Name: Hidrogel nanopartículas colheita de plasma ou urina para detectar proteínas de baixa abundância (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-07T20:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprenda a usar nanopartículas de hidrogel funcionalizadas para capturar e concentrar biomarcadores de baixa abundância em plasma ou urina. Este método aumenta a sensibilidade de detecção em ensaios proteicos padrão.

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Michael Henry, Dublin City University, gentilmente ajudou na coleta e análise de dados mostrado na Figura 5. Este trabalho foi financiado parcialmente por (1) George Mason University, (2) o italiano IstitutoSuperiore di Sanita », no âmbito da Itália / EUA acordo de cooperação entre o Departamento de Saúde e Serviços Humanos, George Mason University, e do Ministério da Saúde Pública italiano, (3) NIH, bolsas do programa IMAT 1R21CA137706-01 e 1R33CA173359-01 a LAL, e (4) Ceres Nanociências, Inc .

O plasma humano e urina foi coletada a partir de doadores voluntários saudáveis, com consentimento informado por escrito, seguindo de Revisão Institucional da Universidade George Mason Conselho aprovou protocolos. Os doadores foram distribuídos igualmente entre homens brancos e mulheres entre as idades de 25 e 42 amostras foram analisadas individualmente e não foram reunidas. 1. nanopartículas de Processamento de amostras de soro ou plasma Baixas biomarcadores potenciais abundante no plasma são capturados, em solução, com nanopartículas de hidrogel. As partículas são adicionadas ao plasma, incubadas, separadas por centrifugação, lavadas, e as proteínas capturadas são eluídas. As proteínas eluidas são secos sob um fluxo de azoto durante a jusante sequenciação e espectrometria de massa de identificação. <ol><li> Dilui-se 500 ul de soro de 1: 2, com 50 mM Tris-HCl de pH 7 (500 mL de soro + 500 ul Tris-HCl), em um tubo de microcentrífuga. </li><li> Adicionar 500 mL de poli (NiPAM / AAC) núcleo NanOpartigos. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Girar a amostra a 16100 x g, 25 ° C durante 10 min numa centrífuga equipada com um rotor de ângulo fixo. Remova e descarte o sobrenadante. </li><li> Adicionar 500 ul de tiocianato de sódio (25 mM) para o sedimento. Volte a suspender as nanopartículas por vigorosamente pipetando para cima e para baixo várias vezes. </li><li> Girar a amostra a 16100 x g, 25 ° C durante 10 min numa centrífuga com um rotor de ângulo fixo. Remova e descarte o sobrenadante. </li><li> Adicionar 500 mL de água MilliQ para o sedimento de nanopartículas. Volte a suspender as nanopartículas por vigorosamente pipetando para cima e para baixo várias vezes. </li><li> Girar a amostra a 16100 x g, 25 ° C durante 10 min numa centrífuga com um rotor de ângulo fixo. Remova e descarte o sobrenadante. </li><li> Preparar tampão de eluição fresco: Adicionar 700 ul de acetonitrilo e 300 ul de hidróxido de amónio num tubo limpo. Atenção: hidróxido de amônio é corrosivo. Utilize com ventilação adequada. Nota: O tampão de eluição deve ser prepared imediatamente antes da utilização. Não guarde o tampão de eluição. </li><li> Adicionar 300 ul de tampão de eluição à pelete de nanopartículas. Volte a suspender as nanopartículas por vigorosamente pipetando para cima e para baixo várias vezes. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Girar a amostra a 16100 x g, 25 ° C durante 10 min numa centrífuga com um rotor de ângulo fixo. Remova e guarde o fluido em um tubo de microcentrífuga rotulado limpo. </li><li> Repita os passos 1,9-1,10. Combine as duas eluatos em um tubo de microcentrífuga. </li><li> Secam-se os produtos de eluição sob fluxo de azoto, em um evaporador colector de azoto a 42,1 ° C, com um fluxo de ar ajustado para 8 (Figura 2F). </li><li> Armazenar o eluato secas à temperatura ambiente durante ó armazenamento / N, ou a -20 ° C para armazenamento a longo prazo, antes da espectrometria de massa, transferência de western, ensaios de ELISA ou (opcional). </li></ol> 2. nanopartículas Processamento das amostras de urina A urina normal contém menos do que 30 mg / dl e proteínamenos do que 1 + no sangue. No entanto, muitas doenças / condições podem alterar os níveis normais de proteína na urina e no sangue. Para ajudar a determinar o volume óptimo de nanopartículas para adicionar à amostra de urina, uma análise de urina é realizada antes da colheita de nanopartículas. Biomarcadores de urina podem existir em concentrações extremamente baixas, o que pode exigir optimizar a proporção de nanopartículas com o volume de urina. Este processo descreve a colheita de amostras de urina de nanopartículas para análise de Western blot a jusante. <ol><li> Coletar amostras de urina em um ambiente limpo, copo de plástico seco. Um volume mínimo de 22 ml é necessária. Urina loja amostras à temperatura de -80 ° C até estar pronto para a análise. </li><li> Descongele a urina congelada à temperatura ambiente ou a 4 ° CO / N. Misture brevemente em um misturador de vórtice. Despeje pelo menos 22 ml de urina para um tubo de polipropileno de fundo cónico de 50 ml. </li><li> Girar a urina numa