Name: Um Protocolo de vídeo de infecção retroviral na Primária Intestinal organóide Cultura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-11T18:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprenda a realizar transdução retroviral em organoides intestinais primários para estudos genéticos funcionais. Este método permite manipulação de genes in vitro com integração viral estável e análise por fluorescência.

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Koo BK e Mustata RC são suportados pelo Sir Henry Dale Fellowship do Wellcome Trust e Andersson-Rolf A é apoiada pelo Conselho de Pesquisa Médica (MRC). Fink J é apoiado pelo Programa de Doutoramento-4-year Wellcome Trust.

Todos os ratos utilizados no seguinte protocolo foram mantidos em condições livres de patógenos específicos, e todos os procedimentos foram realizados de acordo com os regulamentos do Reino Unido Home Office. 1 Preparação <ol><li> Prepare a mídia de 1 hora antes do uso (ver Quadro 1 e Lista de Materiais para mais detalhes) e pré-aquecido em um banho de água C ​​37 °, pelo menos, 10 minutos antes de usar. </li></ol> 2 A cultura do Intestino Delgado (SI) Organóides NOTA: A menos que indicado de outra forma, todas as incubações são realizadas a 37 ° C, 5% de CO 2, num incubador humidificado. Equipamento e reagentes que entram em contacto com as células vivas têm de ser estéreis. Pré-aquecimento da placa de cultura de tecidos é importante, pois evita que a matriz de cave (Matrigel ou BME) gotas de se espalhar para fora quando a semeadura. Além disso, a matriz deve ser porão mantida em gelo durante todo o tempo. Armazenar a -20 ° C e descongelamentoem gelo antes do uso. <ol><li> Isolando criptas <ol><li> Para o isolamento do intestino delgado sacrificar o mouse de acordo com as normas e regulamentos nacionais, em seguida, colocar o animal em suas costas e lavar o abdômen com etanol 70%. Realize uma incisão mediana longitudinal desde a virilha até o esterno. Em primeiro lugar, cortar a pele e, em seguida, o tecido subcutâneo. Remover o intestino delgado a partir do ceco para o estômago. Isoladas a partir de criptas do duodeno, jejuno e íleo pode ser utilizado para a cultura organï¿½de. </li><li> Lave o intestino delgado isolado com pré-resfriado Phosphate-Buffered Saline sem cálcio ou magnésio (PBS0). </li><li> Corte o tecido em 3-5 cm de comprimento peças e use uma tesoura para cortá-la aberta longitudinalmente. Espalhar o tecido, utilizando fórceps. </li><li> Raspe vilosidades usando uma lamela. Cuidado, muita força fará com que o tecido de rasgar e irá reduzir o rendimento de criptas em passos seguintes. </li><li> Transferir o tecido para um tubo de 50 ml, contendo pré-arrefecida usin PBS0fórceps g. Lave os fragmentos de tecido através de agitação vigorosa e mudar o PBS0. Repita 2-3x ou até o PBS0 gira menos nublado. </li><li> Incubar o tecido em um tubo de 50 ml contendo 30 ml de PBS0 com 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) durante 30 min a 4 ° C em um tubo de rolo. </li><li> Agitar vigorosamente o tubo e transferir o tecido para outro tubo de 50 ml contendo 30 ml de PBS0 com 5 mM de EDTA. A solução de EDTA a 1 mM (previamente contendo o tecido) irá conter uma mistura de criptas e vilosidades. Esta fração não é adequado para a semeadura de Organóides como muitas vezes contém uma elevada percentagem de vilosidades. </li><li> Incubar o tecido ainda durante 1 hora a 4 ° C em um tubo de rolo. </li><li> Agitar vigorosamente o tubo e recolher a solução em um tubo de 50 ml limpo. Confirmar a presença de criptas e estimar o número, por exemplo, através da contagem das criptas em 50 ul por microscopia de luz. Calcula-se o volume necessário para se obter 50-100 criptas e transferi-lo para um 1,5 ml de tube. </li><li> Gire a 300 xg por 5 min. Rejeitar o sobrenadante, ressuspender o sedimento em 50 mL de matriz de porão, e sementes de uma pré-aquecido placa de 24 poços. Incubar a placa numa incubadora de cultura de tecidos de 5-15 minutos de modo que a matriz de porão polimeriza. </li><li> Sobreposição