Name: Murino transplante de córnea: Um modelo para estudar a forma mais comum de Transplante de Órgãos Sólidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Aprenda o transplante de córnea murino para estudar rejeição de enxerto em imunologia usando camundongos. Este modelo permite avaliar a integridade do enxerto e testar estratégias terapêuticas.

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Os autores gostariam de agradecer às muitas pessoas que trabalharam e aperfeiçoaram esta técnica e foram responsáveis pela geração de muitos manuscritos neste laboratório e em outros. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health Grant EY12707 (PMS) e uma bolsa irrestrita da Research to Prevent Blind

NOTA: Todos os animais utilizados neste procedimento são tratados de acordo com a Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia declaração para o Uso de Animais em Oftálmica e Vision Research, bem como as diretrizes estabelecidas pelo animal comitê de supervisão em Saint Louis University. Nota: Todos os instrumentos cirúrgicos e soluções são esterilizadas antes da cirurgia para limitar a infecção microbiana do olho. Deve notar-se que, enquanto os animais experimentam alguma dor com este procedimento, não empregamos analgésicos. A razão para isto é porque todos são analgésicos e anti-inflamatórios vez que as respostas de transplante de córnea envolvem a inflamação, a utilização de drogas anti-inflamatórias iria comprometer a nossa capacidade para determinar quais os factores que estão envolvidos na falha de enxerto da córnea. 1. Anestesia <ol style="margin-left: 40px;"><li> Coloque ratos doadores e receptores sob anestesia geral por meio de injeções IP de cetamina (86.98 mg / kg) e xilazina (13,04 mg / kg). </li><li> Mantenha o mouse destinatário sob anestesia durante todo o processo, que normalmente leva 30 minutos a uma hora. Consequentemente, monitorar constantemente o mouse para detectar quaisquer sinais de recuperar a consciência. </li><li> Aplicar puralube pomada para o olho que não vai passar por cirurgia depois que o animal é anestesiado para prevenir o ressecamento. </li></ol> 2. Alongamento de córnea <ol style="margin-left: 40px;"><li> Obtenção do botão da córnea do doador. <ol><li> Uma vez que o animal é completamente anestesiados, atingir midríase por administração adequada de um par de gotas oculares de tropicamida a 1% e 2,5% de cloridrato de fenilefrina. </li><li> Posicione a cabeça do animal doador horizontalmente em uma placa colocada em um suporte móvel resistente. Fixar a cabeça com uma tira de fita adesiva em volta do pescoço para assegurar que o olho está em uma posição horizontal ao longo de toda a operação. </li><li> Usando um trephine 2 mm de diâmetro, cuja ponta foi tingida com azul de metileno, para foraforrar o local do enxerto da córnea central. </li><li> Com uma lâmina afiada, penetrar na córnea e injectar Healon dentro da câmara anterior para a aprofundar a reduzir a possibilidade de danos no endotélio dador e lente subjacente. </li><li> Extirpar o enxerto doador com Vannas tesoura e coloque em um prato contendo solução salina equilibrada de Hanks até o uso. </li><li> Após o enxerto de doadores tem sido removido, eutanásia do camundongo doador através de inalação de CO2. </li></ol></li><li> Preparando o leito do enxerto. <ol><li> Repita os mesmos passos como descrito em 2.1.1 através 2.1.2 para o destinatário. </li><li> Usando uma trefina de diâmetro 1,5 mm, delinear local do enxerto destinatário. </li><li> Com uma lâmina afiada, penetrar na córnea e injectar Healon dentro da câmara anterior para a aprofundar a reduzir a possibilidade de danos para a lente subjacente. </li><li> Remova o botão central da córnea delineado a partir do destinatário usando Vannas tesoura e descarte. </li></ol></li><li> Suturar oenxerto <ol><li> Coloque a córnea do doador sobre o enxerto cama na córnea do destinatário. Certifique-se de que Healon adequado está sob a córnea do doador para proteger as células endoteliais do doador de dano pelo contato direto com a lente. </li><li> Usando micropinças derrubadas super fino, coloque a primeira mordida de nylon 11-0 sutura no lado do doador, por meio do doador com 90% de profundidade de espessura total para o lado do destinatário, em seguida, amarrar. </li><li> Uma vez que a córnea está ancorada no lugar, realizar suturas interrompidas midcardinal de tal forma que a córnea tem de 8 a 10 pontos totais e da córnea do doador está firmemente alinhados com e anexados ao leito do enxerto corneano destinatário. </li></ol></li><li> O aprofundamento da câmara anterior <ol><li> Aprofundar a câmara anterior através da injecção de HBSS ou bolha de ar para dentro da câmara anterior e verificar cuidadosamente a integridade do enxerto da córnea para detecção de fugas com uma esponja de celulose. NOTA: Se a câmara anterior não pode ser reformado, então há uma alta probabilidade de cataract que fará com que as futuras avaliações da córnea transplantada muito difícil e também irá levar à disfunção endotélio corneano doador e falha assim enxerto. </li></ol></li><li> Avaliação final <ol><li> Observar o olho para determinar que a