Name: Zinc-finger nucleases Gene maior focalização em células estaminais embrionárias humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Aprenda a editar genes em células estaminais embrionárias humanas usando nucleases de dedo de zinco para direcionar transgenes ao locus PITX3. Este método facilita estudos sobre desenvolvimento do SNC.

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Trabalho descrito neste protocolo foi possível graças ao financiamento do Governo de Victoria, como parte de uma aliança de colaboração com o Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (CIRM).

Todos os procedimentos são realizados numa câmara de fluxo laminar estéril. Todos os meios e as soluções são equilibradas a 37 ° C, salvo especificação em contrário. 1 Expansão de unidades Humanos (hESCs e hiPSCs, WA-09 utilizado no presente protocolo) para transfecção Nota: Não é necessário ampliar hESCs sobre Matrigel ou Geltrex. hESCs expandidas em fibroblastos embrionários de ratinho (MEFs) pode ser utilizado para a electroporação ou nucleofection seguir um passo de remoção de MEF (ver secção 2.8). <ol><li> Preparar uma placa de 100 mm x 1 e x frascos de 75cm2 DR4 MEFs a 2,0 x 10 4 culas por cm 2 em meio de MEF (ver Tabela 1) em placas pré-revestidas com 0,1% w / v de gelatina. Nota: CF1, BLK6 ou MF1 MEFs pode ser utilizado, no entanto, recomenda-se que as linhas de MEF resistentes a antibióticos são usados, por exemplo, DR410. </li><li> No dia seguinte, hESCs passagem num prato 100 milímetros pré-revestida com MEFs preparados na seção 1.1. Para fazer isso aspitaxa hESC meios de culturas pratos, lavar hESCs com solução salina balanceada Ca2 + / Mg2 + Livre de Hanks (HBSS), adicione Dispase (ver Tabela 2 para as quantidades adequadas) e coloque em uma incubadora umidificada a 37 ° C / 5% de CO2. Após a incubação de 3-5 minutos, aspirado e Dispase lavar cuidadosamente 1-2 vezes com HBSS para remover MEFs. Adicionar meios de células estaminais embrionárias humanas (ver Tabela 3) e utilizando um raspador de células, ou 5 ml de pipeta, raspe as colónias para fora da superfície da placa de cultura. </li><li> Colete os fragmentos de colônias em suspensão da placa de cultura para um tubo de centrífuga de 15 ml. Placa de cultura Enxaguar com media hESC e transferência para o tubo de 15 ml. Tenha cuidado para não quebrar aglomerados em células individuais ou em pequenos fragmentos. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 160 xg para sedimentar fragmentos da colônia. </li><li> Aspirar o sobrenadante. Toque fundo do tubo de 15 ml com o dedo para soltar colônia fragmento pellet. Fragmentos de colônias suavemente ressuspender em media hESC de acordo com a taxa de divisão (normallya dividir proporção entre 1: 4 e 1: 8 é o caso). Tenha muito cuidado para não tornar aglomerados em células individuais ou em pequenos fragmentos como isso vai afetar repique eficiência. </li><li> Antes replating fragmentos hES para lavar MEFs 1x com HBSS. Lentamente, adicionar uma quantidade adequada (ver Tabela 2) de suspensão de células contendo fragmentos de células estaminais embrionárias humanas em células estaminais embrionárias humanas a mídia pratos pré-revestidos a MEFs. </li><li> Coloque placas de cultura na prateleira na incubadora e mover-se lentamente para trás e para a frente e para os lados para distribuir uniformemente fragmentos da colônia. </li><li> Substituir mídia hESC diária. </li><li> Para preparar meios condicionados de MEFs (MEF-CM) lavar os 75 cm 2 frascos pré-revestida com MEFs 1 x com HBSS. Adicionar media hESC. Após 24 horas, recolher meios condicionados e substituir com media hESC fresco. Repita diariamente por um período máximo de 12 dias. Armazenar MEF-CM a 4 ° C até ser necessário. </li></ol> 2 Preparação do CES Humanos para transfecção <ol><li> Observar o crescimento de hESCssob um microscópio diariamente. Quando as colônias tornam-se 40-50% confluentes, a placa 3 x 100 mm pratos com 2,0 x 10 5 MEFs por cm 2. </li><li> Quando as colônias tornam-se 60-70% confluentes eles estão prontos para ser transfectados. colônias &#39;noivo&#39;, removendo colônias diferenciados ou para núcleos de colônia. Observação: Como acreditamos maior eficiência de transfecção e segmentação ocorrer quando as células estão na fase de crescimento logarítmico, é sugerido que a electroporação ser conduzida antes de chegar hESCs ≥ 70% de confluência. </li><li> Lave colônias hESC com HBSS e adicionar Accutase. Nota: Não é necessário