centrífuga com um rotor basculante para fora a 3.700 xg durante 15 min. Decantar a urina, sem perturbar o sedimento, em um POLYPR fundo cónico de 50 ml limpotubo opylene. Descarte o sedimento. </li><li> Realizar exame de urina usando uma multi-analito &quot;vareta de urina&quot; tira reagente. Nota: guarde as tiras reagentes em um recipiente bem fechado longe da luz solar e umidade 17, 18 direto. <ol><li> Coloque a tira reagente, virada para cima, sobre uma toalha de papel limpo e seco. </li><li> Usar uma pipeta descartável para aspirar 1 ml de urina, preparado no passo 2.3. </li><li> Defina um temporizador para 2 min, mas não iniciá-lo. Dispensar rapidamente 1-2 gotas de urina em cada almofada de teste da tira reagente. Iniciar imediatamente o timer. Nota: Não mergulhe a tira reagente diretamente no recipiente de urina. Os indicadores de tintura / química na fita reagente pode, potencialmente, vaza da tira reagente para o recipiente de urina. </li><li> No tempo indicado na embalagem tira reagente, gravar os resultados qualitativos para os vários analitos sobre a tira reagente, comparando a cor das fitas reagentes individuais indica o código de cores correspondentedores no recipiente de reagente. Resultados de urina normais típicas são: (normal ou negativa) para o sangue, proteína, leucócitos, nitrito, glucose, cetona, bilirrubina, e urobilinogénio; Urina pH (5,5-7,0); gravidade específica (1,001-1,020). Nota: Os níveis elevados de proteínas numa amostra de urina, podendo competir com a proteína de interesse para os locais de ligação sobre as nanopartículas. Para maximizar a colheita de proteínas com nanopartículas, a / volume de urina de volume de nanopartículas pode ser ajustado para qualquer competição limite de proteínas de alta abundância, ou pode ser otimizado para colher as proteínas que existem em concentrações muito baixas. Se o valor de proteínas na urina é 1 + ou maior, adicionar volumes 2x de nanopartículas no passo 2.5 abaixo. Se o analito de interesse é uma proteína muito baixo abundante, pode ser necessário aumentar o volume de nanopartículas até 2 ml (Figura 3). </li></ol></li><li> Transferir 20 ml de urina clarificado do passo 2.3 em 50 mL de um tubo de polipropileno de fundo cónico limpo. Nãoperturbar quaisquer detritos / sedimento que pode ser no fundo do tubo de urina. Adicionar 200 ul de nanopartículas para os 20 ml da amostra de urina. Misture brevemente em um misturador de vórtice. Nota: Se o valor de proteínas na urina é 1 + ou maior, adicionar 400 mL de nanopartículas a 20 ml de urina. </li><li> Incubar a mistura de urina / nanopartículas durante 30 min à temperatura ambiente, sem balançar / mistura. </li><li> Girar a suspensão de urina / nanopartículas numa centrífuga equipada com um rotor basculante para fora a 3.700 xg durante 10 min. Nota: Se uma bolinha não é seguir a centrifugação visível, girar as amostras para um adicional de 2-7 min. </li><li> Remova e descarte o sobrenadante. Adicionar 500 mL de água MilliQ para o sedimento de nanopartículas. </li><li> Volte a suspender as nanopartículas por vigorosamente pipetando para cima e para baixo várias vezes. Transferir a solução de nanopartículas de um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpo. </li><li> Rodar as nanopartículas numa centrífuga equipada com um rotor de ângulo fixo a 16.100 xg durante 10 min. Nota: Se uma bolinha não é visível folmugido centrifugação, girar as amostras para um adicional de 2-7 min. </li><li> Remova e descarte o sobrenadante. </li><li> Repita os passos 2.8 e 2.11 (duas vezes) com 200 ul de 18 MiliQ de água para lavar as nanopartículas. </li><li> Preparar tampão de eluição fresco: Adicionar 970 ul de acetonitrilo a 30 mL de hidróxido de amónio num tubo limpo. Atenção: hidróxido de amônio é corrosivo. Utilize com ventilação adequada. Nota: O tampão de eluição deve ser preparado imediatamente antes da utilização. Não guarde o tampão de eluição. </li><li> Adicionar 20 ul de tampão de eluição à pelete de nanopartículas. Volte a suspender as nanopartículas por vigorosamente pipetando para cima e para baixo várias vezes. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Gire as amostras de nanopartículas a 16.100 xg por 10 min. Retire e guarde o sobrenadante em um, 1,5 ml tubo de microcentrífuga limpo. Não perturbar o pellet de nanopartículas. Descarte a pelota no lixo de risco biológico. </li><li> Colocar as amostras em um rack em um exaustor química. Abra as tampas e incUbaté à TA durante 30 min. Em alternativa, colocar as amostras de acordo com o fluxo de azoto a 40 ° C até secar (1 - 2 horas). </li><li> Adicionar 15 ul de tampão de amostra de Tris-glicina SDS (2x) para as amostras. Aquece-se a 100 ° C num bloco de aquecimento a seco durante 5 minutos com as tampas abertas, ou até que o volume deixado no tubo não é mais de 20 ul. Nota: não use um banho de água fervente. A humidade do banho de água irá evitar a evaporação do tampão. </li><li> Coloque a tampa sobre os tubos. Retire os tubos do bloco de aquecimento. A amostra pode ser armazenada a -80 ° C ou usado imediatamente para a análise de Western blot a jusante. </li></ol>

