus Celsius em 10 mililitros do meio apropriado, conforme determinado pelo projeto do experimento no dia seguinte. Depois de medir a densidade óptica da cultura em 600 nanômetros, diluir as células no mesmo meio de cultura para um OD 600 de 0,2 a 0,4.

Cresça as células para uma fase de crescimento exponencial com um OD 600 de uma a duas transferências, 10 D 600 equivalentes de células para um tubo de 50 mililitros e centrifugue a 2100 Gs por cinco minutos. Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em cinco mililitros de tubos de 100 milimolares e 10 milimolares dihi três em Hall incubar a 30 graus Celsius durante 10 minutos. Recolha as células por centrifugação.

Depois de descartar o sobrenadante Resus, suspenda as células em cinco mililitros de meio contendo um molar de sorbitol e cinco miligramas de enzima lítica. Incube a mistura a 30 graus Celsius com agitação suave por 30 minutos. Centrifugar a suspensão de células a 300 Gs durante cinco minutos para recolher uma fracção de pellets correspondente às placas de Sphero.

Descarte o sobrenadante e suspenda novamente os splats em 960 microlitros de meio gelado contendo um molar de sorbitol. Transfira a mistura para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros gelado. Para iniciar o procedimento de absorção de nano ouro, use uma pipeta e misture suavemente o Sphero plast com quatro partículas de nano ouro carregadas positivamente.

Resus suspenso em 40 microlitros de água. O volume final da mistura deve ser de um mililitro. Coloque a suspensão celular obtida no gelo por 15 minutos.

Transfira a suspensão para a temperatura ambiente e incube pelo tempo necessário para permitir a internalização do nano ouro por endocitose. Quando a absorção desejada de nano ouro estiver completa, pare a reação adicionando um mililitro de fixador de dupla força contendo um molar de sorbitol à suspensão celular. Mantenha o tubo em temperatura ambiente por 30 minutos.

Inverta suavemente o tubo de microcentrífuga manualmente várias vezes durante os 30 minutos para manter o PHE plast e a suspensão Em seguida, centrifugue duas vezes a 1700 Gs por 25 segundos, descarte o sobrenadante e adicione um mililitro de fixador de força padrão fresco contendo um molar de sorbitol incubar por duas horas em temperatura ambiente em uma roda de rotação lenta. Posteriormente, as células são processadas e seccionadas criograficamente conforme descrito no protocolo de texto antes de iniciar este procedimento, remova o kit de aprimoramento de prata do freezer e descongele em uma incubadora de 37 graus Celsius. Coloque o kit de descongelamento em uma incubadora de bancada de 24 graus Celsius previamente colocada na sala escura até o uso.

Coloque uma placa de aquecimento em uma sala escura e aqueça-a a uma temperatura final de 24 graus Celsius. Cubra a parte superior da placa de aquecimento com uma superfície de revestimento de bancada, proteja o lado brilhante para cima e prenda-o com fita adesiva. Coloque o filme para no protetor de superfície e marque as bordas com um marcador preto para permitir a visualização no escuro.

Cole um termômetro na parte superior do protetor de superfície. Para monitorar a temperatura da placa de aquecimento, ajuste gradualmente a temperatura. Se não for 24 graus Celsius, coloque um tubo de 50 mililitros contendo água bidestilada

Dentro da incubadora, encha uma pequena placa de Petri com água bidestilada Coloque duas grades de níquel com as seções criogênicas na amostra de água voltada para baixo por 30 minutos. Após 30 minutos, encha uma segunda placa de Petri com água bidestilada pré-aquecida e coloque as mesmas duas grades de níquel na água por mais 30 minutos.

Enxágue as grades novamente passando-as com o lado da amostra para baixo em várias gotas de água bidestilada a 24 graus Celsius colocadas no perfume que foi fixado na placa de aquecimento. Certifique-se de que nove gotas adicionais de água duplamente destilada estejam prontas no parfum para o enxágue após a reação de aprimoramento de prata. Neste ponto do procedimento, todas as luzes da sala escura devem ser apagadas e a luz vermelha acesa.

No entanto, apenas para fins de filmagem, a luz permanecerá acesa. Nesta demonstração, retire as soluções a e B do kit de aprimoramento de prata da incubadora de 24 graus Celsius em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro com seis gotas da solução A, seguidas por seis gotas da solução B e misture bem com uma pipeta de pasti de vidro, evitando a formação de bolhas. Vortex a solução.

Retorne brevemente as soluções a e B para a incubadora de 24 graus Celsius e retire a solução C. Adicione seis gotas da solução C à mistura AB. Misture novamente com uma pipeta mais pastosa seguida de vórtice e evite fazer bolhas.

Use esta mistura final imediatamente. Coloque as gotas na paraforma com uma pinça antimagnética limpa. Coloque as grades sobre a mistura.

Esta é a reação de aumento de prata. Deixe as grades por seis a 15 minutos, dependendo do aprimoramento desejado para o experimento. Retire as grades da mistura e passe-as rapidamente por uma sucessão de seis gotas de água bidestilada colocada em Perfil a 24 graus Celsius nas últimas três lavagens.

Deixe as grades por sete minutos por gota de água. Se estiver realizando um experimento real, acenda as luzes novamente quando a lavagem estiver concluída. Posteriormente, os resultados são visualizados por marcação ImmunoGold ou coloração de membrana para uma investigação EM.

Diferentes tipos de compartimentos endossômicos de levedura podem ser marcados com nano ouro aprimorado com prata e visualizados por microscopia eletrônica. Uma absorção de cinco minutos de nano ouro rotula a membrana plasmática e os compartimentos endossômicos iniciais, como vesículas únicas, que são possivelmente vesículas endocíticas e estruturas tubulares, que são muito provavelmente endossomos iniciais. Uma incubação de 30 minutos com nano ouro leva à marcação de endossomos tardios ou corpos multivesiculares.

O poder de resolução da combinação de um procedimento de microscopia imunoeletrônica com este protocolo de realce de nano ouro e prata é ressaltado pela preservação e qualidade da morfologia das organelas mostradas, em particular, as vesículas internas dos corpos multivesiculares. Antes de usar o método de aprimoramento de prata, é necessário fazer um experimento piloto para determinar os tempos de incubação ideais necessários para o tamanho e a uniformidade dessas partículas de prata. Seguindo este procedimento.

Outros métodos, como imunomarcação, podem ser realizados para responder a perguntas como a localização de uma proteína específica em uma específica sob o compartimento mar.