hESCs para o pré-tratamento com inibidor ROCHA Y-27632 inibição suficiente ocorrerá quando incubadas com Y-27632 durante a etapa 2.7 </li><li> Incuba-se durante 10 - 20 min a 37 ° C / 5% de CO 2 até colónias são processados ​​células individuais como visto sob um microscópio. Tritura-se com células de uma pipeta de 1 ml. </li><li> Adicionar media hESC e filtro em um tubo de 15 ml utilizando uma straine 40 um celularr para remover aglomerados de células. </li><li> Centrifugar a 160 xg por 5 min. Ressuspender pellet celular em media hESC frescos e repita para remover qualquer solução Accutase residual. </li><li> Ressuspender as células em meio contendo 10 uM de hES Y-27632 e transferir a suspensão de células totais de uma placa de 100 mm Pré-revestidas com gelatina. </li><li> Incubar a 37 ° C / 5% de CO 2 durante um período mínimo de 30 min. </li><li> Durante este tempo MEFs vai aderir ao prato revestido de gelatina. Recolhe hESCs não aderentes utilizando uma pipeta de 1 ml em 15 ml de um novo tubo de centrífuga e determinar a densidade de células utilizando um hemocitómetro. </li></ol> 3. Eletroporação de hESCs <ol><li> Meio Filtrante CM-MEF usando um filtro de 0,22 um e adicionar 10 fator de crescimento de fibroblastos humana recombinante ml / ng 2 (rhFGF2). </li><li> Transferir 7,5 x 106 hESCs de secção 2.9 para um novo tubo de 15 ml e centrifugar a 160 xg durante 5 min. </li><li> Durante esse tempo, criou o electroporator: Select programa para ELE exponencialctroporation e definir os seguintes parâmetros, Tensão: 250 V, Capacidade: 500 mF, e Resistance: ∞-. </li><li> Aspirar o sobrenadante e re-suspensão da pelota celular em 0,8 ml de gelado de 0,22 um filtrado HBSS. Transferir a solução para um estéril 0,4 centímetros de eletroporação cuvete. </li><li> Adicione-TV-hPITX3 frente segmentação construção (30 mg DNA) e misture delicadamente com uma pipeta de 200 mL. Incubar em gelo por 5 min. Durante este tempo, retire uma alíquota de PITX3 ZFN mRNA e descongelar em gelo. Quando descongeladas transferência 7,5 ul de ADN de ARNm de ZFN mistura / célula em cuvete de electroporação. Misture delicadamente com uma pipeta de 200 mL. Nota: O local a ser alvo é o principal fator que contribui para o direcionamento eficiência. Codificação Loci genes silenciosos, genes não expressos na CES, como PITX3 são difíceis de atingir usando recombinação homóloga convencional 6. Assim, este protocolo utiliza costume ZFNs projetado para o locus PITX3 humano para induzir um DNA dupla vertente break. </li><li> Electroporate, seguindo as instruções na tela no electroporator. </li><li> Usando uma pipeta de 200 uL transferir o conteúdo da cuveta de electroporação com um tubo de 15 ml contendo 10 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas. Lave a cuba duas vezes com 200 mL de mídia hESC cada vez e transferir para um tubo de 15 ml. Haverá &quot;muco-like&quot; detritos que consiste em DNA e proteínas das células lisadas que irá impactar negativamente a sobrevivência das células. Centrifugar a 160 xg por 5 min para remover os entulhos. </li><li> Aspirar o sobrenadante e bata suavemente pellet celular para soltar. Re-suspender em 30 ml suplementados MEF-CM contendo 10 mM Y-27632 e replate para 3 x 100 mm pratos preplated com MEFs. </li><li> Troque a mídia diariamente. No dia 2, Y-27632 pode ser retirado e as células cultivadas em apenas media hESC. </li><li> Depois de 2-3 dias o hESCs deverá ser de 50-70% confluentes. Neste ponto começa selecção de antibiótico (por exemplo, 0,5 ug / ml de puromicina). </li><li> Manter selexão adicionando fresco media hESC / ï¿½puromicina diária. Depois de ~ 7 dias pequenas colônias devem ser visíveis. Se MEFs resistentes a antibióticos não são utilizados, MEFs pode ser suplementada pela adição de um adicional de 1,0 x 10 células por 4 cm2. </li></ol> 4. Picking Clones Transgênicos hESC <ol><li> Cerca de 14-21 dias após a seleção (quando as colônias atingiram ~ 1 milímetro de diâmetro) para preparar as placas de expansão e de triagem. Começar por descongelamento de uma alíquota de Matrigel ou Geltrex a 4 ° C durante um mínimo de 5 horas. Dilui-se de acordo com as instruções dos fabricantes e adicionar 75 ul a cada poço de placas de 3 x 96 poços. Prepare pratos 3 x 48 poços por plaqueamento MEFs a 2.0 x 10 4 células por cm 2. Incubar as duas placas O / N a 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> No dia seguinte dissecar colónias em 16-25 peças usando uma agulha 21 G na extremidade