De alta capacidade: Ensaio para Fenótipo Salmonella enterica Typhimurium Association, invasão e replicação em macrófagos

O objetivo geral do experimento a seguir é rastrear e avaliar os genes necessários para a invasão e/ou sobrevivência dentro de células de macrófagos in vitro, de maneira de alto rendimento, e identificar genes mecanicistas da patogênese da salmonela. Isso é obtido adicionando cepas de salmonela do tipo selvagem ou mutante às culturas de células de macrófagos. Em 96 placas de poço por 30 minutos como uma infecção in vitro como uma segunda etapa após a incubação de 30 minutos, a salmonela que não se ligou às células dos macrófagos é lavada e fresca.

Um meio contendo uma alta concentração de antibiótico Gentamicina é adicionado por uma hora, o que mata todas as bactérias extracelulares que não são internalizadas. Em seguida, a cultura de células de macrófagos é lavada novamente e um meio fresco contendo uma baixa concentração de gentamicina é adicionado para uma incubação adicional de 22,5 horas, a fim de manter um ambiente extracelular livre de bactérias e permitir que apenas a salmonela intracelular sobreviva e prolifere. Os resultados mostram que, comparando a salmonela mutante com a cepa do tipo selvagem, o fenótipo in vitro das cepas mutantes para invasão e replicação de associação é determinado com base na medição de unidades de formação de colônias por células de macrófagos obtidas pelo ensaio de plaqueamento de diluição em série para cada ponto de tempo.

A principal vantagem de nossa técnica é que ela mede a associação, invasão e replicação de salmonela e células fagocíticas e pode medir várias cepas simultaneamente para maior rendimento. Demonstrando o procedimento estará o Dr. Jing Wu, pesquisador de pós-doutorado em meu laboratório, e a Sra. Roberta Pugh, pesquisadora associada em meu laboratório Para começar a linha de baixo número de passagens espelhando células de macrófagos cruas 2 64 0,7 em um frasco de cultura de células T 75 com uma tampa de filtro ventilada em meio de águias modificado delcos suplementado com 10% de soro bovino fetal 0,5% de bicarbonato de sódio e 1% 100 x aminoácidos não essenciais NEAA a 37 graus Celsius em um Incubadora de 5% de dióxido de carbono.

Quando as células atingirem 60 a 80% de confluência, colha as células em DMEM com um raspador de células, depois conte as células em um hemocitômetro e calcule a concentração celular, dilua a suspensão celular para uma concentração de 2,5 vezes 10 elevado a quinta células por mililitro de cultura de células DMEM frescas. Placa média de 200 microlitros da suspensão de células diluídas usando uma pipeta multicanal em cada poço de uma placa de cultura de células de 96 poços em três placas separadas de 96 poços para um conjunto de ensaio de invasão de células fagocíticas e rotule cada placa com invasão de associação e replicação. Quatro poços por placa são usados para cada cepa de salmonela.

Coloque as placas em uma incubadora de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius durante a noite para permitir que as células dos macrófagos se fixem no fundo dos poços no mesmo dia. As células brutas de macrófagos 2 6 4 0,7 são semeadas em placas de 96 poços. Escolher colónias individuais de serótipo salmonella entera de tipo selvagem, tyria 1 0 4 2 8 delta INVA mutante delta quatro P mutante e a cultura de estirpes mutantes de ensaio desejadas.

Cada uma das cepas de salmonela em cinco mililitros de caldo LB e complementa o caldo LB para as cepas mutantes Com 50 microgramas por mililitro de micina, a micina pode cultivar a bactéria por 14 horas a 37 graus Celsius com agitação a 220 RPM em tubos de fundo redondo de polipropileno de 14 mililitros com tampas frouxas. Após a incubação noturna a 37 graus Celsius, cada uma das cepas de salmonela na proporção de um para 50 em cinco mililitros do respectivo caldo de lb. Cultive as culturas por mais quatro horas a 37 graus Celsius com agitação a 220 RPM.

Ler os valores de OD 600 de cada cultura bacteriana num espectrofotómetro. Cada cultura deve ter um valor OD 600 entre 0,6 e 1,2 para otimizar a patogenicidade da salmonela ilha um a três sistema de secreção SPI um tipo três expressão gênica do sistema de secreção para invasão. Calcule a concentração bacteriana usando a fórmula um OD 600 é igual a 7,5 vezes 10 elevado à oitava colônia formando unidades por mililitro.

