Name: Conta Agregação ensaios para a caracterização dos putativos Moléculas de Adesão Celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Aprenda a realizar ensaios de agregação de contas para caracterizar moléculas de adesão celular usando domínios ectodermais marcados. Este método rápido e simples permite testar diretamente a atividade adesiva de proteínas em estudos de biologia celular.

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Este trabalho foi apoiado por um prêmio NSF/ARRA (IOS 0920357) e um prêmio do NIH (5R21MH098463).

1. celular Preparação (Dia -2 a 0) <ol><li> Dividir células HEK293 1: 5, utilizando 0,05% de solução de tripsina-EDTA e incubar em Meio de Crescimento a 37 ° C com 5% de CO 2 até os 60 - 80% confluentes (2-3 dias). Para cada condição, as células de cultura em 2 x 100 mm pratos. </li></ol> 2. transfecção celular (Dia 1) <ol><li> Transfectar células HEK293 com o plasmídeo que codifica a Fc-fusão usando um reagente de transfecção, tais como Lipofectamina. Podem também ser utilizados métodos alternativos, que resultam em maior eficiência de transfecção comparável. </li><li> Voltar células transfectadas para incubadora por 24 horas. </li></ol> 3. celular Propagation (Dia 2) <ol><li> Pré-aqueça o Meio de Crescimento, sem soro fetal de bovino (-FBS) a 37 ° C. </li><li> Lavar pratos 2x com 10 ml de Meio de Crescimento -FBS, e retornar as placas para a incubadora a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Lavar a culturas pratos mais uma vez com 10 ml de Meio de Crescimento -FBS, para um total de 3 lavagens. </li><li> INCUbate as células HEK293 transfectadas a 37 ° C por mais 48 horas sem FBS antes de coletar mídia. </li></ol> 4 Bead Aggregation (dia 4) <ol><li> Para a coleta de mídia a partir de placas de cultura, transferir mídia de cada par de pratos para 50 ml tubos cônicos e rotação a 500 xg durante 5 min para sedimentar os restos celulares. </li><li> O meio filtrante de tubo de 50 ml em um filtro centrífugo usando uma seringa de 30 ml e 0,45 mm filtro de seringa. </li><li> Girar filtros centrífugos a 4.000 xg e 4 ° C até que o volume de meio de cultura concentrado é de cerca de 500 mL (aproximadamente 15 min). Repita até que todos os meios de cultura foi adicionado e concentrada. </li><li> Adicionar 1,5 uL de proteína G contas magnéticas para 1 ml de tampão de ligação arrefecido em gelo, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para cada amostra, em lugar de um íman e remover o tampão. Imediatamente adicionar o meio de cultura concentrado de proteína G esferas magnéticas. </li><li> Rodar os tubos a 4 ° C durante 2 horas. </li><li> Pltubos ace em um ímã e remover a mídia. Lavar rapidamente contas duas vezes com o frio do gelo 1 ml tampão de ligação e, em seguida ressuspender contas em 300 mL tampão de ligação. </li><li> Dividir contas ressuspenso em 2 tubos de 150 mL em cada tubo, e em seguida, adicione 1,5 mL de mM CaCl2 ou 200 EDTA 200 mM para o &quot;cálcio&quot; e condições &quot;não cálcio&quot;, respectivamente. </li><li> Transferir 100 uL de cada condição para uma depressão bem deslizar e recolher micrografias usando um microscópio de luz transmitida (Figura 2). Recolha de imagens a partir de 5 campos de visão de cada experiência em cada ponto de tempo desejado. </li></ol> Análise de Dados 5. <ol><li> Usando ImageJ, ou software de análise de imagem comparável, abra um dos cinco conjuntos de dados de imagem usando o Import / sequência de imagens ... no menu suspenso Arquivo. Estes irão ser aberto como uma pilha de imagens. </li><li> Na caixa de diálogo ... Imagem / Propriedades, altere o iunidades mago pixels e definir Pixel Largura e Altura Pixel é 1.0. </li><li> Converta as imagens para binário usando o / Threshold Ajuste ... comando no menu suspenso Imagem. Definir o limite de incluir pixels que contribuem para esferas ou agregados de contas, mas que exclui fundo e pequenas partículas. Aplicar a todas as imagens da pilha. </li><li> Na caixa de diálogo Medidas Set, marque as caixas área e Pilha Posição. </li><li> Executar análise Partículas ... menu suspenso na Análise. Isto vai gerar uma lista de partículas identificados, incluindo o seu tamanho (área) e a imagem em que foram identificadas. </li><li> Repetir este processo por que experimento e condição experimental. </li></ol>