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<li>Michael, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tissue+kallikrein+5+is+a+member+of+a+proteolytic+cascade+pathway+involved+in+seminal+clot+liquefaction+and+potentially+in+prostate+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human tissue kallikrein 5 is a member of a proteolytic cascade pathway involved in seminal clot liquefaction and potentially in prostate cancer progression.</a> J Biol Chem. 281 (18), 12743-12750 (2006).</li>
</ol>

Benjamin Espina é um funcionário da Ceres Nanosciences, Inc. que produz reagentes usados neste artigo. Lance Liotta, Alessandra Luchini e Virginia Espina possuem patentes (patente dos EUA 7.935.518 e/ou 8.497.137) sobre a tecnologia de nanopartículas usada neste artigo. Como funcionários da universidade, eles têm direito a receber royalties dessas patentes de acordo com a política da universidade. Lance Liotta e Alessandra Luchini são acionistas da Ceres Nanosciences e atuam no Conselho Consultivo Científico.

Relevância Clínica Uma amostra de soro ou plasma é pensado para conter baixa abundância de proteínas e peptídeos que podem proporcionar uma fonte rica de informações sobre o estado do organismo como um todo em circulação. Apesar da promessa de proteômica de soro, há três barreiras fisiológicas fundamentais e graves dificultando a descoberta de biomarcadores e tradução para o benefício clínico 10, 11, 16, 25. 1. biomarcadores de diagnós...