com 500 ul ENR médio (ver Tabela 1). Aproximadamente 24 horas após a semeadura das Organóides irá mostrar uma pequena forma cística redonda e após mais 2-3 dias brotamento estruturas tornam-se visíveis. Mude a mídia ENR frescas a cada 3 dias. </li><li> Passage organóide culturas a cada 7 dias. </li></ol></li><li> Passaging e Organóides Manutenção <ol><li> Manter os Organóides atualizando os meios de comunicação a cada 3 dias e passagem 1: 3 ou 1: 5 como o lúmen se enche de células mortas, aproximadamente a cada sete dias. </li><li> Quebre a matriz cúpula porão com meio com 1 ml ponta PIPETMAN e transferi-lo do poço para um tubo de 1,5 ml. </li><li> Mecanicamente dissociar os Organóides através de uma pipetapproximately 50x usando uma multa (por exemplo, 200 mL) de ponta. </li><li> Gire a 300 xg por 5 min. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 150-250 mL de matriz porão. Semente de uma pré-aquecido placa de 24 poços (50 ul de matriz basal / poço). Antes de semear pipeta da matriz basal para cima e para baixo uma vez, para o revestimento de parede da ponta. Pipeta-se lentamente para evitar as bolhas e as sementes no meio do poço para evitar a matriz basal se espalhe para fora. É desejável para obter uma matriz de cúpula do porão, no centro do poço. </li><li> Incubar numa incubadora de cultura de tecidos de 5-15 minutos de modo que a matriz de porão polimeriza. Overlay com 500 mL de mídia ENR por poço. </li></ol></li></ol> 3 Pré-Tratamento de infecção SI Organóides NOTA: A Figura 1 ilustra o procedimento de transdução. <ol><li> Taxas ENR para ENRWntNic (ver Tabela 1) médio e crescer os Organóides em tseu meio para um mínimo de 3 dias ou até que eles adotaram uma morfologia cística. Wnt3a aumenta o número de células estaminais e de Paneth enquanto nicotinamida (NIC) melhora a eficiência da cultura. </li></ol> 4 Vírus Produção <ol><li> É necessário 150 mm prato de células Platinum-E por infecção. Semente de aproximadamente 5 x 10 6 células, com 15-18 ml de meio (DMEM + FBS 10%), na presença de puromicina (1 jag / mL) e blasticidina (10 ug / ml). Transfecção de células após 2-3 dias, depois de terem atingido 70-80% de confluência. Mudar o meio de DMEM + 10% FBS sem ï¿½puromicina e blasticidina antes da transfecção. </li><li> Adicionar 30 mg de construção de ADN retroviral e 240 mL de polietilenimina (PEI) para separar os tubos, contendo 1 ml de Opti-MEM. Misturar e incubar à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Reunir as duas soluções e incuba-se à temperatura ambiente durante 20-30 min. Adicione a mistura completa para o meio de células Platinum-E e agitar cuidadosamente o plate para assegurar uma distribuição equitativa dos complexos DNA-PEI. </li><li> Incubar as células E-platina com a mistura de transfecção durante a noite e refrescar o meio no dia seguinte. Manter as células em meio novo durante 2 dias. </li><li> Recolhe apenas a forma de um tubo Falcon de 50 ml, que passam através de um filtro de 0,45 um e de centrifugação a 8000 xg, a 4 ° C durante 12-16 horas. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 250 ul de meio de transdução (ver Tabela 1). </li></ol> 5. organóide Fragmento Preparação <ol><li> Para uma infecção de um poço de uma placa de 24 cavidades é necessário. Quebre a matriz cúpula porão com meio com 1 ml ponta pipeta e transferir para um tubo de 1,5 ml. </li><li> Utilizar um volume de ponta fina (por exemplo, de 200 pontas ul) para romper mecanicamente os Organóides através de pipetagem (30-50x). A solução torna-se turva e não Organóides integrais devem ser visíveis. </li><li> Centrifuga-se a temperatura ambiente, 900 x g durante 5 min<html> . </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 ul de protease recombinante de grau de cultura de células (por exemplo, TrypLE). Incubar a 37 ° C durante 5 min. Após a incubação, verificar o tamanho dos fragmentos por meio de microscopia de luz organï¿½de, contando o número de células por fragmento. Fragmentos contendo 5-10 células são ideais. Se a maioria dos fragmentos de conter um maior