pupila é redonda e a profundidade da câmara anterior é normal. NOTA: Se o aluno não é redondo, isso indica que, durante a sutura da íris foi danificado e, assim, o enxerto é considerada uma falha técnica. </li><li> Aplicar pomada antibiótica ao olho. Opcional: Feche a tampa do olho com uma sutura de seda 7-0. </li><li> Observe ratos até que estejam totalmente acordado e depois individualmente abrigá-los por um período mínimo de dois dias após a cirurgia. </li></ol></li></ol> Remoção 3. Sutura <ol style="margin-left: 40px;"><li> Naqueles casos em que a tampa de sutura é usado, anestesiar os ratos, tal como descrito acima e remover o fio de sutura na tampa 48 h. </li><li> Anestesie camundongos no dia 7 pós-operatório. Remover o sutures fixar o enxerto da córnea. Uma vez que as suturas são removidas eo animal está totalmente desperto, coloque-o na gaiola. </li></ol> 4. Avaliação Clínica <ol style="margin-left: 40px;"><li> Examinar o olho para indicações de complicações processuais que incluem, catarata (opacificação do cristalino), hifema (sangue na câmara anterior), uma câmara anterior, que não é da profundidade adequada, ou opacidade significativa da córnea. Considere aqueles que demonstram estas complicações como &quot;comprometida&quot; e sacrificá-los por inalação de CO2. <ol><li> Realizar todos os exames em ratos não anestesiados. Segure o mouse com restringindo um lado, portanto, o mouse para que o outro lado pode proptose do olho para permitir uma melhor visão do olho. Uma vez que as observações são concluídas, devolver o animal para sua gaiola. </li></ol></li><li> Já um observador familiarizado com os grupos de tratamento avaliam córneas transplantadas 2-3 vezes por semana para os sinais de transplante de córneaepisódios de rejeição ou falência do transplante. Use o microscópio cirúrgico ou um biomicroscópio de lâmpada de fenda horizontal para estas observações. <ol><li> Avaliar cada córnea para a opacidade utilizando uma escala de 0 a 5. A escala é definida como se segue: <ol><li> Atribuir uma pontuação de 0 a essas córneas que não têm sinais de opacidade. </li><li> Atribuir uma pontuação de 1 a essas córneas que mostram opacidade superficial mínima. </li><li> Atribuir uma pontuação de 2 a córneas que exibem opacidade leve e profundo, mas o aluno subjacente e íris são ainda perceptíveis. </li><li> Atribuir uma pontuação de 3 a córnea que são apresentados opacidade do estroma da íris, em que não pode ser visto em pormenor, com a excepção de as margens da pupila. </li><li> Atribuir uma pontuação de 4 a córnea que exibir densa opacidade estromal e se há estruturas subjacentes podem ser vistos. </li><li> Atribuir uma pontuação de 5 a córnea que exibir completa opacidade e edema estromal intensivo, com a pupila e íris totalmente obscurecido. </li></ol></li><li><html> Também avaliar cada córnea para o grau de infiltração de vasos sanguíneos (neovascularização), utilizando uma escala de classificação de 1 a 8. Para realizar isto, ver a córnea como consistindo em quatro quadrantes iguais e determinar a quantidade de vasos sanguíneos em cada um destes quadrantes, com um marcar essa gama vontade de 0 (sem vasos) a 2 de extensa vascularização do que quadrante. Adicione as pontuações individuais de cada quadrante para calcular a pontuação final neovascularização. </li><li> Classifique córneas como agudamente rejeitados se eles têm uma pontuação de 3 para duas observações consecutivas para o tempo aponta até 5 semanas. </li><li> Classifique camundongos cuja córneas foram claros em 5 semanas, mas desenvolver opacificação às vezes&gt; 45 dias após o enxerto, com uma pontuação de 3 para dois momentos consecutivos, como tendo sofrido rejeições de fim de prazo. Use curvas de sobrevida de Kaplan-Meier para analisar a sobrevida do enxerto. </li></ol></li></ol> 5. A manipulação do Modelo em-left: 40px; &quot;&gt; <li> Preparação das células individuais do baço. <ol><li> Para preparar células individuais, primeira eutanásia do rato doador. Em seguida, remover o baço. </li><li> Inserir o baço em um filtro de células e rompê-la com um êmbolo da seringa a partir de uma seringa de 3 ml. </li><li> Lavar as células e ressuspender em 10 ml de Solução Salina Equilibrada de Hanks. </li><li> Retirar 10 jul de suspensão de células e adicionar 10 ul de 0,4% de azul tripano e misturar. Acrescentar que a hemocitômetro e contar as células na grade central. O número de células na câmara de ar é a contagem de células de 10 x 4 x 2 (factor de diluição em azul tripano) x 10 (volume no tubo). </li></ol></li><li> Injecção para a câmara anterior. <ol><li> Anestesiar ratos, tal como descrito anteriormente. </li><li> Realizar injecções usando um microscópio de dissecação. Para cada injecção intracameral, usar 10 6 células do baço em um volume de 0.005 ml e uma seringa de microlitro 0,25 ml, equipado com uma agulha 33 G. NOTA: Outras manipulaçõesdo modelo pode ser realizada pelo tratamento dos animais com os reagentes que actuam como antagonistas ou agonistas para determinar o papel que um factor particular pode desempenhar após a cirurgia do enxerto corneano ortotópico. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