Apesar da conclusão do seqüenciamento do genoma humano, um progresso significativo não foi alcançado na identificação de biomarcadores preditivos de doença em estágio inicial, ou que se correlacionam com os resultados terapêuticos, ou prognóstico 1. Uma das razões para esta falta de progresso é que muitos biomarcadores potencialmente significativas existem em uma concentração abaixo do limite de detecção de espectrometria de massa convencional e outras plataformas de descoberta de biomarcadores. Espectrometria de massa (MS) e monitorização de reacções múltiplas (MRM) tem uma sensibilidade de detecção, tipicamente maior do que 50 ng / ml, enquanto a maioria dos analitos medido por imunoensaios em uma queda de laboratório clínico no intervalo entre 50 pg / ml e 10 ng / mL . Isto significa que muitos biomarcadores, particularmente na fase inicial de uma doença que não pode ser detectado por MS convencional e MRM 2. Além disso, a presença de proteínas de elevada abundância, tais como albumina e imunoglobulina em fluidos biológicos complexos, frequentemente mascarar por mil vezes excess baixa abundância, proteínas de baixo peso molecular e de péptidos 3, 4. Por esta razão várias etapas de preparação da amostra é necessária antes da espectrometria de massa e sequenciação de identificação. Um tal passo preparatório emprega a depleção de proteínas de alta abundância com colunas de depleção disponíveis comercialmente 5-8. Infelizmente, este passo leva à diminuição do rendimento de biomarcadores candidatos porque eles são muitas vezes não covalentemente associada com proteínas transportadoras que estão a ser removidos. Um outro desafio é representado pela estabilidade dos biomarcadores candidatos ex-vivo, uma vez que as amostras são recolhidas. As proteínas são sujeitas a degradação por proteases endógenas ou exógenas 9. Nanopartículas de hidrogel podem ultrapassar estes desafios críticos, amplificando a concentração biomarcador putativo para um nível dentro da gama do ensaio, ao mesmo tempo proteger a proteína de degradação 10-13. É importante notar ªLMW em proteínas no sangue são uma mistura de proteínas intactas pequenas, bem como fragmentos de proteínas grandes. Proteínas derivadas de tecido superior a 60 kDa são demasiado grandes para entrar passivamente o fluxo de sangue através da membrana basal vascular, mas eles podem ser representados no sangue como péptidos ou fragmentos de proteínas 14. Nosso objetivo é medir novos circulando biomarcadores que podem ser candidatos para a detecção precoce da doença, a estratificação dos pacientes para a terapia, e monitorar a resposta à terapia. Nossos nanopartículas são criados para excluir selectivamente imunoglobulinas e albumina de abundância alta e, simultaneamente, a captura de proteínas e péptidos mais pequenos e concentrá-los até 100 vezes dependendo do volume de partida. O nosso grupo identificado um conjunto de pequenas corantes orgânicos que podem funcionar com sucesso como engodos moleculares de elevada afinidade para proteínas e péptidos. Ligação da proteína-corante é provavelmente devido a uma combinação de interacção hidrofóbica e electrostáticos. Os anéis aromáticos do corante intercalar com proteínas através de bolsas hidrofóbicas na superfície de proteínas 11. Os iscos de acordo com a química, mostram uma afinidade específica para as classes de analitos seleccionados. Os iscos competir com as proteínas transportadoras, tais como albumina, para as proteínas ou péptidos. As de baixo peso molecular de proteínas / péptidos tornam-se aprisionados na partícula. Proteínas de alto peso molecular tais como albumina e imunoglobulinas são impedidas de entrar na partícula, devido à capacidade de crivagem, devido ao poro restritiva do hidrogel 11 (Figura 1). Nanopartículas de hidrogel são sintetizados por polimerização a precipitação iniciada por persulfato de amónio 11. N-isopropilacrilamida (NiPAM), co-monómeros de ácido acrílico (AAC) e alilamina (AA) e N, N&#39;-metilenobisacrilamida (BIS) de reticulação são deixados reagir a 70 ° C durante 6 h em condições de diluição 11, 13. A afinidade de ligação da proteína de poli (N-isopropilacrilamida-co-ácido acrílico) (poli (NiPAM-co-AAc) nanoparticlesis conseguida por ligação covalente incorporando corantes contendo amino (isto é. Sulfonatedanthraquinonetriazine, corantes) em que as nanopartículas através uma reacção de amidação realizada em solventes aquosos ou orgânicos, dependendo das características hidrofóbicas / hidrofílicas dos corantes 11, 13. substituição nucleofílica dos grupos amina na nanopartículas com o átomo de cloro de um corante anthraquinonetriazine é utilizado para criar poli que contém o corante (NiPAM -CO-alilamina) (AA) nanopartículas 11, 12. Um processo de polimerização em duas etapas é utilizado para criar as nanopartículas de hidrogel contendo um invólucro exterior de ácido vinilsulfónico (VSA) 11, 13. Nanopartículas de hidrogel pode ser aplicado a vários fluidos biológicos, incluindo o sangue total, plasma, soro, fluido cefalorraquidiano, suor e urina. Em uma etapa, em solução, o nanoparticles realizar uma rápida (dentro de minutos), a fixação ea concentração de analitos de baixo peso molecular de 10, 11, 13, 15-18. As proteínas são seguidamente eluídas das nanopartículas e detectado utilizando a técnica Western Blot 19-21, espectrometria de massa de 10, 11, 13, 15, 18, ​​22, 23, imunoensaios / ELISA 10, 11, 15, 18, ​​ou proteína de fase inversa microarray 16, 24 ensaios. As nanopartículas funcionalizadas com isca química, e apresentando um núcleo ou núcleo shell arquitetura, captura e concentrar as proteínas com base nas propriedades físico-químicas isca / shell. Diferentes corantes incorporados nas nanopartículas, por conseguinte, irá capturar diferentes subconjuntos de proteínas com base na eficiência de afinidade de corante, pH da solução, e a presença / ausência de proteínas de alto-13 competem variando abundante. Além disso, a quantidade de nanopartículas em relação ao volume da solução irá afectar a produção de proteína a partir das nanopartículas. Estes aspectoscolheita das nanopartículas de hidrogel são demonstradas utilizando três iscas nanopartículas diferentes para proteínas de colheita de amostras de plasma que contêm quantidades elevadas de proteína, e a partir de amostras de urina, que tipicamente não contêm grandes quantidades de proteínas. Neste protocolo, demonstrar a colheita concentrando e factor de necrose tumoral alfa (TNFa) a partir de amostras de plasma utilizando poli (NiPAM-co-AAc), poli (NiPAM / corante), e nanopartículas de casca Core- (poli (NiPAM-co-VSA)) . Poli (NiPAM / corante) nanopartículas são mostrados para concentrar antigénio espécies de Mycobacterium que foi adicionado a amostras de urina humana, para imitar os indivíduos infectados pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis.