número de células do tempo de incubação pode ser aumentado por 2 minutos de cada vez. </li><li> Terminar o processo de dissociação, adicionando 500 mL de meio de ENR. </li><li> Centrifuga-se a temperatura ambiente, 900 x g durante 5 min. Remover o sobrenadante e o sedimento de manter em gelo ou a 4 ° C. </li></ol> 6. Transdução retroviral <ol><li> Combinar fragmentos organï¿½de com 250 ul da solução retroviral (de secção 4.5) em um poço de uma placa de 48 poços. Misture delicadamente por pipetagem lento usando uma pipeta de ponta ml. </li><li> Selar a placa com Parafilm. </li></ol>e &quot;&gt; 7. Spinoculation e Galvanização <ol><li> Centrifugar a placa a 32 ° C, 600 x g, durante 1 hora. Retire cuidadosamente o Parafilm e incubar a placa em uma cultura de tecidos incubadora durante 6 horas. </li></ol> 8 Sementeira de infectados organóide Fragments <ol><li> Transferir os fragmentos organï¿½de infectadas e media a transdução do poço para um tubo de 1,5 ml, e de centrifugação a 900 xg durante 5 min. </li><li> Descartar o sobrenadante e colocar o tubo contendo o sedimento em gelo durante 5 minutos para arrefecer. Adicione 100 ml de matriz porão e colocar o agregado pipetando lentamente para cima e para baixo. </li><li> Gotas de semente de matriz &#39;porão -cell misturar&#39; 50 ul de uma nova placa de 24 poços. Incubar a placa a 37 ° C, durante 5-15 min, até que os solidifica matriz basal. </li><li> Adic transdução sem polibreno aos poços e incuba-se a placa numa incubadora de cultura de tecidos. Mudança de mídia a cada 2-3 dias. </li></ol> 9 Seleção <ol><li> Comece seLection após 2-3 dias, adicionando ï¿½puromicina (1 mg / ml) para a mídia. </li><li> Quando os fragmentos estão começando a formar Organóides substituir os meios de comunicação com os meios Transdução ENR suplementados com puromicina (1 jag / ml). </li></ol> 10 pós-infecção Tratamento de SI Organóides <ol><li> Cultura transduzidas Organóides de acordo com o &quot;Passaging e manter Organóides&quot; protocolo (seção 2.2.1). Depois de 1-2 semanas, os Organóides SI vai recuperar as suas estruturas de brotamento. </li><li> Após o aparecimento de estruturas de brotamento induzir a expressão de miARN ou ADNc por adição de 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) em uma concentração de trabalho de 1 uM. Note que este passo só é válida se estiver usando vetores retrovirais de Addgene (pMSCV-loxP-dsRed-loxP-EGFP-Puro-WPRE (32702), pMSCV-loxP-dsRed-loxP-3xHA-Puro-WPRE (32.703), e pMSCV -FLIP-puro-dsRed-GFP-miRNA (32704)) e Organóides expressam Cre-ERT2. </li></ol> 11. confirmação da infecção e Expressão / Supressão do gene de interesse <ol><li> Se utilizar os vectores retrovirais da Addgene (32702, 32703 e 32704) eficiência de transdução pode ser confirmado pela observação da expressão dsRed. Além disso, a expressão ou a repressão do gene de interesse pode ser confirmada através de Western Blot, utilizando o GFP ou 3xHA epitopo (para a sobre-expressão do gene) e de qPCR (para knockdown do gene), conforme exemplificado na Koo et al 4. </li></ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li>
<li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointestinal+and+liver+physiology%22%5BJournal%5D)">A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology.</a> Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature. 9, 81-83 (2012).</li>
<li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PloS one. 8, e76871(2013).</li>
<li>Mustata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr4+is+required+for+Paneth+cell+differentiation+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo.</a> EMBO reports. 12, 558-564 (2011).</li>
<li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476, 293-297 (2011).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+suppressor+RNF43+is+a+stem-cell+E3+ligase+that+induces+endocytosis+of+Wnt+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors.</a> Nature. 488, 665-669 (2012).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar. Os autores não declaram conflito de interesses.