O modelo murino de transplante de córnea aqui descrito permite ao investigador para estudar rejeições humano em um modelo que é preditiva de quais fatores são mais associada tanto rejeição 15,17,18,20, 26-30 e 21-25 aceitação de córnea aloenxertos. Ao contrário do transplante de córnea humana, no qual os pacientes recebem tratamento com esteróides ou tópica ou sistêmica, quer tratar ou prevenir a rejeição de 31, este modelo é normalmente usado para determinar os fatores que são relevante...

O transplante de córnea é um dos tipos comuns e mais bem sucedidas do transplante realizados em seres humanos. As razões pelas quais esta cirurgia é realizada são resultado de uma lesão, uma doença infecciosa, ou outras formas de doença não infecciosa de córnea 2. Números da Associação Eye Bank of America indicam que mais de 46 mil foram realizados em 2011 (veja o site em: restoresight.org/eye_banks/eye_banks.html). Uma indicação do seu sucesso é que as taxas de falha de um ano por córneas alogênicos variam de 10 a 15% e em 5 anos o sucesso é superior a 70% 3-8. Como vários estudos têm demonstrado, o sucesso de aloenxertos da córnea está directamente relacionada com o facto de o olho é um local imunologicamente privilegiado. Os factores responsáveis ​​para o status de córneas como um sítio imunologicamente privilegiado incluem a falta de ambos os vasos sanguíneos e linfáticos na córnea, uma ausência relativa de células apresentadoras de antigénios, factores produzidos pela córnea que suppress Funtions efetoras imunes 9-15, baixa expressão de antigénios MHC 16, e a expressão de FasL 17-20. No entanto, apesar destes fatores predisponentes desses enxertos para o sucesso, eles passam por rejeição 3-7. Consequentemente, a compreensão desses mecanismos que mediam essa rejeição, assim como testar várias terapias para prevenir a rejeição é de fundamental importância. Para esse fim, nós descrevemos aqui um modelo murino de transplante de córnea, que tem sido usado por mais de 20 anos para estudar o transplante de córnea em um ambiente experimental controlado. Como as respostas de transplante envolve muitos fatores diferentes que trabalham em conjunto que irá final determinam se o tecido transplantado falhar ou for bem-sucedido, não é possível compreender a importância desses fatores em qualquer modelo in vitro. Consequentemente, estudos utilizando animais intactos são necessários para determinar quais fatores são importantes para o sucesso ou failure de tecido transplantado. Enquanto outras espécies de animais têm sido utilizados para estudar o transplante de córnea, o modelo murino tem diversas vantagens quando comparado com a utilização de outras espécies. A primeira é a existência de muitas cepas de camundongos que expressam certos transgenes ou foram gene-alvo que falta expressão de fatores imunológicos específicos, cuja função no transplante podem ser melhor estudados. Além disso, existem muitos factores de ambos os reagentes (recombinantes e anticorpos que neutralizam factores) que são específicos para os ratos, e que não existem para muitas outras espécies de animais. Por causa da existência desses fatores, este modelo tem sido amplamente utilizado para identificar os fatores relevantes envolvidos em respostas de córnea aguda de aloenxerto 15, 17,18,20 -29. Além disso, muitos dos factores envolvidos no transplante de córnea são também conhecidos para serem funcionais no transplante de outros tecidos.