<ol><li>Chen, X., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraxial+protocadherin+mediates+cell+sorting+and+tissue+morphogenesis+by+regulating+C-cadherin+adhesion+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity.</a> J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).</li>
<li>Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+binding+of+Ng-CAM+to+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhes.+Commun%22%5BJournal%5D)">Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin.</a> Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).</li>
<li>Hatta, K., Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+cDNA+encoding+a+neural+calcium-dependent+cell+adhesion+molecule%3A+its+identity+in+the+cadherin+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family.</a> J. Cell Biol. 106 (3), 873-881 (1988).</li>
<li>Hirano, S., Nose, A., Hatta, K., Kawakami, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+cell-cell+adhesion+molecules+%28cadherins%29%3A+subclass+specificities+and+possible+involvement+of+actin+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules (cadherins): subclass specificities and possible involvement of actin bundles.</a> J. Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2501-2510 (1987).</li>
<li>Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expressed+recombinant+cadherins+mediate+cell+sorting+in+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems.</a> Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).</li>
<li>Nose, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cadherin+cell+adhesion+molecule%3A+its+expression+patterns+associated+with+implantation+and+organogenesis+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos.</a> J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).</li>
<li>Schreiner, D., Weiner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+homophilic+interaction+between+gamma-protocadherin+multimers+greatly+expands+the+molecular+diversity+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).</li>
<li>Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+correlation+between+cell+adhesive+properties+and+some+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface proteins.</a> J. Cell Biol. 75, 464-474 (1977).</li>
<li>Sivasankar, S., Brieher, W., Lavrik, N., Gumbiner, B., Leckband, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+molecular+force+measurements+of+multiple+adhesive+interactions+between+cadherin+ectodomains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Direct molecular force measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (21), 11820-11824 (1999).</li>
<li>Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurements+of+multiple+adhesive+alignments+and+unbinding+trajectories+between+cadherin+extracellular+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains.</a> Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).</li>
<li>Sivasankar, S., Zhang, Y., Nelson, W. J., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+initial+encounter+complex+in+cadherin+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Characterizing the initial encounter complex in cadherin adhesion.</a> Structure. 17 (8), 1075-1081 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+cadherin+interactions+and+binding+cooperativity+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).</li>
<li>Yasuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+protocadherin+arcadlin+regulates+dendritic+spine+number+by+triggering+N-cadherin+endocytosis+via+TAO2beta+and+p38+MAP+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases.</a> Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).</li>
<li>Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cadherin+extracellular+repeats+mediate+homophilic+binding+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion.</a> J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).</li>
<li>Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+of+Protocadherin-19+and+N-cadherin+mediates+a+novel+mechanism+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion.</a> J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).</li>
<li>Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clustered+protocadherins+Pcdhalpha+and+Pcdhgamma+form+a+heteromeric+complex+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish.</a> Neuroscience. 219, 280-289 (2012).</li>
<li>Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression%2C+alternative+splicing%2C+and+adhesive+properties+of+the+zebrafish+delta1-protocadherins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins.</a> Neuroscience. 199, 523-534 (2011).</li>
<li>Morishita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+cadherin-related+neuronal+receptor%2Fprotocadherin-alpha+first+extracellular+cadherin+domain+reveals+diversity+across+cadherin+families%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families.</a> J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).</li>
<li>Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+Drosophila+Dscam+generates+axon+guidance+receptors+that+exhibit+isoform-specific+homophilic+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding.</a> Cell. 118 (5), 619-633 (2004).</li>
<li>Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-adhesion+assays%3A+fabrication+of+an+E-cadherin+substratum+and+isolation+of+lateral+and+Basal+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches.</a> Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A adesão celular é um elemento essencial da vida multicelular e é mediada por uma ampla gama de proteínas de superfície da célula. Destes, as propriedades adesivas são detalhados compreendido por apenas uma proporção relativamente pequena. Aqui, nós descrevemos um protocolo simples, rápido para investigar a capacidade adesiva homofica de ectodomï¿½ios secretadas fundido com um epítopo marcador conveniente. Esta abordagem tem um número de vantagens importantes. Em primeiro lugar, as linhas de células estáveis ​​não são n...

