Nanogold Labeling do Sistema de levedura Endossomal de Análises ultraestruturais
14 de julho de 2014
A levedura Saccharomyces cerevisiae, tem sido um organismo chave modelo para identificar e estudar genes que regulam a biogênese e funções do sistema endosomal. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para a rotulagem específica dos compartimentos endossomais para estudos ultra-estruturais.
O objetivo geral do experimento a seguir é visualizar, no nível ultraestrutural, os compartimentos endossomais da levedura Saccharomyces cerevisiae. Isso é conseguido preparando-se esferas de plástico de levedura, que posteriormente realizam a captação endocítica de partículas de ouro nano com carga positiva. Como segundo passo, a amostra é fixada e seccionada para obter cortes criogênicos ultrafinos das células.
Em seguida, as secções criogênicas são submetidas à reação de ampliação com prata. Com o objetivo de ampliar e visualizar a endocitose, obtêm-se resultados positivos com partículas de ouro nano que demonstram a morfologia dos diferentes compartimentos endossomais de levedura com base na marcação específica deste procedimento. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a marcação com ImunoOuro em secções, é que ela não depende de anticorpos, que muitas vezes não funcionam em preparações para microscopia eletrônica.
Embora este método possa nos fornecer insights sobre o sistema lisossomal da levedura sarchi ESIS vei, ele também pode ser aplicado a outros modelos eucarióticos, como outras leveduras e células de mamíferos. As leveduras das quais os esferoplastos serão preparados são inicialmente incubadas durante a noite a 30 graus Celsius em 10 mililitros do meio apropriado, conforme determinado pelo delineamento do experimento para o dia seguinte. Após medir a densidade óptica do cultivo em 600 nanômetros, dilua as células no mesmo meio de cultura para uma OD 600 entre 0,2 e 0,4.
Cultive as células até a fase de crescimento exponencial com uma OD 600 de um a dois, transfira 10 D 600 equivalentes de células para um tubo de 50 mililitros e centrifugue a 2100 Gs por cinco minutos. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em cinco mililitros de pipes 100 milimolar e dihi três 10 milimolar em Hall. Incube a 30 graus Celsius por 10 minutos. Colete as células por centrifugação.
Após descartar o sobrenadante Resus, re-suspenda as células em cinco mililitros de meio contendo um molar de sorbitol e cinco miligramas de enzima lítica. Incube a mistura a 30 graus Celsius com agitação suave por 30 minutos. Centrifugue a suspensão celular a 300 Gs por cinco minutos para coletar uma fração de pellet que corresponde aos esferoplastos.
Descarte o sobrenadante e re-suspenda os esferoplastos em 960 microlitros de meio frio contendo um molar de sorbitol. Transfira a mistura para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros gelado. Para iniciar o procedimento de captação de nano-ouro, use uma pipeta e misture suavemente os esferoplastos com quatro partículas de nano-ouro positivamente carregadas.
Reconstitua em 40 microlitros de água. O volume final da mistura deve ser um mililitro. Coloque a suspensão celular obtida em gelo por 15 minutos.
Transfira a suspensão para a temperatura ambiente e incube pelo tempo necessário para permitir a internalização do nano ouro por endocitose. Quando a captação desejada de nano ouro estiver completa, interrompa a reação adicionando um mililitro de fixador com força dupla contendo sorbitol a um molar à suspensão celular. Mantenha o tubo à temperatura ambiente por 30 minutos.
Inverta suavemente o tubo de microcentrífuga manualmente várias vezes durante os 30 minutos para manter a plasta de PHE e a suspensão. Em seguida, centrifugue duas vezes a 1700 Gs por 25 segundos, descarte o sobrenadante e adicione um mililitro de fixador de força padrão contendo sorbitol a um molar. Incube por duas horas à temperatura ambiente em uma roda giratória lenta. Posteriormente, as células são processadas e cortadas em criostato conforme descrito no protocolo textual. Antes de iniciar este procedimento, retire o kit de realce prateado do congelador e descongele em um incubador a 37 graus Celsius. Coloque o kit descongelado em um incubador de bancada a 24 graus Celsius previamente colocado na câmara escura até o uso.