<table><tbody><tr><td>Microscópio Cirúrgico Zeiss</td><td>Seringa Reconstruída</td><td></td><td>Zeiss</td></tr><tr>1<td>ml</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 3 ml</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 10 ml</td><td>BD</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Vannus Tesoura</td><td>Stortz</td><td>E-3387</td><td></td></tr><tr><td>11-0 Suturas</td><td>Alcon</td><td>717939M</td><td></td></tr><tr><td>Trefina 2,0 mm</td><td>Katena</td><td>K 2-7520</td><td></td></tr><tr><td>Trefina 1,5 mm</td><td>Katena</td><td>K 2-7510</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de Tricaína 0,5%</td> <td>Alcon</td><td>NDC 0065-0741-12</td><td></td></tr><tr><td>Healon</td><td>Abbott</td><td>Healon OVD</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>7-0 Suturas</td><td>Alcon</td><td>8065</td><td></td></tr><tr><td>2,5% Fenilefrina HCl</td><td>Alcon</td><td>NDC 61314-342-02</td><td></td></tr><tr><td>1% Tropicamida</td><td>Bausch & Lomb</td><td>NDC-24208-585-59</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>7654-01</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de 33 gauge</td><td>Hamilton</td><td>90033</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer (100 &mu; m nylon)</td> <td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Cardinal Health</td><td>B3175</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr></tbody></table>

murino transplante de córnea: um modelo para estudar a forma mais comum de transplante de Órgãos sólidos

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

O transplante de córnea é a forma mais comum de transplante de órgãos nos Estados Unidos, com entre 45.000 e 55.000 procedimentos realizados a cada ano. Embora existam vários modelos animais para este procedimento, os camundongos são as espécies mais comumente usadas. As razões para o uso de camundongos são o custo relativo do uso desta espécie, a existência de muitas cepas geneticamente definidas que permitem o estudo das respostas imunes e a existência de uma extensa gama de reagentes que podem ser usados para definir melhor as respostas nesta espécie. Este modelo tem sido usado para definir fatores na córnea que são responsáveis pelo estado de privilégio imunológico relativo desse tecido que permite que os aloenxertos da córnea sobrevivam à rejeição aguda na ausência de terapia imunossupressora. Também tem sido usado para definir os fatores que são mais importantes na rejeição de tais aloenxertos. Consequentemente, muito do que sabemos sobre os mecanismos de aceitação e rejeição do aloenxerto de córnea se deve a estudos usando um modelo murino de transplante de córnea. Além de descrever um modelo de rejeição aguda de aloenxerto de córnea, também apresentamos pela primeira vez um modelo de rejeição de aloenxerto de córnea tardia.

O modelo murino de transplante de córnea tem sido usado por mais de 20 anos com sucesso para caracterizar os mecanismos de rejeição do enxerto corneano tanto 19-23 e aceitação da córnea do enxerto 13, 15,16,18, 24-27. Este modelo foi utilizado para determinar a importância da expressão de FasL na aceitação do enxerto corneano, em que os animais que não possuem FasL não foram capazes de aceitar enxertos da córnea 15. Também tem sido usado para demonstrar que factor de crescimento endoteli...