<html> Para atingir alta eficiência de transdução de certos aspectos são fundamentais. Um deles é o pré-tratamento de Organóides com a mídia ENRWntNic até que adotar uma forma cística rodada. Isto aumenta o número de células estaminais e, assim, a possibilidade de obter uma integração estável do transgene, bem como aumentar a taxa de sobrevivência dos Organóides SI durante todo o procedimento de transdução. Outro parâmetro é o tempo de incubação seguinte spinoculation. Resultados de incubação muito curto ou muito longo em baixa eficiência de transdução e baixa sobrevida dos Organóides, respectivamente. O passo spinoculation não é essencial, embora ele aumenta significativamente a percentagem de Organóides transduzidas. Finalmente, vírus de título elevado é a chave para a transdução de sucesso. Isto é dependente do tipo de linha de células de empacotamento e vírus. A combinação de uma linha celular de platina-E e vírus de células estaminais de murino (MSCV), verificou-se produzir um título suficientemente elevado para a transdução de Organóides. ve_content &quot;&gt; Abaixo são dicas para solução de problemas que podem ajudar a alcançar transdução de sucesso. Em primeiro lugar, se a transfecção da linha de células de empacotamento é pobre, certifique-se de que a confluência das células situa-se entre 70-80%, e que o tempo de incubação do agrupada mistura PEI-ADN é entre 20-30 min. A sobrevivência dos Organóides durante transdução altamente depende do tamanho do fragmento. demasiado longo tripsinização faz com que a maioria dos fragmentos de consistir em menos de 3 células e, assim, diminui a capacidade de sobrevivência organï¿½de. Outro factor é a actividade do meio condicionado de Wnt, se a actividade é muito baixa, impulsionando-o por meio da adição de CHIR99021 numa concentração de 5 fiM de trabalho pode aumentar a sobrevivência. CHIR99021 inibe a GSK3, o que resulta num aumento da sinalização de Wnt. Além disso, Y-27362, o qual impede anoikis é adicionado ao meio para melhorar a capacidade de sobrevivência de transdução organï¿½de, uma vez que são rompidas as Organóides de fragmentos (contendo 1-10 células) antes da transdução. Como60; mencionado acima, o tempo de incubação após spinoculation não deve ser superior a 6 horas. Por fim, se a transdução pobre é observado os factores acima mencionados influenciam o título viral e o limite de tamanho da inserção para o vector retroviral devem ser considerados. A eficiência do knockdown é altamente dependente da miARN. Uma vez que a eficiência varia de acordo com a combinação do gene alvo e miARN vale a pena realizar uma tela eficiência para identificar aqueles que funcionam melhor. A técnica é restrito para os fenómenos epiteliais do sistema organï¿½de. No futuro, pode ser possível estudar as doenças infecciosas ou imuno-mediada através da co-cultura de agentes patogénicos ou a reconstituição com componentes derivadas do sistema imune, respectivamente. Além disso, os retrovírus só pode efectuar inserções de um tamanho relativamente pequeno. Por conseguinte, as regiões reguladoras de ocorrência natural têm de ser excluídos e, portanto, a expressão do transgene não pode imitar o deo gene endógeno. Como mencionado acima, a eficiência de knockdown depende do gene alvo e miARN. Se não miARN com eficiência knockdown adequado pode ser encontrado, pode limitar o uso da técnica em que o gene alvo em particular. Teoricamente, Organóides são compatíveis com todas as técnicas de manipulação padronizados utilizados para linhas celulares. Transdução retroviral foi o primeiro método a ser relatado 4, e, recentemente, BAC (cromossomo artificial bacteriano) -transgenesis tornou-se disponível 5. Com um tempo de geração total de 2-3 semanas, após a transfecção do plasmídeo virai na linha celular de empacotamento, que é significativamente mais rápida do que a geração de um transgénicos (tg) do rato. Através da manutenção da arquitectura cripta-vilosidade in vivo, enquanto que contém as células estaminais, bem como todas as linhagens de células diferenciadas do epitélio intestinal, o sistema de cultura organï¿½de preenche a lacuna entre tg e cultura de células de animais utilizadas anteriormente. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; O protocolo aqui descrito fornece um método para realizar a análise fenotípica de endodermal epitélio in vitro através gain- e sem perdas de estudos da função. Isso torna possível para abordar questões fisiologicamente relevantes na biologia das células-tronco adultas, com uma necessidade mínima de tg. Por exemplo, a geração de ratinhos knockout condicionais pode ser evitado pelo uso de derivados de mutantes Organóides-nascidos com letalidade perinatal 6. Além disso, a técnica pode ser aplicada a Organóides derivadas de ratinhos knockout previamente estabelecidos para estudar o papel de paralogues efectuando 7,8 knockdown adicional. Após o estabelecimento de pequenas Organóides intestinais, adaptação do protocolo de cultura original permitiu cultura de pâncreas, fígado, cólon e estômago epitélios 9-11. Além disso, Organóides intestinal humana e Organóides tumorais foram extraídos de biópsias humanas normais, aden primáriooma e câncer colorretal biópsias 10. O protocolo de infecção viral pode ser facilmente estendido para estes tipos de Organóides e fornece uma forma sem precedentes de realização de estudos funcionais em tecidos de origem humana. Tomados em conjunto, transdução retroviral de pequenas Organóides intestinal é um recurso valioso para a investigação de manutenção de células estaminais, a diferenciação ea decisão destino celular, bem como a sinalização celular e de células célula-interações.

