Ex vivo preparações da Intacta Vomeronasal Órgão e acessórios bulbo olfatório

O objetivo geral deste procedimento é produzir uma preparação ex vivo do órgão nasal de camundongo funcionalmente conectado, ou VNO, um bulbo olfatório acessório ou um OB. Isso é feito realizando primeiro uma dissecção grosseira do crânio do camundongo para isolar um único hemisfério do focinho e do bulbo olfatório. Na segunda etapa, os delicados axônios VNO e um OB são expostos por meio de uma dissecção secundária em uma câmara de perfusão tecidual. Finalmente, uma cânula fina é inserida no VNO através da qual o odor e o estímulo podem ser introduzidos.

Em última análise, os registros eletrofisiológicos podem ser usados para medir a atividade neural dentro do A OB durante a estimulação VNO. A vantagem dessa técnica em relação às técnicas existentes, como a eletrofisiologia de fatias in vitro, é que, com essa técnica, o órgão sensorial e os circuitos neurais a jusante permanecem funcionalmente conectados. A demonstração visual desse método é crítica, pois há muitas etapas delicadas de dissecção que são difíceis de aprender e porque erros em qualquer uma dessas etapas podem resultar em uma dissecção malsucedida. Para iniciar a dissecção primária, primeiro use uma pinça Addin para remover os ossos parietal e frontal do crânio do camundongo, tomando cuidado para não entrar em contato com os bulbos olfatórios.

Em seguida, use um bisturi para fazer um corte coronal no lobo frontal, dois milímetros mimados nos seios da face e, em seguida, remova o mimo cerebral no corte. Use uma tesoura reta para remover os aspectos expostos do crânio ventral, deixando os seios da face e o tecido nervoso restante. Remova o arco zigomático e os músculos faciais do lado anatômico direito do crânio e, em seguida, vire o focinho com o lado ventral para cima.

Para expor o céu da boca, insira imediatamente a ponta da lâmina do bisturi sob a paleta paralela ao céu da boca e, em seguida, mova a lâmina em direção aos incisivos. Segure a borda rostral liberada da paleta com a pinça e remova o palato puxando com força. Em seguida, no lado anatômico esquerdo do crânio, insira apenas a ponta da lâmina do bisturi no vazio próximo aos molares e gire o punho para estender o forame palatino com cuidado.

Começando pelo forame pequeno próximo aos molares, use a ponta da lâmina do bisturi para continuar a cortar do forame palatino através dos incisivos, começando rostral para o VNO anatômico esquerdo com vários cortes de pontuação. Em seguida, vire o tecido de modo que o crânio dorsal fique voltado para cima e oriente uma lâmina de barbear verticalmente e paralelamente à linha média na borda do mimo da preparação na borda ventral do tecido, toque a borda cortante da lâmina de barbear imediatamente à esquerda da linha média e balance suavemente a lâmina movendo-se ao longo do palatino esquerdo para Raymond, mantendo a lâmina paralela à rocha da linha média. A lâmina de barbear lentamente com pressão em direção à parte anterior do tecido, parando imediatamente após romper a resistência na placa cribriforme.

Segure os hemisférios expostos perto dos lados do mimo com os dedos enluvados e gire-os suavemente lateral e anteriormente para separar os tecidos. Agora aplique 50 a 100 microlitros de cola de tecido em uma prancha de plástico fina. Segure o tecido com uma pinça e seque a preparação com uma toalha de papel para remover o excesso de umidade de seu lado lateral.

Use a pinça para colocar suavemente a borda lateral do hemisfério direito na cola. Em seguida, coloque uma gota de graxa a vácuo de três a cinco milímetros de diâmetro e dois milímetros de profundidade no meio de uma câmara de dissecação secundária e coloque o lado da prancha oposto ao tecido firmemente contra a graxa. Encha imediatamente a câmara de dissecção com dissecção gelada, líquido cefalorraquidiano artificial ou LCR A e transfira a câmara para a área de dissecção fina.

Em seguida, comece a profusão da câmara com o padrão oxigenado A CSF orientando a prancha de modo que o bulbo olfatório esteja diretamente no fluxo do fluido recém-oxigenado para executar. A dissecção secundária Comece usando uma pinça fina para remover qualquer bulbo olfatório contralateral visível ou tecido cortical. A partir da preparação, localize a dura-máter branca ao longo da superfície medial dorsal do bulbo olfatório e, em seguida, usando dois pares de pinças finas, rasgue a dura-máter segurando-a na parte mais branca e separando a pinça.

Em seguida, lenta e cuidadosamente, retire o córtex frontal com uma pinça fina sem danificar os bulbos olfativos subjacentes. Uma vez separado o córtex frontal, corte e remova o tecido ventral e posterior ao A OB, tomando cuidado para não danificar a camada glomerular. Em seguida, passe um único ponto da pinça fina entre a cartilagem septal e a asa VNO, um pedaço fino de tecido ósseo que corre ao longo da borda dorsal de ambos os VN Os.To remova cuidadosamente o VNO contralateral após remover o VNO completamente, use uma pinça fina para fazer um corte na borda ventral da cartilagem septal, onde se estreita para um avascular branco correndo ao longo da borda ventral do osso septal.

Aperte a pinça fina para fazer uma ponta semi-romba e insira a pinça lateral ao corte. Em seguida, levante lentamente a cartilagem do tecido septal, prosseguindo e sem perturbar o tecido septal subjacente. Segure o osso com uma pinça e mova suavemente o osso para frente e para trás até que ele rache perto da placa de reforma do berço.

Agora, conecte uma cânula de poliamida a um dispositivo de perfusão rápida e inicie um fluxo de solução de ringer de 0,1 a 0,3 mililitros por minuto através da cânula de poliamida. Meça a vazão com um medidor de vazão de pequeno volume em linha. Por fim, oriente a cânula paralelamente à entrada do VNO.

Quando a cânula estiver no lugar, observe como a pressão de saída faz com que o VNO infle levando à evacuação do vaso sanguíneo. Em seguida, insira imediatamente a cânula no VNO, mantendo o ângulo da cânula constante para que permaneça paralela à abertura do VNO e inicie a avaliação da função fisiológica. Uma grande fonte de variabilidade entre as preparações é a densidade e fragilidade dos ossos do crânio e focinho dos animais experimentais.

Não é incomum que os tecidos septais permaneçam ligados ao hemisfério contralateral, especialmente perto dos pontos de fixação aos ossos dorsais do focinho. Outros erros comuns de dissecção surgem durante a dissecção fina secundária, durante a qual os axônios do nervo nasal RO podem ser danificados no tecido septal próximo ao VNO ou próximo ao OB. Esses e outros eventos semelhantes resultarão em conectividade incompleta entre os neurônios sensoriais nasais RO e a renderização de A OB. As preparações inutilizáveis após a conclusão bem-sucedida do procedimento.

A conectividade funcional pode ser verificada usando um ensaio fisiológico, como registros eletrofisiológicos de unidade única da atividade neural em resposta à estimulação VNO com odorantes. Ao tentar este procedimento, é importante manter a calma e fazer pequenas pausas. Se você ficar cansado, pequenos erros no desempenho dessa técnica podem danificar essas delicadas estruturas neurais.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar dissecações ex vivo do sistema de fábrica de acessórios inicial para estudos eletrofisiológicos ou de imagem.