A adesão célula-célula é essencial para o desenvolvimento e a integridade dos organismos multicelulares e é mediada por uma série diversa de moléculas da superfície celular. Muitas dessas moléculas de adesão foram identificados e caracterizados, embora muitos continuam a ser descobertos. Vários métodos são utilizados para pesquisar as propriedades das moléculas de adesão celular (CAMs), incluindo ensaios de separação de células, ensaios de agregação de células 1-8 e métodos biofísicos, tais como microscopia de força atómica e força espectroscopia superfície 9-12. A complexidade do mesmo simplificada em sistemas in vitro utilizando linhas celulares torna difícil determinar as propriedades adesivas de uma CAM putativo. Tipicamente, uma molécula é considerada uma CAM se que induz a agregação de células, quando transfectados para uma linha de células não adesivas. No entanto, é evidente que esta não é uma evidência directa de actividade adesiva. Por exemplo, facilitar a entrega da superfície celular ou a estabilidade de umCAM também resultaria em aumento da agregação de células 1,13. Além disso, um verdadeiro CAM pode falhar para mediar a agregação de células, se a linha de células não possui outros co-factores necessários para a entrega de superfície celular ou de estabilização. Para evitar essas complicações, ensaios mais diretas podem ser empregadas que são baseados na idéia de que as interações adesivas deve ser uma propriedade bioquímica intrínseca do domínio extracelular. Enquanto contas foram inicialmente utilizados para caracterizar Ng-CAM 2, estes ensaios foram alargadas, a fim de investigar a adesão 12,14,15 mediada por caderina. Usando fusão das fusões C-caderina-Fc ectodomínio, o laboratório Gumbiner mostrou que múltiplas repetições caderina contribuem para interacções homofílicas 14. Usando ensaios de agregação de talão comparáveis, E-caderina e N-caderina de adesão foram também caracterizados 12,15, como tem um número de protocadherins 1,15-18 e isoformas Dscam de Drosophila <em&gt; 19. Descrevemos aqui um ensaio relativamente simples e rápido para a caracterização da actividade adesiva de secretadas, ectodomï¿½ios marcadas no epitopo de CAMs homofica putativos (Figura 1). Temos utilizado este ensaio, principalmente para caracterizar membros da superfamília caderina.

<table><tbody><tr><td>plasmídeo pFc-N1</td><td>Addgene</td><td>A ser submetido</td><td></td></tr><tr><td>HEK293 células</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech - Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>100x Pen-Strep (10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668030</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads &ndash; Proteína G</td><td>Life Technologies</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Albumina</td><td>Sigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Depressão</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>71878-06</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-15 com membrana Ultracel-10</td> Filtro de seringa <td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>0,45 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ) Software de análise de imagem</td><td><a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela de tampões/soluções</td></tr><tr><td>Mídia de crescimento</td><td>DMEM + 10% FBS + Filtro Pen-Strep</td><td>esterilizar e armazenar a 4 °C.</td><td></td></tr><tr><td>Mídia de crescimento - FBS</td><td>DMEM + Filtro Pen-Strep</td><td>esterilizar e armazenar a 4 °C.</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de ligação</td><td>50 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,2% BSA</td><td>Vórtice até dissolver, manter no gelo.</td><td></td></tr></tbody></table>

conta agregação ensaios para a caracterização dos putativos moléculas de adesão celular

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

A adesão célula-célula é fundamental para a vida multicelular e é mediada por uma série diversa de proteínas da superfície celular. No entanto, as interacções adesivas para muitas destas proteínas são mal compreendidos. Aqui apresenta-se um método simples e rápido para a caracterização das propriedades adesivas das moléculas de adesão de células homofílicas putativos. As células em cultura são HEK293 transfectadas com o plasmídeo de ADN que codifica uma secretado, o ectodomínio de epitopo marcado com uma proteína da superfície celular. Usando grânulos funcionalizados específicos para o marcador de epitopo, solúvel, da proteína de fusão segregado é capturado a partir do meio de cultura. Os grânulos revestidos podem, então, ser utilizada directamente em ensaios de agregação de grânulos ou em grânulo fluorescente triagem ensaios para testar quanto à adesão homofílica. Se desejado, a mutagénese pode ser usada para elucidar os ácidos aminados ou domínios específicos necessários para a aderência. Este ensaio requer apenas pequenas quantidades de proteínas expressas, não requer a produção de linhas celulares estáveis, e pode ser Accomplished em 4 dias.