de uma pipeta de 2 ml por meio de corte de uma grade. </li><li> Aspirar Matrigel a partir de placas de 96 poços e substituir com Supplemmídia entadas CM-MEF. Lave MEFs em placas de 48 poços 1 x com HBSS e add media hESC. </li><li> Usando uma pipeta de 200 uL suavemente transferir uma terços da colónia dissecado em uma placa de 48 poços para expansão. Transferir o outro dois terços da colónia dissecado em uma placa de 96 poços contendo meio correspondente CM-MEF suplementados. </li><li> Manter ambas as placas, alterando os meios de comunicação diária (suplementado meios de CM-MEF para placas revestidas matrigel 96 poços e meios de células estaminais embrionárias humanas para placas de 48 poços contendo MEFs; ambos suplementados com 0,5 ug / ml de puromicina). </li><li> Expandir até placas de 96 poços são 100% confluentes e, em seguida, inicialmente através de rastreio por PCR. </li></ol> 5. Triagem e Expansão das clones positivos <ol><li> Para preparar DNA genômico (método baseado em 11) Remova todas as mídias placas invertendo, em seguida, seque em papel toalha. </li><li> Lavar cada poço duas vezes com PBS temperatura ambiente (100 ul / poço de cada lavagem), inverter e blot como no passo 5.1. Coloque as placas a -80 ° C fou 1 - 2 h para auxiliar na lise celular (placas podem ser armazenadas indefinidamente como este). </li><li> Enquanto as células são uma temperatura entre -80 ° C fazer sarcosil Tampão de Lise (ver Tabela 4) (50 uL / poço). Para lisar as células, as placas quentes durante 5 min à temperatura ambiente, em seguida tampão de lise pipeta em cada cavidade. Selar as bordas de cada placa com fita, coloque em um recipiente lacrado contendo papel toalha umedecido para criar umidade, e incubar O / N a 60 ° C. </li><li> Após a incubação, adicionar 150 ul de NaCl 5 M a 10 ml de -20 ° C de etanol absoluto, misturar bem e adicionar 100 ul a cada poço (Nota: etanol vai turva quando é adicionado NaCl). Placas Toque suavemente para misturar (não pipeta) e deixe por um mínimo de 30 minutos em temperatura ambiente. Durante este tempo, a solução irá clara e o ADN precipitar. </li><li> Remova a solução tal como no passo 5.1, em seguida adicionar 150 ul de etanol a 70% a cada poço. Inverta placa suavemente e apaga como antes. Repetir esta etapa umas 2x. Nota: Como o DNA precipitado naturalmente Adheres para a cultura de tecidos de plástico não se soltar durante essas etapas de lavagem.) </li><li> Após a lavagem final, as placas brevemente centrífuga a uma velocidade superior a concentrar-se o DNA para o fundo de cada poço em seguida secar ao ar à temperatura ambiente (ou 37 ° C) durante pelo menos 30 min. </li><li> Adicionar 40-50 uL T0.1E (pH 8,0) (ver Tabela 5) ou TE (pH 8,0) a cada poço e colocam as placas a 65 ° C durante 1 h ou a 4 ° CO / N antes de usar para a PCR. Ressuspender o ADN batendo suavemente os lados da placa. Use 1-2 uL da re-suspensão de ADN / 10 uL da reacção de PCR. </li><li> Usando o Modelo longo PCR System Expandir com hPITX3 L braço gen. F e G hPITX3 braço GFP R primers realizar a triagem inicial de clones a 58 ° C de recozimento, 45 seg de extensão, 35 ciclos. </li><li> Amostras de electroforese com 1kb Hyperladder em um gel de agarose a 1% contendo GelRed a 100 V durante 45 min e detecção de clones positivos por meio de iluminação UV. </li><li> Validar clones positivos de PCR por digestão de ADN genómico a partir de expaclones NDED (ver abaixo) com HindIII e hibridação de sondas de 5 &#39;e 3&#39; dos braços de vector de homologia para uma mancha de Southern (conforme anteriormente descrito em 1). As sondas são gerados por PCR utilizando os pares de iniciadores hPITX3 sonda 5 &#39;F e R, e hPITX3 3&#39; da sonda F e I, digerido com EcoRI e ligado num vector de clonagem geral. </li><li> Dependendo do número de clones positivos, preparar duas cavidades de uma placa de 6 poços por pré-plaqueamento (MEFs com 2,0 x 10 células por 4 cm2). </li><li> No dia seguinte, pré-tratamento de clones positivos na placa de 48 poços com 10 uM Y-27632 por um período mínimo de 1 hora. </li><li> Lave clones positivos com HBSS e adicione 300 ml de Accutase. </li><li> Quando as colônias são prestados células individuais, adicionar 1 ml de mídia hESC e recolher em um tubo de 15 ml. </li><li> Troque a mídia diariamente. No dia 2, Y-27632 pode ser retirado e as células cultivadas em meio hESC. </li><li> Quando as colônias são 70-80% confluentes, subcultura e congelar o resto do colofragmentos NY. </li></ol>