<table><tbody><tr><td>Nanopartículas de hidrogel</td><td>Ceres Nanoscience</td><td>CS003</td><td>NanoTrap ESP partículas</td></tr><tr><td>18 M&Omega;-cm água</td><td></td><td></td><td>Tipo 1 água de grau reagente</td></tr><tr><td>Tris HCl, 50 mM pH 7,0</td><td>VWR</td><td>IC816116</td><td>50 mM, pH 7</td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>BDH</td><td>BDH1103-4LP</td><td>Disponível na VWR</td></tr><tr><td>Hidróxido de amónio NH4OH</td><td>BDH</td><td>BDH3014</td><td>Disponível na VWR, testado a 28-30% NH3</td></tr><tr><td>Tiocianato de sódio 25</td><td>mM Acros Organics</td><td>419675000</td><td>Para amostras de soro/plasma</td></tr><tr><td>Tiras de reagentes de urina multi-analitos</td><td>Siemens</td><td>2161</td><td>Para amostras de urina</td></tr><tr><td>Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)</td><td>Life Technologies</td><td>LC2676</td><td>Use em RT para evitar que SDS precipite</td></tr><tr><td>Incubadora de banho seco (100 oC) com bloco de aquecimento</td><td>Barnstead</td><td>11-715-125DQ</td><td>Não substitua um banho-maria fervente</td></tr><tr><td>Coletor do evaporador de nitrogênio</td><td>Organomation Associates</td><td>Microvap118</td><td>Para amostras de soro/plasma</td></tr><tr><td>Centrífuga, rotor basculante</td><td>Série Sorvall</td><td>Legend Capacidade</td><td>do tubo de 50 ml, rcf 3.700 x g</td></tr><tr><td>Centrífuga, rotor de ângulo fixo</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>Capacidade de microcentrífuga de 1,7 ml, RCF 16.000 x G</td></tr><tr><td>Centrífuga cônica de 50 ml&nbsp; tubos</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Com tampas de rosca para amostras de urina</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Misturador Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-949-755</td><td></td></tr><tr><td>Temporizador</td><td>Fisher Scientific</td><td>S04782</td><td>Segundos/minutos</td></tr></tbody></table>

hidrogel nanopartículas colheita de plasma ou urina para detectar proteínas de baixa abundância