Coloque uma placa de aquecimento em uma sala escura e aqueça-a até uma temperatura final de 24 graus Celsius. Cubra a parte superior da placa de aquecimento com uma superfície de capa de bancada, o lado protetor brilhante voltado para cima, e fixe-a com fita adesiva. Coloque filme de parafina sobre o protetor de superfície e marque as bordas com uma caneta preta para permitir a visualização no escuro.
Fixe com fita um termômetro na parte superior do protetor de superfície. Para monitorar a temperatura da placa de aquecimento, ajuste gradualmente a temperatura. Se não estiver a 24 graus Celsius, coloque um tubo de 50 mililitros contendo água bidestilada.
Dentro do incubador, preencha uma pequena placa de Petri com água bidestilada aquecida previamente a 37 graus Celsius. Coloque duas grades de níquel com as seções criogênicas na água, com o lado do espécime voltado para baixo, por 30 minutos. Após 30 minutos, preencha uma segunda placa de Petri com água bidestilada pré-aquecida e coloque as mesmas duas grades de níquel na água por mais 30 minutos.
Lave as grades novamente, passando-as com o lado do espécime voltado para baixo sobre várias gotas de água destilada dupla a 24 graus Celsius colocadas sobre o parafim fixado na placa aquecedora. Certifique-se de que mais nove gotas de água destilada dupla estejam prontas sobre o parafim para a lavagem após a reação de amplificação com prata. Neste ponto do procedimento, todas as luzes do cômodo escuro devem ser desligadas e a luz vermelha deve ser acesa.
No entanto, apenas para fins de filmagem, a luz permanecerá acesa. Nesta demonstração, retire as soluções A e B do kit de realce de prata do incubador a 24 graus Celsius em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro, adicionando seis gotas da solução A, seguidas por seis gotas da solução B, e misture bem com uma pipeta de vidro Pasteur, evitando a formação de bolhas. Vortexe a solução.
Retorne brevemente as soluções a e B para o incubador a 24 graus Celsius e retire a solução C. Adicione seis gotas da solução C à mistura AB. Misture novamente com uma pipeta Pasteur, seguido de vórtex, evitando a formação de bolhas.
Utilize esta mistura final imediatamente. Coloque gotas sobre o paraform com um par de pinças anti-magnéticas limpas. Posicione as grades sobre a mistura.
Esta é a reação de realce com prata. Deixe as grades de seis a 15 minutos, dependendo do nível de realce desejado para o experimento. Remova as grades da mistura e passe-as rapidamente por uma sucessão de seis gotas de água duplamente destilada colocadas sobre o Perfil a 24 graus Celsius nas três últimas lavagens.
Deixe as grades durante sete minutos por gota de água. Se estiver realizando um experimento real, ligue as luzes novamente quando a lavagem estiver concluída. Posteriormente, os resultados são visualizados por marcação com ImmunoGold ou coloração da membrana para uma investigação em microscopia eletrônica.
Diferentes tipos de compartimentos endossomais de levedura podem ser marcados com nano-ouro realçado por prata e visualizados por microscopia eletrônica. Uma captação de cinco minutos com nano-ouro marca a membrana plasmática e compartimentos endossomais precoces, como vesículas únicas, que possivelmente são vesículas endocíticas, e estruturas tubulares, que muito provavelmente são endossomos precoces. Uma incubação de 30 minutos com nano-ouro resulta na marcação de endossomos tardios ou corpos multivesiculares.
O poder de resolução da combinação de um procedimento de microscopia eletrônica imunológica com este protocolo de ampliação com nano ouro e prata é demonstrado pela preservação e qualidade da morfologia dos organoides mostrados, em particular, as vesículas internas dos corpos multivesiculares. Antes de utilizar o método de ampliação com prata, é necessário realizar um experimento piloto para determinar os tempos de incubação ideais necessários para o tamanho e a uniformidade dessas partículas de prata. Após este procedimento.
Outros métodos, como marcação imunológica, podem ser realizados para responder perguntas como a localização de uma proteína específica em um compartimento marinho particular.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para a visualização de compartimentos endossomais na levedura Saccharomyces cerevisiae em nível ultraestrutural. O método envolve o uso de partículas de ouro nanoestruturadas com carga positiva para marcação específica, permitindo uma visualização aprimorada dessas estruturas celulares.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Microbiologia
Antecedentes
- O levedo é um organismo modelo fundamental para o estudo de processos celulares.
- O sistema endossomal desempenha um papel crucial no tráfego celular.
- Os métodos tradicionais podem depender de anticorpos que não são eficazes na microscopia eletrônica.