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<li>Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+periods+of+neural+induction+and+propagation+of+embryonic+stem+cell-derived+neural+progenitors+with+EGF+and+FGF2+enhances+Lmx1a+expression+and+neurogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Extended periods of neural induction and propagation of embryonic stem cell-derived neural progenitors with EGF and FGF2 enhances Lmx1a expression and neurogenic potential.</a> Neurochemistry International. 59 (3), 394-403 (2011).</li>
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<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+embryonic+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human embryonic cells using TALE nucleases.</a> Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).</li>
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<li>Denham, M., Thompson, L. H., Leung, J., Pébay, A., Björklund, A., Dottori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gli1+is+an+inducing+factor+in+generating+floor+plate+progenitor+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Gli1 is an inducing factor in generating floor plate progenitor cells from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 28 (10), 1805-1815 (2010).</li>
<li>Smidt, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homeodomain+gene+Ptx3+has+highly+restricted+brain+expression+in+mesencephalic+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A homeodomain gene Ptx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 94, 13305-13310 (1997).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A geração de linhas celulares repórter oferece um meio poderoso para rastrear, visualizar e isolar as células de interesse de uma população heterogênea derivado de hESCs. No entanto, a abordagem selectiva de genes através de recombinação homóloga convencional provou ser extremamente ineficiente para o CES humanos 3. Neste protocolo, descrevem uma técnica relativamente simples para a introdução de uma RP para um exão do locus PITX3, em hESCs utilizando um vector de direccionamento amplamente disponíve...