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Descoberta de biomarcadores Novel desempenha um papel crucial no fornecimento de detecção mais sensível e específico para a doença. Infelizmente muitos biomarcadores baixa abundância que existem em fluidos biológicos não pode ser facilmente detectada com a espectrometria de massa ou imunoensaios, pois eles estão presentes em concentrações muito baixas, são instáveis, e muitas vezes são mascarados por proteínas de abundância elevada, tais como albumina ou imunoglobulina. Bait contendo poli (N-isopropilacrilamida) (NiPAM) nanopartículas à base são capazes de superar essas barreiras fisiológicas. Num passo que eles são capazes de captar, concentrar e preservar biomarcadores de fluidos corporais. Analitos de baixo peso molecular entrar no núcleo da nanopartícula e são capturados por diferentes corantes químicos orgânicos, os quais actuam como iscos de proteína com elevada afinidade. As nanopartículas são capazes de se concentrar as proteínas de interesse em várias ordens de magnitude. Este factor de concentração é suficiente para aumentar o nível de proteína de tal modo que as proteínas estão dentro dolimite de detecção de corrente de espectrómetros de massa, transferência de western, e imunoensaios. As nanopartículas podem ser incubadas com uma variedade de fluidos biológicos e que são capazes de enriquecer grandemente a concentração de proteínas de baixo peso molecular e de péptidos e excluindo albumina e outras proteínas de alto peso molecular. Os nossos dados mostram que uma amplificação de 10.000 vezes na concentração de um analito particular, pode ser conseguido, permitindo que a espectrometria de massa e ensaios imunológicos para detectar biomarcadores anteriormente indetectáveis.

Hidrogel nanopartículas tamanho e uniformidade Poli (NiPAM-AAC) partículas foram produzidas com um rendimento extremamente elevado e reprodutibilidade entre e dentro dos grupos. As partículas têm muito boa estabilidade coloidal à TA durante o tempo necessário para a recolha, o armazenamento, e a eluição das proteínas (pelo menos 48 horas), e precipitação das nanopartículas não foi observado (Figura 1) 11. A estabilidade coloidal pode ser muito imp...

Vários biomarcadores patológicos não podem ser facilmente detectados pelas técnicas atuais devido à sua baixa concentração em fluidos biológicos, à presença de enzimas degradantes e a grandes quantidades de proteínas de alto peso molecular. Nanopartículas de hidrogel quimicamente funcionalizadas podem colher, preservar e concentrar proteínas de baixa abundância, permitindo a detecção de biomarcadores anteriormente indetectáveis.

Hidrogel nanopartículas colheita de plasma ou urina para detectar proteínas de baixa abundância

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

O objetivo geral deste procedimento é colher, concentrar e preservar biomarcadores de baixa abundância e baixo peso molecular de fluidos biológicos em concentrações apropriadas. Para ensaios de proteínas padrão, isso é feito pela adição de nanopartículas de hidrogel quimicamente funcionalizadas ao fluido biológico, de baixo peso molecular. Os analitos entram no núcleo da nanopartícula e são capturados por diferentes corantes químicos orgânicos, que atuam como iscas proteicas de alta afinidade.O segundo passo é separar as partículas do biofluido por centrifugação. As nanopartículas concentram as proteínas de interesse em várias ordens de magnitude. As nanopartículas são então lavadas com água para remover proteínas estranhas.A etapa final é eluir as proteínas capturadas das nanopartículas. Em última análise, western blotting, espectrometria de massa ou ensaios de aminoácidos são usados para mostrar a presença e/ou concentração dos biomarcadores de baixa abundância colhidos anteriormente indetectáveis. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque as nanopartículas precisam ser lavadas e suspensas.Sem entupir a ponta da pipeta, as nanopartículas não suspendem

hydrogel-nanoparticle-harvesting-plasma-or-urine-for-detecting-low

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Nós desenvolvemos uma tecnologia baseada na película fina de sílica mesoporosa para a recuperação selectiva de proteínas de baixo peso molecular e peptídeos a partir de soro humano. As propriedades físico-químicas dos nossos chips mesoporosos foram afinado para proporcionar um controle substancial no enriquecimento de peptídeo e, conseqüentemente, o perfil do proteoma de soro para fins de diagnóstico.

