Conta Agregação ensaios para a caracterização dos putativos Moléculas de Adesão Celular

O objetivo geral deste procedimento é testar a capacidade dos domínios ecto proteicos de mediar a adesão homofílica para alcançar esses plasmídeos que codificam a fusão de um fragmento de domínio ecto com a região FC de IgG humana são transfectados em células HEC 2 93. As proteínas de fusão Odin FC secretadas são capturadas em esferas magnéticas conjugadas à proteína G e, após uma lavagem, as esferas revestidas podem interagir em solução. As esferas revestidas são então fotografadas para avaliar a extensão da agregação e, finalmente, quantificadas Usando uma análise de imagem simples, os dados resultantes revelam se a proteína em estudo é capaz de mediar a adesão homofílica.

As principais vantagens desta técnica em relação aos métodos existentes, como ensaios de agregação celular, é que ela é rápida, simples e testa diretamente a atividade adesiva da proteína escolhida. Demonstrando essa técnica estará a Dra. Michelle Eman, cientista sênior do laboratório. Comece este procedimento preparando as células cultivadas para NCA aqui ECFC, dois a três dias antes da transfecção.

Use 0,05% de viagens em EDTA para separar as células HEC 2 93 das placas de cultura. Prepare dois pratos de 100 milímetros para cada condição. Divida as células de um a cinco e depois cultive-as.

Meio de crescimento suplementado. Incube as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono até que estejam 60 a 80% confluentes. No dia da transfecção, use um reagente como a lipo para introduzir um plasmídeo que codifica a fusão FC.

Após a transfecção, retorne as células à incubadora por 24 horas no dia seguinte à transfecção Pré-aquecido, DMEM com estreptococos reprimidos e sem soro fetal bovino a 37 graus Celsius. Enxágue cada prato duas vezes com 10 mililitros do meio aquecido e, em seguida, retorne os pratos à incubadora de 37 graus Celsius por uma hora após a incubação, lave os pratos de cultura mais uma vez com 10 mililitros de DMEM sem soro fetal bovino por um total de três lavagens e, em seguida, incube as células seccionadas a 37 graus Celsius por mais 48 horas antes de coletar o meio. Quatro dias após a transfecção, use uma pipeta sorológica para coletar o meio de cada par de placas de cultura e transfira-o para um tubo cônico de 50 mililitros.

Em seguida, centrifugue o meio a 500 Gs por cinco minutos para pellet os detritos celulares após a centrifugação, despeje o meio de cada tubo cônico de 50 mililitros em uma seringa de 30 mililitros e filtre-o através de uma seringa de 0,45 mícron. Filtrar para um concentrador centrífugo. Girar os filtros centrífugos até que o volume do meio de cultura concentrado tenha sido reduzido para cerca de 500 microlitros.

Isso leva aproximadamente 15 minutos. Repita esse processo até que todo o meio de cultura tenha sido adicionado e concentrado. Em seguida, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para cada amostra a 1,5 microlitros de esferas magnéticas de proteína G para um mililitro de tampão de ligação a frio.

O aspecto mais difícil deste procedimento é a agregação do grânulo. Para garantir o sucesso, certifique-se de seguir exatamente o procedimento. Observe as contas rapidamente, mas não com muita severidade.

Eles nunca devem secar na lateral do tubo ou permanecer no ímã por muito tempo. Coloque o tubo em um ímã e, usando uma pipeta, aspire o tampão. Em seguida, adicione imediatamente o meio de cultura concentrado às esferas magnéticas da proteína G.

Gire os tubos a quatro graus Celsius por duas horas. Coloque os tubos em um ímã e remova o meio rapidamente. Lave as contas duas vezes com um mililitro de tampão de encadernação gelada e, em seguida, ressuspenda as grânulos em 300 microlitros de tampão de encadernação.

Divida as contas ressuspensas em dois tubos com 150 microlitros em cada tubo. Em seguida, adicione 1,5 microlitros de cloreto de cálcio ou EDTA para as condições de cálcio e sem cálcio, respectivamente. Transfira 100 microlitros de cada condição para uma depressão.

Bem deslize usando um microscópio de luz transmitida. Colete imagens de cinco campos de visão para cada experimento em cada ponto de tempo desejado. Usando a imagem J ou software de análise de imagem comparável.

Abra um dos cinco conjuntos de dados de imagem na imagem J no menu suspenso. Na parte superior da tela, selecione arquivo. Em seguida, selecione importar e, em seguida, sequência de imagens.

Encontre a pasta que contém os arquivos de imagem e abra-os como uma pilha de imagens. Em seguida, na barra de menu suspensa, clique na imagem e selecione propriedades. Para abrir a janela de propriedades lá.

Altere as unidades de imagem para pixels e defina a largura e a altura dos pixels para 1,0. Clique na imagem novamente, selecione ajustar e depois limite para abrir a janela de limite e use o controle deslizante para ajustar o limite da imagem. Inclua pixels que contribuam para contas e exclua pequenas partículas.

Aplique o limite a todas as imagens na pilha de imagens. Em seguida, na barra de menu suspensa na parte superior da tela. Clique em analisar.

Em seguida, selecione definir medidas para abrir a caixa de diálogo de medição usando as caixas de seleção selecione a área e a posição da pilha na parte superior da tela. Clique em analisar e selecione analisar partículas. Isso gerará uma lista de partículas identificadas, incluindo seu tamanho e a imagem em que foram identificadas.

Repita esse processo para cada experimento e cada condição experimental para determinar a capacidade adesiva dependente de cálcio do peixe-zebra e da caderina. As células HEC 2, 9, 3 foram transfectadas com o domínio NCAT herrina OD fundidas com dois fc e as seguintes células de agregação de esferas dependentes de cálcio foram fotografadas e analisadas conforme descrito neste vídeo, como pode ser visto nessas imagens. Na ausência de cálcio, as contas exibem pouca ou nenhuma tendência a se agregar, e não há aumento no tamanho do agregado com o tempo na presença de cálcio.

No entanto, os batimentos revestidos com NCAT aqui e ECFC mostram agregação robusta com o tamanho agregado aumentando ao longo do tempo como uma medida semiquantitativa de adesão. As imagens de luz transmitida de três experimentos foram analisadas para determinar o tamanho médio dos agregados. Como pode ser visto neste gráfico, a agregação de esferas revestidas com ECFC ncoer na presença de cálcio e na ausência de cálcio foi determinada em intervalos de 15 minutos.

Ao longo de uma hora, esses dados revelam que o domínio ecto do peixe-zebra n caderina medeia a adesão homofílica dependente de cálcio. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como testar se a adesão é uma propriedade bioquímica intrínseca de sua proteína de interesse.