A UFC então dilui as bactérias a uma concentração de cinco vezes 10 elevado a seis, o FU por mililitro e três mililitros de meio de cultura de células DMEM fresco Remova 3 placas de cultura de células de 96 poços contendo macrófagos da incubadora de dióxido de carbono e lave cada poço uma vez com 200 microlitros de um XPBS. Depois que a lavagem do PBS for completamente removida de cada um, adicione 200 microlitros de bactérias em meio DMEM em cada poço. Isso resulta em uma multiplicação de 10 a seis células de salmonela em cada poço e uma multiplicidade de MOI de infecção de 20 a uma centrifugação das placas em um recipiente lacrado a 1000 vezes G por 10 minutos.

Em seguida, coloque as placas em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por 30 minutos. Quando a incubação de 30 minutos estiver concluída, remova as placas da incubadora e lave cada poço três vezes com 200 microlitros de um XPBS para remover bactérias não associadas. Em seguida, 200 microlitros de meio DMEM contendo 100 microgramas por mililitro de gentamicina para cada poço das placas marcadas com invasão e replicação para matar a salmonela extracelular.

Em seguida, retorne as placas para uma incubadora de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por mais uma hora. Para a placa de associação, guarde um poço de cada cepa infectada para registrar a contagem de células de macrófagos e trate os poços restantes com 200 microlitros de um XPBS contendo 1% de tritton X 100 por 10 minutos. Para fatiar as células, colha a salmonela de cada poço e coloque-as em tubos de 1,5 mililitro e orph Faça três diluições de cereais dez vezes maiores com 900 microlitros de um XPBS nas amostras colhidas de cada poço e vórtice entre cada diluição vórtice a terceira diluição, 10 a três negativos para cada bactéria e coloque 10 microlitros da amostra em placas LB para o tipo selvagem ou placas LB.

Com pode micina para as cepas mutantes. Repita esta etapa quatro vezes para um total de cinco gotas de 10 microlitros espaçadas uniformemente nas placas depois que as gotas forem absorvidas no ágar, vire as placas e incube durante a noite Em uma incubadora a 37 graus Celsius, trate os poços restantes salvos para contar os macrófagos com 150 microlitros de um XPBS contendo 0,25% TRIPSIN EDTA por 10 minutos. Após a tripsina, transfira os macrófagos para tubos de 1,5 mililitro einor e trate com 50 microlitros de FBS para neutralizar a solução de tentina EDTA.

Em seguida, remova 10 microlitros da suspensão celular de um tubo EOR para um novo tubo. Adicione 10 microlitros de azul 0,4% triano para corar as células e conte-as em um hemocitômetro quando as placas de invasão e replicação completarem a incubação de uma hora na incubadora de dióxido de carbono. Retire as placas da incubadora e lave cada poço três vezes com 200 microlitros de um XPBS.

Em seguida, adicione 200 microlitros de meio DMEM contendo 10 microgramas por mililitro de gentamicina à placa de replicação para manter a depuração da salmonela extracelular no meio. Em seguida, coloque a placa em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por mais 22,5 horas. Em seguida, colha e reinfle a salmonela da placa de invasão em placas de ágar e conte os macrófagos de um poço de cada cepa infectada seguindo as etapas descritas para a placa de associação no dia seguinte.

Remova a placa de replicação da incubadora e lave cada poço três vezes com 200 microlitros de um XPBS. Em seguida, colha e reinfle a salmonela da placa de replicação em placas de ágar e conte os macrófagos de um poço de cada cepa infectada seguindo as etapas descritas para a placa de associação. Depois que as placas de ágar forem incubadas durante a noite em uma incubadora a 37 graus Celsius, remova as placas da incubadora e marque o número de colônias bacterianas por placa.

Ao contar cada placa, a distribuição das colônias deve ficar entre 10 e 100 colônias. Se a contagem for muito alta ou muito baixa, reesvazie a amostra com diluição dez vezes maior ou menor, conforme necessário. O ensaio de invasão de células fagocíticas identifica adequadamente o fenótipo dos mutantes de deleção de salmonela, como é mostrado para a cepa de controle de invasão delta INVA, um mutante defeituoso de invasão conhecido e a cepa de controle de replicação delta quatro P.

Um mutante defeituoso de replicação conhecido, mutante A e mutante B são duas cepas representativas ensaio Usando este protocolo que exibe fenótipos alterados para replicação em macrófagos 20 de 38. Os mutantes de Salmonella testados até agora no ensaio de invasão de células fagocíticas exibem defeitos variáveis, mas significativos, na invasão de associação e/ou replicação em macrófagos brutos 2 6 4 0,7. Este protocolo foi testado apenas para algumas células estáticas de efeito nala e hospedeiro.

Assim, a modificação e otimização serão necessárias para outras bactérias e células hospedeiras.