Current células estaminais embrionárias (ESC) protocolos de diferenciação resultar em populações celulares heterogéneas, em particular no que diz respeito à determinação de fenótipos neuronais específicas. Assim, embora as culturas contêm o fenótipo celular desejado, outro neuronal, tipos de células não-neuronais e não-diferenciados estão freqüentemente presentes 1. Estas características de limitar a aplicação da CES derivado de fontes celulares para utilização na terapia de substituição de células e em modelos in vitro da doença. Linhas de células repórteres genéticos oferecer um meio para visualizar, rastrear e isolar as células de interesse, desde que a expressão da proteína repórter (RP) reproduz expressão endógena. A utilização de promotores imediatamente a montante de uma região codificante do gene podem ser utilizados para derivar os repórteres genéticos bruto mas tais construções não possuem os elementos reguladores que controlam a expressão precisos gene endógeno. Em contraste, a recombinação homóloga ofereceoportunidade de assegurar a expressão de alta fidelidade da RP. No passado, os vectores de direccionamento concebidos para a recombinação homóloga no locus específico de interesse foram utilizados para direccionar RPS em rato (CES mESCs) utilizando electroporação, como um meio de entrega de ADN de 1,2. No entanto, a geração de linhas de células repórteres via recombinação homóloga convencional é extremamente ineficiente para humanos (CES hESCs), e, assim, só tem sido documentada em diversos casos (revista em 3). Ao utilizar uma proteína quimérica engenharia contendo uma fusão de uma nuclease Fok I com motivos de dedos de zinco específicas do local, conhecidos colectivamente como nucleases de dedos de zinco (ZFNs), quebras de ADN de cadeia dupla pode ser introduzida no locus genómico pre-determinado. Quando um vector de ADN com homologia com ambos os lados da ruptura de DNA de cadeia dupla é adicionado, o sítio genómico pode ser reparada por recombinação homóloga, permitindo a incorporação da sequência de ADN dador. Esta técnica provou ser útil fou edição genômica em células primárias humanas 4,5 e 6,7 hESCs. Trabalhos mais recentes tem utilizados activadores de transcrição, como efectoras nucleases (TALENS), factores de transcrição utilizadas por agentes patogénicos 8, para auxiliar na criação de site-specific nucleases 9. No seguinte protocolo que demonstram a geração de uma linha celular de células estaminais embrionárias humanas repórter por electroporação de um vector de EGFP contendo homólogo direccionamento 6 em conjunto com ZFNs para a homeobox pituitária humana 3 (PITX3) local. Após a seleção de antibióticos por 2-3 semanas, hESCs com DNA corretamente integrado pode ser escolhido manualmente, expandiu e selecionados, inicialmente, via PCR, e posteriormente validada por Southern blotting.