Genética funcional de alto rendimento é necessário para aumentar a nossa compreensão biológica do corpo, para melhorar a ciência básica atual e medicina. Mouse genética tem sido o padrão ouro para investigar a função do gene in vivo, embora seja tanto demorado e caro. As linhas celulares, sendo a outra opção comum, tem uma capacidade de produção mais elevada, enquanto ser menos dispendioso. No entanto, elas são impedidos pela sua incapacidade para reproduzir o microambiente adequado e deste modo, as respostas fisiológicas in vivo visto. Assim, existe uma necessidade para um sistema sem ambiguidade modelo fácil de manusear, que permite que o custo / eficiente em termos de tempo de análise de alto rendimento, enquanto imitando as respostas fisiológicas observadas em experimentos in vivo transgênicos (Tg) do mouse. Para o epitélio endodermal um tal sistema modelo apareceu em 2009 1. Entre os conhecimentos adquiridos a partir da descoberta de células-tronco intestinais Lgr5-positivos foiInformações sobre o nicho correspondente aos factores de crescimento e da matriz extra-celular necessárias para a manutenção de células estaminais. Utilizando esta informação, tornou-se possível estabelecer &#39;mini-intestinos&#39;, também conhecidos como Organóides 2. Recentemente, uma nomenclatura de consenso para culturas in vitro, onde Organóides são referidos como &#39;enteroids&#39;, foi sugerido 3. Como linhas celulares, os Organóides estão em constante expansão e fácil de tratar com ligantes e inibidores. No entanto, em vez de ser bidimensional são estruturas tridimensionais auto-organização que retêm a organização cripta-vilosidade, assim como as células estaminais e as linhagens de células diferenciadas do intestino delgado (SI). Organóides constituído por uma única camada de células epiteliais que circundam a área luminal. Salientes estruturas brotamento correspondem a criptas do intestino delgado, contendo compartimento de células estaminais. A partir da ponta da estrutura de brotamento células progenitoras diferenciam em que miralar para o revestimento epitelial, onde as células terminalmente diferenciadas são derramadas para o lúmen. Em comparação com as linhas celulares, este sistema ex vivo recapitula mais de perto a fisiologia normal e, portanto, é um sistema modelo interessante para o epitélio do intestino delgado. Neste protocolo vídeo de transdução retroviral, apresentamos um método que permite estudos ex vivo a função do gene, neste novo sistema de cultura organóide. Começamos descrevendo organï¿½de cultura de um modo passo-a-passo, e continuam a demonstrar a geração de retrovírus, seguido pelo procedimento de transdução. Finalmente, há uma seção para conselhos adicionais para solução de problemas. Uma vantagem desta técnica é que ele pode ser combinado com a imagem ao vivo ou rastreio de drogas, para o estudo da homeostase decisões destino celular e as interacções célula-célula no epitélio do intestino. Devido à sua arquitetura simples e taxa de rotatividade rápida, Organóides representam um modelo ideal sistema para o estudo da biologia de células-tronco de adultos. Além transdução retroviral pode ser aplicada a Organóides derivadas de ratinhos transgénicos pré-estabelecidas, assim como amostras de pacientes humanos. Com a aproximação do knock-in e knock-out não pode ser estendido para os seres humanos, os Organóides humano SI constituem uma alternativa atraente. Em resumo, a manipulação genética por meio de transdução retroviral permite a análise fenotípica em pequenas Organóides intestinais derivadas de camundongos ou amostras de tecidos humanos, complementando assim a genética do rato e linhas celulares ao abrir novos caminhos para estudos em tecidos de origem humana. Transdução retroviral permite gain- e perda de função de estudos para ser executada no sistema de cultura organï¿½de 4. Isto o torna um recurso valioso para investigar a função do gene, a biologia de células-tronco adultas e doença estando em conformidade com os três Rs (redução, refinamento e substituição).