- Este estudo tem como objetivo aprimorar as técnicas de visualização de compartimentos endossomais.
Objetivo do Estudo
- Visualizar compartimentos endossomais em levedura em um nível ultraestrutural.
- Desenvolver um protocolo que melhore a marcação desses compartimentos.
- Fornecer uma alternativa confiável aos métodos existentes de marcação imunológica com ouro coloidal.
Métodos Utilizados
- Preparação de esferoplastos de levedura.
- Captação endocítica de nanopartículas de ouro com carga positiva.
- Fixação e seccionamento de amostras para obtenção de cortes criogênicos ultrafinos.
- Aplicação da reação de realce com prata para visualização.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida de diferentes compartimentos endossomais de levedura.
- Melhoria nos detalhes da morfologia das estruturas endossomais.
- Demonstração da eficácia da técnica de marcação.
- A comparação com métodos tradicionais destaca as vantagens desta abordagem.
Conclusões
- O protocolo fornece um método robusto para o estudo de compartimentos endossomais.
- Essa técnica supera as limitações dos métodos baseados em anticorpos.
- Abre novas perspectivas para estudos ultraestruturais em leveduras.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a visualização ultraestrutural de compartimentos endossomais sem dependência de anticorpos, superando uma limitação fundamental na validação de alvos baseada em microscopia eletrônica. Ao fornecer leituras morfológicas diretas do tráfego endocítico, ele auxilia na redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta, onde as vias lisossômicas e endossomais estão implicadas em doenças. A abordagem aumenta a confiança preditiva em ensaios de triagem fenotípica que monitoram a integridade de organelas ou o tráfego de proteínas como leituras funcionais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a observação direta da morfologia endossomal para investigar hipóteses terapêuticas envolvendo vias de tráfego vesicular.
- Valor Operacional: Fornece marcação independente de anticorpos, reduzindo a dependência de reagentes que podem falhar na preparação de amostras para microscopia eletrônica.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Gera leituras ultraestruturais que podem validar os efeitos do composto sobre o tamanho, uniformidade e compartimentalização dos endossomos.
- Valor Operacional: Apoia a padronização de ensaios por meio da cinética quantificável do realce com prata associada à duração da captação.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Valor Científico: Facilita a correlação entre perturbações genéticas ou farmacológicas e a ultraestrutura endossomal em modelos relevantes para doenças.
- Valor Operacional: Permite a comparação paralela de fenótipos selvagens e mutantes para reduzir riscos dos mecanismos-alvo antes do avanço pré-clínico.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere em fluxos de trabalho iniciais de descoberta, nos quais a função endossomal é um indicador fenotípico, conectando a validação de alvos ao desenvolvimento de ensaios por meio de análise ultraestrutural direta.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a visualização da compartimentalização endossomal após perturbação genética ou química.
- Triagem: Permite a avaliação quantitativa da cinética de captação de nanopartículas como indicador da atividade endocítica em triagens de compostos.
- Análises: Fornece dados morfométricos sobre tamanho e distribuição de vesículas que podem ser correlacionados com ensaios funcionais.
- Pesquisa Translacional: Conecta defeitos na tráfego celular observados em leveduras a vias conservadas em eucariotos superiores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma ultraestrutural reutilizável para avaliação da função endossomal em diversos projetos e sistemas modelo.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista em estudos de tráfego celular ao fornecer evidência visual direta de marcação de endossomos.
- Valor Operacional: Padroniza a preparação de amostras por meio de parâmetros definidos de formação de esferoplastos e captação de ouro nano.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de prosseguimento ou interrupção ao validar o engajamento do alvo por meio de alterações fenotípicas em nível de organelas.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base na recuperação ou modulação do fenótipo endossomal.
Considerações de Implementação
- Experiência na preparação de esferoplastos de levedura e no manuseio de amostras para microscopia eletrônica.
- Acesso à crioultramicrotomia e reagentes de amplificação prateada para visualização de nanopartículas.
- Padronização dos tempos de incubação para garantir marcação uniforme das partículas em diferentes condições experimentais.
- Considerações de adaptação para aplicação do protocolo em sistemas endossomais de leveduras ou mamíferos.
- Necessidade de experimentos pilotos para otimizar a concentração de nano-ouro e a duração da amplificação para leituras ultraestruturais específicas.