<table><tbody><tr><td>Fibroblastos Embrionários de Camundongo (DR4)</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6004G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gelatina Sigma</td><td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, sem Cálcio, sem Magnésio, sem Fenol Vermelho (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de Células</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Axônio Medchem</td><td>Axônio 1683</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Células - 40 &mu; m</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>33 mm - 0,22 &mu; m filtro</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>rhFGF2</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025/CF</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>BioRad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de eletroporação de 0,4 cm</td><td>BioRad</td><td>165-2088</td><td></td></tr><tr><td>Human TV-hPITX3-construção de direcionamento frontal</td><td>Addgene</td><td>31942</td><td></td></tr><tr><td>ZFN Kit; Humano PITX3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CKOZFN1050-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr-1</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Life Technologies</td><td>A1569601</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino, Qualificado, Inativado por Calor, Origem dos EUA (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais MEM&nbsp; (NEAA)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-mercaptoetanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Solução de sal de sódio N-Lauroilsarcosina (Sarcosyl) (30%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61747</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e9884?lang=en&amp; região = US ">E9884< / a ></td><td></td></tr> <tr><td>Cloridrato de Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Solução de proteinase K (20 mg / ml)</td> <td>Bioline Australia</td><td>BIO-37084</td><td></td></tr><tr><td>Expand Long Template PCR System</td><td>Roche Australia</td><td>11681834001</td><td></td></tr><tr><td>hPITX3 L arm gen. F (primer): 5 ' TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3'</td><td>GeneWorks, Austrália</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hPITX3 Braço em L GFP R (primer): 5' ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3'</td><td>GeneWorks, Austrália</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyperLadder 1 kb&nbsp;</td><td>Bioline Australia</td><td>BIO-33025</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Jomar Bioscience, Austrália</td><td>41003</td><td></td></tr></tbody></table>

zinc-finger nucleases gene maior focalização em células estaminais embrionárias humanas

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

Uma grande limitação com células-tronco embrionárias (ESC) protocolos de diferenciação atuais é a geração de populações de células heterogêneas. Estas culturas contêm as células de interesse, mas também estão contaminados com CES indiferenciadas, derivados não-neuronais e outros subtipos neuronais. Isto limita a sua utilização in vitro e in vivo em aplicações, tais como em modelagem vitro para a descoberta de drogas ou terapia de substituição de células. Para ajudar a superar isso, linhas de células repórter, que oferecem um meio de visualizar, monitorar e isolar as células de interesse, podem ser projetados. No entanto, para alcançar este objectivo em células-tronco embrionárias humanas por meio de recombinação homóloga convencional é extremamente ineficiente. Este protocolo descreve a segmentação do homeobox Hipófise 3 (PITX3) lugar em células estaminais embrionárias humanas usando nucleases zinc-finger projetados, que introduzem quebras de DNA de cadeia dupla específicas do local, juntamente com umaPITX3 - EGFP -específico vector dador de DNA. Após a geração da linha celular PITX3 repórter, que podem então ser diferenciadas usando protocolos publicados para a utilização em estudos in vitro, tais como a doença ou modelos de substituição de células terapia de Parkinson.

Após a co-electroporação do projetado PITX3 par dedo de zinco, juntamente com o PITX3 - ADN de EGFP -específico doador vector e subsequente selecção de puromicina, os clones de células estaminais embrionárias humanas positivas foram inicialmente detectadas por meio de rastreio por PCR genómico (Figura 1). Hibridação de mancha de Southern destes clones positivos de PCR com 5 'e 3' de sondas específicas confirmada direccionamento correcto ao exão 1 do locus PITX3 <stron...

Linhas celulares Repórter oferecer um meio de visualizar, monitorar e isolar as células de interesse de populações heterogêneas. No entanto, utilizando a recombinação homóloga convencional em células estaminais embrionárias humanas-alvo do gene é extremamente ineficiente. Relata-se alvo CNS mesencéfalo específico fator de transcrição PITX3 loco com EGFP usando zinc-finger nuclease reforçada recombinação homóloga.