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 avançado&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>12634-034</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>35050-068</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B27 50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento N2 100x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>n-Acetilcisteína 500 mM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Mouse EGF 500 &micro; g/ml</td><td>Invitrogen Biosource</td><td>PMG8043</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Noggin 100 &micro; g / ml</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>R-Espondina meio</td><td></td><td></td> condicionado <td>O meio condicionado é gerado a partir de células HEK293, para detalhes, consulte Sato e Clevers 2013.</td></tr><tr><td>Wnt meio</td><td></td><td></td> condicionado <td>O meio condicionado é gerado a partir de células L, para detalhes, consulte Sato e Clevers 2013.</td></tr><tr><td>Nicotinamida 1 M</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 10 &micro; M</td><td>Sigma</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene (8 &micro; g/ml)</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>Matriz BD padrão BD Matriz</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>Extrato de Matriz de Embasamento (Cultrex PathClear BME Fator de Crescimento Reduzido Tipo 2, 3533-005-02) fornecido pela AMSBIO pode ser usado como alternativa.</td></tr><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>Greiner Bio One</td><td>662960</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 48 poços</td><td>Greiner Bio One</td><td>677980</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Sigma</td><td>A3734-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Células Platinum-E</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidina</td><td>Invitrogen</td><td>A1113902</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenoimina (PEI)</td> <td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>51985-034</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td></td></tr></tbody></table>

um protocolo de vídeo de infecção retroviral na primária intestinal organóide cultura

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Células-tronco Lgr5-positivo pode ser complementado com o crescimento essencial fatores EGF, Noggin, e R-espondina, o que nos permite cultura cada vez maior estruturas epiteliais 3D primários in vitro. A arquitetura e fisiológicas propriedades desses &quot;mini-coragem&quot;, também chamados de Organóides, se assemelham os seus homólogos em vivo. Isso os torna um sistema modelo atraente para o pequeno epitélio intestinal. Usando transdução retroviral, genética funcionais podem agora ser realizadas por superexpressão de genes condicional ou knockdown. Este vídeo demonstra o processo de cultura organï¿½de, a geração de retrovírus, e a transdução retroviral de Organóides para auxiliar na análise fenotípica do epitélio do intestino delgado in vitro. Este sistema modelo organotípico romance, em combinação com a expressão de genes mediada retroviral fornece uma ferramenta valiosa para a análise rápida das funções de genes in vitro, sem a necessidade de costlGeração Y e demorado para animais transgênicos.

Organóides está pronto para ser dividida quando o lúmen central é escurecido devido à presença de células mortas (Figura 2). Depois de 2-3 dias de Organóides de pré-tratamento devem adotar uma morfologia cística redonda (Figura 3). Isto aumenta o número de células estaminais, aumentando as possibilidades de obtenção de integração estável. O tamanho do pelete do vírus pode variar após a centrifugação do sobrenadante viral, mais provavelmente, devido à variação de contribuição de restos celulares com o tamanho da pelota. Não foi observada correlação clara a eficiência de transdução. Durante o processo de selecção Organóides não transduzidas vai morrer, enquanto que os que tem uma integração estável permanecerá. A proteína fluorescente de retrovírus MSCV-eGFP pode ser observada em células originárias de Organóides sobreviventes, que têm uma morfologia cística, dentro de 2-3 dias após a transdução (Figura 4). <img alt> = "Figura 1" fo: Content-width = src "6in" = "/ files / ftp_upload / 51765 / 51765fig1highres.jpg" width = "600" /&gt; Figura 1 Uma representação esquemática do procedimento de transdução retroviral. Antes Organóides infecção são pré-tratados com ENRWntNic até adoptarem uma estrutura cística (passo 1). As células E-platina são utilizadas como a linha celular de empacotamento, e são cultivadas até atingirem uma confluência de 70-80%. Posteriormente são transfectadas com a construção retroviral usando PEI. Os vírus são recolhidos 2 dias mais tarde (passo 2). Organóides são tripsinizadas para obter fragmentos que contenham 1-10 células (passo 3), e, em seguida, são infectadas (passo 4). Seguindo spinoculation para aumentar a eficiência de infecção (passo 5), os fragmentos organï¿½de infectadas foram semeadas (passo 6) e 2-3 dias mais tarde para a selecção de clones positivos com a integração estável pode ser realizada (passo 7). "Width =" 1765fig2highres.jpg 500 "/&gt; Figura 2 Imagem representativa de Organóides após 4-6 dias de cultura. O lúmen é preenchido com células mortas, fazendo parecer escuro. Organóides nesta fase estão prontas para serem passadas. <img alt="Imagem microscópica de bolhas de ar em um líquido durante o estudo de equilíbrio estático, demonstrando tensão superficial." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 3"> Figura 3 Imagem representativa de pequenos Organóides intestinais cultivadas em meio ENRWntNic por 3-4 dias. Os Organóides adotar uma morfologia cística. <img alt="Imagens de morfologia celular, microscópio de campo claro e fluorescência, análise da estrutura celular." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 4"> Figura 4 Imagem representativa de pequenos Organóides intestinais (a) que mostram a expressão do transgene viral (b, eGFP). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> AdvaNCED DMEM / F12 +++ </td></tr><tr><td colspan="2"> Armazenar a 4 ° C durante 4 semanas </td></tr><tr><td> Avançada DMEM / F12 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Glutamax 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Hepes 1 M </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Antibióticos 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> ENRWntNic meio (por 20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Armazenar a 4 ° C durante 2 semanas </td></tr><tr><td> Avançada DMEM / F12 +++ </td><td> 7,2 ml </td></tr><tr><td> Suplemento de B27 (50x) </td><td> 400 ul </td></tr><tr><td> Suplemento N2 (100x) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> N-acetilcisteína (500 mm) </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> rato de EGF (500 ng / ml) </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> Noggin rato (100 ug / ml) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> R-espondina Conditmeio ioned </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> Wnt3a meio condicionado </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> A nicotinamida (1 M) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> Transdução de forma (por 20 mL) </td></tr><tr><td colspan="2"> Prepare fresco </td></tr><tr><td> Meio ENRWntNic </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Y-27632 (10 uM) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> Polibreno (8 ug / ml) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td colspan="2"> ENR meio (por 20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Armazenar a 4 ° C durante 4 semanas </td></tr><tr><td> Avançada DMEM / F12 +++ </td><td> 17,4 ml </td></tr><tr><td> Suplemento de B27 (50x) </td><td> 400 ul </td></tr><tr><td> Suplemento N2 (100x) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> N-acetilcisteína (500 mm) </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> rato de EGF (500 ng / ml) </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> Noggin rato (100 ug / ml) </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> R-espondina meio condicionado </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mídia para células Platinum-E (para 500 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Armazenar a 4 ° C durante 12 semanas </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 449,45 ml </td></tr><tr><td> Soro Fetal de Bovino (FBS) </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Puromicina (1 ug / ml) </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> Blasticidina (10 ug / ml) </td><td> 500 ul </td></tr></tbody></table> Tabela 1 Mídia composição for Advanced DMEM / F12 +++, médio ENRWntNic, médio Transdução, médio ENR e meio para as células Platinum-E.

Este protocolo explica cultura organóide Lgr5-positve primário eo desempenho subseqüente de transdução retroviral. Isto permite que a sobre-expressão de Cre-indutível ou knockdown do transgene entregue e permite estudos funcionais a serem realizadas no novo em organotípica vitro sistema modelo.

Um Protocolo de vídeo de infecção retroviral na Primária Intestinal organóide Cultura

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar como realizar estudos genéticos funcionais em organoides. Isso é feito primeiro pré-tratando os organoides com meio contendo WINT três A para facilitar a adoção de uma forma cística e aumentar seu número de células-tronco. Na segunda etapa, o vírus é produzido e os fragmentos organoides são então transduzidos e inoculados.Na etapa final, os organoides transfectados são assentados e selecionados para integração viral estável. Em última análise, a expressão ou supressão do gene de interesse pode ser avaliada por fluorescência GFP. A principal vantagem de usar essa técnica em relação aos modelos de AL existentes, como o camundongo, é que, com essa técnica, experimentos genéticos funcionais podem ser realizados in vitro com os organoides intestinais.Demonstrando o procedimento estará Amanda Andro, uma estudante de doutorado do meu laboratório Para isolar as criptas, comece lavando o intestino delgado com PBS livre de cálcio e magnésio pré-resfriado. Em seguida, corte o tecido em pedaços de três a cinco centímetros de comprimento e abra os pedaços longitudinalmente com uma tesoura. Use uma pinça para abrir os tecidos, raspe o excesso de vilosidades usando uma lamínula e, em seguida, transfira os pedaços para um tubo de 50 mililitros contendo PBS resfriado.Lave os fragmentos de tecido duas a três vezes com agitação vigorosa, trocando o PBS até que o PBS fique menos turvo após a última lavagem, incube o tecido em um tubo de 50 mililitros contendo 30 mililitros de PBS suplementado com um EDTA milimolar a quatro graus Celsius em um rolo de tubo. Após 30 minutos vigorosamente, agite o tubo novamente e transfira o tecido para outro tubo de 50 mililitros contendo 30 mililitros de PBS suplementado com cinco milimolares de EDTA. Após uma hora de incubação a quatro graus Celsius no rolo do tubo vigorosamente.Agitar novamente o tubo e transferir a solução para um novo tubo de 50 ml. Em seguida, conte