Um exemplo experiência é apresentado na Figura 2, que mostra a agregação de grânulo dependente de cálcio pelo ectodomínio de N-caderina fundido com Fc (NcadEC-Fc). Na ausência de cálcio, esferas exibem pouca ou nenhuma tendência para se agregar e não há aumento do tamanho do agregado, com o tempo (Figura 1A, C). Na presença de cálcio, contas revestidas com NcadEC-Fc mostra a agregação robusta, com tamanho de agregado crescente ao longo do tempo (Figura 1B, C). Esta expe...

Aqui apresentamos um método simples e rápido para caracterizar as propriedades adesivas intrínsecas de moléculas putativas de adesão celular. O ectodomínio secretado e marcado com epítopos de uma molécula de adesão celular é capturado do meio de cultura em grânulos funcionalizados pequenos e uniformes. Esses grânulos podem então ser usados imediatamente em ensaios simples de agregação de grânulos.

Conta Agregação ensaios para a caracterização dos putativos Moléculas de Adesão Celular

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

O objetivo geral deste procedimento é testar a capacidade dos domínios ecto proteicos de mediar a adesão homofílica para alcançar esses plasmídeos que codificam a fusão de um fragmento de domínio ecto com a região FC de IgG humana são transfectados em células HEC 2 93. As proteínas de fusão Odin FC secretadas são capturadas em esferas magnéticas conjugadas à proteína G e, após uma lavagem, as esferas revestidas podem interagir em solução. As esferas revestidas são então fotografadas para avaliar a extensão da agregação e, finalmente, quantificadas Usando uma análise de imagem simples, os dados resultantes revelam se a proteína em estudo é capaz de mediar a adesão homofílica.As principais vantagens desta técnica em relação aos métodos existentes, como ensaios de agregação celular, é que ela é rápida, simples e testa diretamente a atividade adesiva da proteína escolhida. Demonstrando essa técnica estará a Dra. Michelle Eman, cientista sênior do laboratório. Comece este procedimento preparando as células cultivadas para NCA aqui ECFC, dois a três dias antes da transfecção.Use 0,05% de viagens em EDTA para separar as células HEC 2 93 das placas de cultura. Prepare dois pratos de 100 milímetros para cada condição. Divida as células de um a cinco e depois cultive-as.Meio de crescimento suplementado. Incube as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono até que estejam 60 a 80% confluentes. No dia da transfecção, use um reagente como a lipo para introduzir um plasmídeo que codifica a fusão FC.Após a transfecção, retorne as células à incubadora por 24 horas no dia seguinte à transfecção Pré-aquecido, DMEM com estreptococos reprimidos e sem soro fetal bovino a 37 graus Celsius. Enxágue cada prato duas vezes com 10 mililitros do meio aquecido e, em seguida, retorne os pratos à incubadora de 37 graus Celsius por uma hora após a incubação, lave os pratos de cultura mais uma vez com 10 mililitros de DMEM sem soro fetal bovino por um total de três lavagens e, em seguida, incube as células seccionadas a 37 graus Celsius por mais 48 horas antes de coletar o meio. Quatro dias após a transfecção, use uma pipeta sorológica para coletar o meio de cada par de placas de cultura e transfira-o para um tubo cônico de 50 mililitros.Em seguida, centrifugue o meio a 500 Gs por cinco minutos para pellet os detritos celulares após a centrifugação, despeje o meio de cada tubo cônico de 50 mililitros em uma seringa de 30 mililitros e filtre-o através de uma seringa de 0,45 mícron. Filtrar para um concentrador centrífugo. Girar os filtros centrífugos até que o volume do meio de cultura concentrado tenha sido reduzido para cerca de 500 microlitros.Isso leva aproximadamente 15 minutos. Repita esse processo até que todo o meio de cultura tenha sido adicionado e concentrado. Em seguida, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para cada amostra a 1,5 microlitros de esferas magnéticas de proteína G para um mililitro de tampão de ligação a frio.O aspecto mais difícil deste procedimento é a agregação do grânulo. Para garantir o sucesso, certifique-se de seguir