Zinc-finger nucleases Gene maior focalização em células estaminais embrionárias humanas

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

O objetivo geral deste protocolo é direcionar eficientemente transgenes para loci de interesse em células-tronco embrionárias humanas usando nucleases de dedo de zinco personalizadas para fazer isso. As células-tronco embrionárias humanas ou HSCs são expandidas para gerar material suficiente para eletroporação e, em seguida, digeridas para produzir células únicas. Em seguida, o mRNA que codifica duas nucleases de dedo de zinco de design personalizado é co-eletroporado nos HSCs com a sequência de doadores EGFP linearizada e as células são então plaqueadas em embriões de camundongos frescos, fibroblastos ou MEFs.As nucleases de dedo de zinco eletroporadas Introduzem uma quebra de fita dupla no primeiro éxon do poço X três locus nas células. Em seguida, a sequência do doador EFGP, que é flanqueada por braços direcionados com homologia à sequência do local do freio da fita dupla de DNA, é incorporada durante a divisão celular após 14 a 21 dias. Um terço de uma colônia HESC individual é passado para cada poço de uma placa de 96 poços revestida com matrigel e os outros dois terços são transferidos para um poço correspondente de uma placa de 48 poços contendo ME Fs fresco.O Southern blotting é então realizado para confirmar a integração correta. Uma vez confirmados os clones positivos, eles são expandidos e congelados para uso posterior. A principal vantagem dessa técnica sobre a metodologia existente, como a recombinação homóloga convencional, é que os dedos de zinco criam quebras de fita dupla de DNA predeterminadas, o que facilita o direcionamento eficiente de transgenes para predeterminar loci em células-tronco embrionárias humanas.Embora aqui introduzamos um gene trans no pit X três locus de células-tronco humanas, esse método pode ser adaptado a qualquer outro sistema onde o uso de linhagens de células repórter seja vantajoso. Comece este protocolo expandindo células-tronco embrionárias humanas ou HSCs para transfecção, conforme descrito no documento anexo. Quando as colônias se tornarem 60 a 70% confluentes, coloque a placa de cultura de tecidos em um microscópio de dissecação.Use uma agulha de calibre 21 na extremidade de uma pipeta de dois mil litros para limpar as colônias, removendo colônias diferenciadas ou núcleos de colônias. Em seguida, para lavar as colônias HESC aspirar o meio. Em seguida, adicione cinco mililitros de HBSS e incube por dois minutos.Após o aspirado de incubação, o HBSS adiciona cinco mililitros de Accutane e incuba por 10 a 20 minutos a 37 graus Celsius e 5% de CO2 até que as colônias sejam transformadas em células únicas vistas ao microscópio. Usando uma pipeta de um mililitro tri as células. Em seguida, adicione 10 mililitros de meio HESC e, usando um filtro de célula de 40 mícrons, filtre-o em um tubo cônico de 15 mililitros.Para remover quaisquer aglomerados de células, centrifugue o fluxo a 160 vezes a gravidade por cinco minutos. Após a centrifugação Resus, suspenda o pellet celular em cinco mililitros de meio HESC fresco e gire novamente Para remover qualquer solução residual de Accutane. Ressuspenda as células em meio HESC contendo 10 micromolares Y 2 7 6 3 2 e transfira-as para um prato de 100 milímetros pré-revestido com gelatina incubada a 37 graus Celsius, 5% de CO2 por um mínimo de 30 minutos.Durante esse tempo, os MEFs aderirão ao prato revestido de gelatina. Após a incubação, use uma pipeta de um mililitro para coletar as SSCs HE não aderentes em um tubo de centrífuga novo de 15 mililitros e determine a densidade celular usando um hemocitômetro em preparação para eletroporação. Transfira 7,5 milhões de HSCs, conforme preparado na seção anterior deste vídeo, para um novo tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue a 160 vezes a gravidade por cinco minutos.Após a centrifugação do Resus, suspenda o pellet celular em 0,8 mililitros de HBSS filtrado a 0,22 mícron gelado e transfira a solução para um veterinário de eletroporação estéril de 0,4 centímetro. Em seguida, adicione 30 microgramas de poço TVH X três direcionamento direto. Construa o DNA e misture suavemente com uma pipeta de 200 microlitros, incube no gelo por cinco minutos durante o descongelamento da incubação e alíquota do poço X três mRNA ZFN no gelo.Depois de descongelado, transfira 7,5 microlitros para a mistura de células de DNA para o veterinário Q de eletroporação misturado suavemente com uma pipeta de 200 microlitros. Pressione o botão vermelho no eletro para transfectar as células. Em seguida, usando uma pipeta de 200 microlitros, transfira o conteúdo do Electroporation Q Vet para um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de meio HESC.Lave o Q VET duas vezes com 200 microlitros de meio HESC e colete as soluções de lavagem no mesmo tubo de 15 mililitros. Para remover o muco resultante como detritos consistindo de DNA e proteína das células lisadas. Centrifugue a 160 vezes a gravidade por cinco minutos.Após a rotação, aspire o sobrenadante e bata suavemente no pellet celular para soltar o gasto de Reese em 30 mililitros. M-E-F-C-M suplementado com RH FGF dois e 10 micromolares Y 2 7 6 3 2 e placa em três placas de 100 milímetros contendo MEFs. Incubar a 37 graus Celsius 5%CO2 95%O2.Mudando o meio diariamente no segundo dia, retire Y 2 76 32 e células grossas apenas no meio HESC. Após dois a três dias, o HES CS deve estar 50 a 70% confluente neste momento. Comece a seleção de antibióticos.Manter a seleção adicionando HESC fresco por meio de micina diariamente. Após cerca de sete dias, pequenas colônias devem ser visíveis se MEFs resistentes a antibióticos não forem usados. Os MEFs podem ser complementados adicionando um adicional de uma vez 10 das células do quarto por centímetro quadrado.14 a 21 dias após a seleção, quando as colônias atingiram cerca de um milímetro de diâmetro. Prepare as placas para expansão e peneiramento adicionando 75 microlitros de matrigel ou gel TRE a cada poço de 3 96. As placas de poço também preparam 3 placas de 48 poços de MEFs em duas vezes 10 elevado ao quarto células por centímetro quadrado incubam ambos os conjuntos de placas durante a noite a 37 graus Celsius, 5% de CO2 no dia seguinte.Use uma agulha de calibre 21 na extremidade de uma pipeta de dois mililitros para dissecar as colônias HESC em 16 a 25 pedaços cortando uma grade. Em seguida, aspirar o matrigel de placas de 96 poços e substituí-lo por meio CM MEF suplementado com R hf, GF dois e por micina. Lave os MEFs nas placas de 48 poços com HBSS e, em seguida, adicione o meio HESC com por micina usando uma pipeta de 200 microlitros.Transfira suavemente um terço da colônia dissecada para uma placa de 48 poços para expansão. Transfira os outros dois terços da colônia dissecada para a placa de 90 poços correspondente contendo meio CMM suplementado. O aspecto mais difícil deste procedimento é a transferência de pedaços de colônia.Sugerimos que você pratique as peças coloridas de transferência e dissecação com antecedência. Faça a manutenção de ambas as placas trocando o meio suplementado com antibiótico diariamente. Expanda até que as placas de 96 poços estejam 100% confluentes, uma vez que as placas estejam confluentes.Remova todo o meio das placas invertendo e depois seque em papel toalha. Prossiga para preparar o DNA genômico para PCR conforme descrito no documento que acompanha após Resus suspender o DNA em TE ou TO 0.1 E.Realize PCR usando o sistema de PCR de modelo longo expandido conforme descrito no documento anexo, use um a dois microlitros de DNA ressuspenso por reação de PCR de 10 microlitros após a triagem de PCR para clones positivos por eletroforese e confirme por southern blotting. Assim que os clones positivos forem confirmados, prossiga com a subcultura e congele o restante dos fragmentos da colônia para projetar um PIT X três.Hecs da linha celular repórter. Foram mistos com um par de dedos de três dedos de zinco X de poço projetado sob medida e o vetor doador de DNA específico de três EGFB, conforme descrito neste artigo de vídeo após PERY e seleção, clones HESC positivos foram detectados por meio de triagem de PCR genômica, como pode ser visto aqui. Houve numerosos clones positivos, conforme indicado por bandas em 9 84 pares de bases.A hibridização Southern blot desses clones positivos para PCR foi então realizada usando cinco e três sondas específicas. Esta ilustração mostra o esquema do vetor de direcionamento linearizado, bem como a localização das cinco e três sondas externas aqui. Os cinco e três borrões do sul do tipo selvagem e alelos-alvo são mostrados.A banda única na pista do tipo selvagem indica dois alelos idênticos após o direcionamento correto do transgene para o poço x três locus duas bandas são observadas. Um correspondendo ao alelo corretamente direcionado e o outro ao alelo do tipo selvagem. Uma vez dominada, essa metodologia pode ser executada em dois a três meses.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como direcionar células-tronco humanas usando nucleases de dedo de zinco, bem como usar estratégias de PCR e southern blot para rastrear cls corretamente direcionados.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Apesar dos avanços recentes na modificação genética, transfecção de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) continua a ser um processo caprichoso. Para nosso conhecimento, métodos sistemáticos e eficiente para transfectar células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) não foram relatados. Aqui, descrevemos protocolos robustos de forma eficiente e transfectar nucleofect iPSCs humanos.