o número de criptas em 50 microlitros. Calcule e transfira o volume contendo 50 a 100 criptas para um tubo de 1,5 mililitro.Em seguida, gire as criptas e ressuspenda o pellet em 50 microlitros de matriz do embasamento. Em seguida, semeie a solução de cripta em uma placa de pré-aquecimento de 24 poços e incube a placa em uma incubadora de cultura de tecidos por cinco a 15 minutos. Uma vez polimerizada a membrana basal, incubar a matriz com 500 microlitros de meio ENR em uma incubadora de cultura de células.Atualizando a mídia a cada três dias aproximadamente 24 horas após o assento, os organoides exibirão uma pequena forma cística redonda. Depois de mais dois a três dias, as estruturas em brotamento se tornarão visíveis enquanto os organoides estão adotando sua morfologia cística Semente, aproximadamente cinco vezes 10 elevado às seis células E de platina em um prato de 150 milímetros com 15 a 18 mililitros de meio suplementado com pur, micina e blastina. Após dois a três dias, troque o meio para meio sem antibióticos e adicione 30 microgramas de DNA retroviral e 240 microlitros de pi a dois tubos individuais, cada um contendo um mililitro de ótimo.Em seguida, misture os tubos e incube-os em temperatura ambiente. Após cinco minutos, agrupe as duas soluções e incube-as em temperatura ambiente por mais 20 a 30 minutos. Adicione a mistura completa às células E de platina e agite cuidadosamente a placa para garantir a distribuição igual dos complexos de DNA PI.Após uma incubação noturna, refresque o meio e incube as células novamente. Após dois dias, colete apenas o meio em um tubo Falcon de 50 mililitros e coe-o através de um filtro de 0,45 mícron. Em seguida, centrifugue a solução por 12 a 16 horas a 8.000 vezes G e quatro graus Celsius e ressuspenda o pellet em 250 microlitros de meio de transdução.Para preparar os fragmentos organoides para transdução retroviral, primeiro pipetar a cultura 30 a 50 vezes com uma ponta de pipeta de 200 microlitros para romper mecanicamente os organoides, a solução ficará turva e nenhum organoide inteiro deve ser detectado. Depois de girar os fragmentos, incubar o pellet em 500 microlitros de cultura de células, protease recombinante grau a 37 graus Celsius por cinco minutos. Após a incubação, use um microscópio óptico para avaliar o tamanho dos fragmentos organoides e contar o número de células por fragmento.Em seguida, adicione 500 microlitros de meio ENR para encerrar o processo de dissociação e girar os fragmentos celulares. Depois de descartar o sobrenadante, coloque o pellet no gelo e semeie os fragmentos em um poço de 48. Placa de poço em 250 microlitros da solução retroviral previamente preparada.Misture a solução celular suavemente com uma ponta de pipeta de um mililitro e, em seguida, sele a placa com um parâmetro para realizar a primeira centrífuga de inoculação. A placa de 48 poços por uma hora a 600 vezes G e 32 graus Celsius. Em seguida, remova cuidadosamente o filme para e incube a placa por mais seis horas em uma incubadora de cultura de células.Após a incubação, transfira os fragmentos infectados para um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, gire os fragmentos organoides novamente e resfrie o pellet no gelo por cinco minutos. Assim que o pellet esfriar, adicione 100 microlitros de matriz de embasamento ao tubo e pipete lentamente o pellet para cima e para baixo para ressuspendê-lo.Em seguida, semeie gotas de 50 microlitros da suspensão da matriz de fragmentos em cada poço de uma placa de 24 poços e incube a placa a 37 graus Celsius por cinco a 15 minutos Após a solidificação da matriz basal, incube os organoides com meios de transdução sem policérebro. Após dois a três dias, adicione meio contendo purmicina aos poços para iniciar a seleção. Quando os fragmentos começarem a formar organoides, substitua o meio de transdução por meio ENR suplementado.Com puram, os organoides Mycin estão prontos para serem divididos quando seus lúmens centrais escurecem devido à presença de células mortas. Após dois a três dias de pré-tratamento com meio Wint three, os organoides devem adotar em torno da morfologia cística, aumentando o número de células-tronco e aumentando as chances de obter uma integração estável nas células-tronco. Nessas imagens, a expressão da proteína fluorescente do retrovírus M-S-C-V-E-G-F-P pode ser observada nas células originárias dos organoides sobreviventes que adquiriram a morfologia cística esperada dentro de dois a três dias após a transdução.Ao tentar este procedimento, é importante verificar o tamanho dos fragmentos organoides, pois isso afeta fortemente sua capacidade de sobrevivência. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como realizar a transdução retroviral de organoides.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. Protocolo para Transdução com Lentivírus e Análise Subsequente de Organoides Intestinais. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo descreve a transdução lentiviral de organoides intestinais de camundongo a partir de uma estrutura semelhante a criptas contendo suspensão. Utilizando uma matriz de membrana basal como suporte e meios suplementados com fatores de crescimento, vetores lentivirais são introduzidos para permitir a integração estável de...

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Aprenda a realizar transdução retroviral em organoides intestinais primários para estudos genéticos funcionais. Este método permite manipulação de genes in vitro com integração viral estável e análise por fluorescência.

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