exatamente o procedimento. Observe as contas rapidamente, mas não com muita severidade.Eles nunca devem secar na lateral do tubo ou permanecer no ímã por muito tempo. Coloque o tubo em um ímã e, usando uma pipeta, aspire o tampão. Em seguida, adicione imediatamente o meio de cultura concentrado às esferas magnéticas da proteína G.Gire os tubos a quatro graus Celsius por duas horas. Coloque os tubos em um ímã e remova o meio rapidamente. Lave as contas duas vezes com um mililitro de tampão de encadernação gelada e, em seguida, ressuspenda as grânulos em 300 microlitros de tampão de encadernação.Divida as contas ressuspensas em dois tubos com 150 microlitros em cada tubo. Em seguida, adicione 1,5 microlitros de cloreto de cálcio ou EDTA para as condições de cálcio e sem cálcio, respectivamente. Transfira 100 microlitros de cada condição para uma depressão.Bem deslize usando um microscópio de luz transmitida. Colete imagens de cinco campos de visão para cada experimento em cada ponto de tempo desejado. Usando a imagem J ou software de análise de imagem comparável.Abra um dos cinco conjuntos de dados de imagem na imagem J no menu suspenso. Na parte superior da tela, selecione arquivo. Em seguida, selecione importar e, em seguida, sequência de imagens.Encontre a pasta que contém os arquivos de imagem e abra-os como uma pilha de imagens. Em seguida, na barra de menu suspensa, clique na imagem e selecione propriedades. Para abrir a janela de propriedades lá.Altere as unidades de imagem para pixels e defina a largura e a altura dos pixels para 1,0. Clique na imagem novamente, selecione ajustar e depois limite para abrir a janela de limite e use o controle deslizante para ajustar o limite da imagem. Inclua pixels que contribuam para contas e exclua pequenas partículas.Aplique o limite a todas as imagens na pilha de imagens. Em seguida, na barra de menu suspensa na parte superior da tela. Clique em analisar.Em seguida, selecione definir medidas para abrir a caixa de diálogo de medição usando as caixas de seleção selecione a área e a posição da pilha na parte superior da tela. Clique em analisar e selecione analisar partículas. Isso gerará uma lista de partículas identificadas, incluindo seu tamanho e a imagem em que foram identificadas.Repita esse processo para cada experimento e cada condição experimental para determinar a capacidade adesiva dependente de cálcio do peixe-zebra e da caderina. As células HEC 2, 9, 3 foram transfectadas com o domínio NCAT herrina OD fundidas com dois fc e as seguintes células de agregação de esferas dependentes de cálcio foram fotografadas e analisadas conforme descrito neste vídeo, como pode ser visto nessas imagens. Na ausência de cálcio, as contas exibem pouca ou nenhuma tendência a se agregar, e não há aumento no tamanho do agregado com o tempo na presença de cálcio.No entanto, os batimentos revestidos com NCAT aqui e ECFC mostram agregação robusta com o tamanho agregado aumentando ao longo do tempo como uma medida semiquantitativa de adesão. As imagens de luz transmitida de três experimentos foram analisadas para determinar o tamanho médio dos agregados. Como pode ser visto neste gráfico, a agregação de esferas revestidas com ECFC ncoer na presença de cálcio e na ausência de cálcio foi determinada em intervalos de 15 minutos.Ao longo de uma hora, esses dados revelam que o domínio ecto do peixe-zebra n caderina medeia a adesão homofílica dependente de cálcio. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como testar se a adesão é uma propriedade bioquímica intrínseca de sua proteína de interesse.

bead-aggregation-assays-for-characterization-putative-cell-adhesion

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Um ensaio de freqüência de adesão para medir cinética de interação receptor-ligante, quando ambas as moléculas estão ancoradas nas superfícies das células que interagem é descrito. Este ensaio mecanicamente baseado é exemplificado usando uma micropipeta pressurizado glóbulo vermelho humano como sensor de adesão e integrinas αLβ2 e molécula-1 de adesão intercelular como interagindo receptores e ligantes.