Transfectando e Nucleofecting células-tronco pluripotentes induzidas

O CompoZr personalizado Zinc-Finger Nuclease de Serviços (ZFN) permite edição genoma preciso em qualquer organismo ou linha de células em qualquer lugar geométrico definido pelo utilizador. Este artigo descreve o processo para a concepção, fabricação, validação e implementação do Serviço CompoZr ZFN personalizada.

Genoma Edição com CompoZr personalizados Nucleases dedo de zinco (ZFNs)

Este vídeo demonstra uma técnica de edição de genoma baseada em nuclease de dedo de zinco em células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). Como as hPSCs podem ser potencialmente diferenciadas em vários tipos de células, essa tecnologia é útil para estudos patológicos e farmacológicos in vitro de maneira específica do paciente.

Edição do genoma baseada em nuclease de dedo de zinco: uma técnica para modificar o genoma em células-tronco pluripotentes humanas por mecanismo de reparo dependente de homologia de fita dupla

Nucleases designers, tais como as nucleases de dedos de zinco (ZFNs) e activadores de transcrição, tal como nucleases efectoras (TALENS) pode ser utilizado para modificar o genoma de embriões préimplantação de ratinho por desencadear tanto a extremidade não homóloga de união (NHEJ) e recombinação homóloga (HR) vias. Estes avanços permitir a rápida geração de ratinhos com modificações genéticas precisas.

Rato Genoma Engenharia Usando Nucleases Designer

A edição de genes mediada por TALEN no locus AAVS1 de porto seguro permite a adição de transgenes de alta eficiência em iPSCs humanas. Este protocolo descreve os procedimentos para preparar iPSCs para TALEN e entrega de vetor de doador, transfectar iPSCs e selecionar e isolar clones de iPSC para obter a integração direcionada de um gene GFP para gerar linhagens repórter.

Transfection, seleção e Colony-picking de induzidas pelo homem pluripotentes Células-Tronco TALEN-alvo com um gene GFP no AAVS1 Safe Harbor

A edição do genoma de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) pode ser feita de forma rápida e eficiente. Apresentado aqui é um procedimento experimental robusto para projetar geneticamente hPSCs, como exemplificado pela edição do locus de porto seguro AAVS1 para expressar EGFP e introduzir resistência a antibióticos.

Estabelecimento de Genoma-editados pluripotentes humanas Lines Stem Cell: A partir de Segmentação de Isolamento

Aqui relatamos um método de edição gene rápida e eficiente com base em RMCE no locus AAVS1 de humanos pluripotentes células estaminais (hPSCs) que melhora a sistemas descritos anteriormente. Usando esta técnica, linhas isogênicas pode ser rápida e confiável gerada para estudos comparativos adequados, facilitar a investigação mediada por transgênese com hPSCs.

Geração rápida e eficiente de células-tronco pluripotentes Recombinante Humana pela recombinase mediada troca cassete no<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Proteínas, muitas vezes contêm vários domínios que podem exercer diferentes funções celulares. Gene knock-out (KO) não consideram essa diversidade funcional. Aqui, relatamos uma abordagem de estrutura-função com base na troca de cassete mediada por recombinação (RMCE) em KO células estaminais embrionárias que permite a dissecação molecular de vários domínios funcionais ou variantes de uma proteína.

Estudos de estrutura-função em células estaminais embrionárias Rato Usando recombinase mediada por troca cassete

Aqui, descrevemos um método detalhado para edição de genes sem costura em células-tronco pluripotentes humanas usando um plasmídeo doador baseado em piggyBac e o mutante Cas9 nickase. Duas mutações pontuais foram introduzidas no éxon 8 do locus do fator nuclear 4 alfa do hepatócito (HNF4α) em células-tronco embrionárias humanas (hESCs).

Introduzindo mutações pontuais em células-tronco pluripotentes humanas usando edição de genoma contínua

Aqui apresentamos um protocolo para o desenvolvimento de modelos de camundongos geneticamente modificados usando células-tronco embrionárias, especialmente para grandes knock-in de DNA (KI). Este protocolo é ajustado usando a edição do genoma CRISPR / Cas9, resultando em eficiência de KI significativamente melhorada em comparação com o método convencional de direcionamento de DNA linearizado mediado por recombinação homóloga.

Direcionamento de genes altamente eficientes mediados por CRISPR/Cas9 em células-tronco embrionárias para o desenvolvimento de modelos de camundongos manipulados por genes

O método apresentado descreve a geração de um nocaute gênico mediado por CRISPR na linhagem H9 de células-tronco embrionárias humanas (hESC), que expressa de forma estável sgRNAs direcionados ao gene L2HGDH usando um sistema de entrega de genes mediado por lentivírus altamente eficiente.

Deleção gênica mediada por CRISPR-Cas9 em células-tronco pluripotentes humanas cultivadas em condições livres de alimentador

Aprenda a editar genes em células estaminais embrionárias humanas usando nucleases de dedo de zinco para direcionar transgenes ao locus PITX3. Este método facilita estudos sobre desenvolvimento do SNC.

Zinc-finger nucleases Gene maior focalização em células estaminais embrionárias humanas

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