Enriquecimento protéico de baixo peso molecular em filmes finos de sílica mesoporosa para a descoberta de biomarcadores

Este manuscrito descreve um protocolo para isolar exossomos da urina humana usando uma técnica de precipitação modificada.

Um método de precipitação de modificação para isolar exossomas urinária

Este protocolo demonstra como atingir a sensibilidade de detecção femto molar de proteínas em 10 μL de sangue total em 30 min. Isso pode ser alcançado usando esteiras nanofibrosas eletrofiadas integradas em um lab-on-a-disc, que oferece alta área de superfície, bem como mistura e lavagem eficazes para melhorar a relação sinal-ruído.

Totalmente dispositivo automático centrífugo microfluídicos para a detecção de proteínas Ultrasensitive de Sangue Total

Aqui, apresentamos um protocolo para purificar exosomes do plasma e soro com reduzida co purificação de proteínas do sangue não-exosomal. O protocolo otimizado inclui ultrafiltração, tratamento com proteases e cromatografia de exclusão. Reforçada purificação de exosomes análises benefícios a jusante, incluindo a quantificação mais precisa de vesículas e caracterização proteômica.

Digestão de proteínas, ultrafiltração e cromatografia de exclusão para otimizar o isolamento do Exosomes do Plasma de sangue humano e soro

Este protocolo descreve a síntese e formulação de biomateriais hidrogéis de polímero supramolecular injetável (PNP). As aplicações desses materiais para entrega de medicamentos, estabilização biofarmacêutica e encapsulamento e entrega celular são demonstradas.

Hidrogéis de polímero supramolecular injetável para aplicações de entrega de células e medicamentos

O uso de hidrogéis fotodegradáveis para isolar células bacterianas utilizando uma ferramenta de pattering de luz de alta resolução é relatado. Procedimentos experimentais essenciais, resultados e vantagens do processo são revistos. O método permite o isolamento rápido e barato de bactérias-alvo que mostram funções raras ou únicas de comunidades ou populações heterogêneas.

Interfaces de hidrogel fotodegradável para triagem, seleção e isolamento de bactérias

Um protocolo é apresentado para a determinação de biomarcadores de baixa abundância a partir de amostras secas de soro exemplificadas com o biomarcador progastrina-releasing peptide (ProGRP). Esferas magnéticas revestidas com anticorpos são usadas para a limpeza seletiva e enriquecimento de um peptídeo proteotípico ProGRP. O peptídeo capturado é posteriormente analisado por cromatografia líquida-espectrometria de massas em tandem.

Microamostragem em Análise de Proteínas de Baixa Abundância Baseada em Espectrometria de Massa

Este artigo descreve uma metodologia para o isolamento, caracterização e quantificação de vesículas extracelulares derivadas de plasma humano (EV) e apresenta um fluxo de trabalho para análise sem marcação do proteoma EV usando cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS).

Isolamento, caracterização e análise proteômica de vesículas extracelulares derivadas de plasma para descoberta de biomarcadores cardiovasculares

Este protocolo padroniza a análise SDS-PAGE para perfilamento personalizado de corona proteica em nanopartículas, permitindo a detecção reprodutível, escalável e de baixo custo de assinaturas específicas do câncer. Projetado para o diagnóstico precoce do adenocarcinoma ductal pancreático, oferece uma alternativa prática e alinhada ao REASSURED aos métodos proteômicos complexos tanto em pesquisas quanto em ambientes clínicos.

Fluxo de Trabalho Padronizado SDS-PAGE para Perfil Personalizado de Corona de Proteínas na Detecção Precoce de Câncer

A técnica de litografia versátil plasma foi desenvolvido para gerar padrões de superfície estável para orientar adesão celular. Esta técnica pode ser aplicada para criar redes de células, incluindo as que imitam tecidos naturais e tem sido usada para estudar vários tipos de células distintas.

Padronização de plasma de superfície litografia para a Criação de Redes de celular

Aprenda a usar nanopartículas de hidrogel funcionalizadas para capturar e concentrar biomarcadores de baixa abundância em plasma ou urina. Este método aumenta a sensibilidade de detecção em ensaios proteicos padrão.

Hidrogel nanopartículas colheita de plasma ou urina para detectar proteínas de baixa abundância

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