Ensaio de aderência de freqüência para In Situ Análise Cinética de Cross-juncional interações moleculares na interface célula-célula

Neste vídeo, demonstramos a técnica para medir as interações transcelulares entre moléculas de adesão celular sináptica por meio do ensaio de agregação de células HEK. Neste ensaio, um número igual de células HEK expressando uma molécula de adesão celular pré-sináptica desejada e uma proteína fluorescente são misturadas com células HEK expressando uma molécula de adesão celular pós-sináptica e outra proteína fluorescente. A interação entre as moléculas de adesão celular força as células a se...

Ensaio de agregação celular para detectar interações trans entre moléculas de adesão celular

Relatamos um método in vitro que permite a quantificação do número real de células adesivas dentro de uma monocamada de células endoteliais.

A quantificação da Adesividade celular endotelial<em&gt; In Vitro</em

A ligação bacteriana às células hospedeiras é uma etapa fundamental durante a colonização e infecção do hospedeiro. Este protocolo descreve a geração de adesinas recombinantes acopladas a polímeros como materiais biomiméticos que permitem a análise da contribuição de adesinas individuais para esses processos, independentemente de outros fatores bacterianos.

Materiais biomiméticos para caracterizar as interações bactérias hospedeiras-

Este ensaio de adesão fluxo fornece um modelo de impacto simples, alta de interações celulares de células-epitelial T. Uma bomba de seringa é utilizado para gerar a tensão de corte, e microscopia confocal captura imagens para efeitos de quantificação. O objectivo destes estudos é o de quantificar eficazmente a adesão de células T utilizando condições de fluxo.

Ensaio de Adesão Sob tensão de cisalhamento para o Estudo da Linfócitos T-Molécula de adesão de Interações

aderências na superfície celular são centrais na mecanotransdução, como eles transmitem tensão mecânica e iniciar as vias de sinalização envolvidos na homeostase e desenvolvimento do tecido. Aqui, apresentamos um protocolo para dissecar as vias bioquímicas que são ativadas em resposta à tensão, utilizando microesferas magnéticas revestidas com ligando e aplicação de força para receptores de adesão.

Analisando celular superfície de adesão remodelação em resposta à tensão mecânica usando pérolas magnéticas

Este estudo demonstra a utilidade e a facilidade de medição de extensão quantitativa da membrana celular e sua correlação com capacidade adesiva de células. Como um exemplo representativo, mostramos aqui essa proteína relacionada ao Dickkopf 3 (DKK3) promove aumento lobopodia formação e aderência de célula em carcinoma adrenocortical em vitrode células.

Caracterização de extensões da membrana celular e estudando seus papéis na dinâmica de adesão celular câncer

Adesão dinâmica de células imunes a parede do vaso é um pré-requisito para hospedagens de intestino. Aqui, apresentamos um protocolo para um ensaio funcional em vitro para a análise de impacto de anticorpos anti-integrina, quimiocinas ou outros fatores sobre a adesão da dinâmica celular de células humanas usando capilares morada-revestido.

Ensaio de adesão dinâmico para a análise funcional das terapias antiaderência na doença inflamatória intestinal

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para medir rapidamente e semiquantitativamente as interações ligantes-receptores em trans em um sistema celular heterologous usando microscopia de fluorescência.

Medindo interações transcelulares através da agregação de proteínas em um sistema celular heterologous

O artigo descreve a quantificação de 1) o tamanho e o número de aderências focais e 2) índice de forma celular e sua distribuição a partir de imagens confocal das monocamadas confluentes das células MCF7.

Quantificação da área de adesão de substrato celular e distribuições de formas celulares em monocamadas de células MCF7

Este protocolo apresenta os procedimentos experimentais para realizar o ensaio da pegada de adesão para a imagem dos eventos de adesão durante a adesão rápida ao rolamento celular.

A adesão molecular de imagem em rolamento celular por ensaio de pegada de adesão

Aprenda a realizar ensaios de agregação de contas para caracterizar moléculas de adesão celular usando domínios ectodermais marcados. Este método rápido e simples permite testar diretamente a atividade adesiva de proteínas em estudos de biologia celular.

Conta Agregação ensaios para a caracterização dos putativos Moléculas de Adesão Celular

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