Os camundongos têm sido usados como modelo para estudar muitas formas de transplante, incluindo o transplante de córnea. Descrevemos neste relato um modelo murino para transplante de córnea agudo e tardio.

Murino transplante de córnea: Um modelo para estudar a forma mais comum de Transplante de Órgãos Sólidos

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

O objetivo geral do procedimento a seguir é introduzir um modelo para rejeição aguda do aloenxerto da córnea. Isso é feito removendo primeiro a córnea do doador. As próximas etapas do procedimento são preparar o leito do enxerto receptor e suturar a córnea do doador no lugar.Em seguida, a integridade do enxerto é testada e, se não houver vazamentos, a pálpebra é suturada fechada. Após uma semana, a opacidade do enxerto de córnea é avaliada para medir a rejeição do aloenxerto. Em última análise, o modelo pode ser usado, pode testar uma variedade de estratégias terapêuticas para definir os fatores mais importantes ligados à rejeição do aloenxerto Dos transplantes de órgãos sólidos.O transplante de córnea é o mais comum nos Estados Unidos. Existem vários modelos animais disponíveis para este procedimento, mas os camundongos são os mais comumente usados. Este modelo tem sido utilizado para definir fatores que envolvem tanto a rejeição quanto a aceitação do transplante de córnea.Depois de anestesiar os camundongos doadores e receptores e confirmar seus estados anestesiados por uma pitada no dedo do pé, aplique pomada lubrificante pura nos olhos que não estão sendo submetidos à cirurgia.

murine-corneal-transplantation-model-to-study-most-common-form-solid

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

O modelo de transplante de coração de murídeo cervical é bem adequado para imunológico, bem como estudos de lesão de reperfusão de isquemia. Nós modificamos o procedimento usando uma técnica cuff não sutura e realizou mais de 1.000 transplantes de sucesso com essa abordagem.  Aqui, nós fornecemos mais detalhes desta técnica para complementar o vídeo.

Murino Cervical Modelo de coração Transplante usando uma técnica Cuff Modificado

Aqui, apresentamos um protocolo para estudar a imunologia da rejeição. O modelo cirúrgico apresentado relata um curto tempo operatório e uma técnica concisa. Dependendo da combinação de cepas doador-receptor, o rim transplantado pode desenvolver rejeição celular aguda ou dano crônico ao aloenxerto, definido por fibrose intersticial e atrofia tubular.

Rato Transplante Renal: Modelos de rejeição de enxertos

Para estudar o alotransplante combinado de órgãos sólidos e compostos vascularizados, descrevemos um novo modelo heterotópico de transplante de parede torácica, timo e coração em camundongos usando uma técnica de manguito cervical sem sutura.

A Microsurgical Modelo Novel para heterotópico, em bloco da parede torácica, Thymus, e Transplante Cardíaco em Ratos

Este novo modelo de transplante de membro posterior ortotópico em ratos, aplicando uma técnica manguito não sutura para a anastomose super-microvascular, fornece uma ferramenta poderosa para in vivo pesquisa imunológica mecanicista relacionadas com alotransplante composta vascularizado (VCA).

Ortotópico Hind Limb Transplantation no mouse

transplante de pele de espessura total murino é um modelo bem estabelecido para estudar a rejeição em um ambiente alloimmune. Aqui, nós fornecemos um tutorial de cada etapa envolvida na realização de um / c BALB -&gt; C57BL / 6 transplante de pele de espessura total.

Murino Transplante de pele de espessura total

Aqui, um protocolo passo a passo para a preparação e o cultivo de botões córneos rachados suínos é apresentado. Como este modelo organo-tipicamente cultivado da cultura do órgão mostra taxas de morte da pilha dentro de 15 dias, comparável às córneas doadoras humanas, representa o primeiro modelo permitindo o cultivo a longo prazo de córneas não-humanas sem adicionar o Dextran tóxico.

Um modelo de cultura de órgão endotelial corneano porcina usando Split córnea botões

O presente artigo descreve uma técnica modificada para transplante cardíaco vascularizado heterotópico com técnica asséptica atualizada, analgesia e anestesia.

Protocolo de transplante cardíaco heterotópico murino modificado que atende aos padrões contemporâneos de técnica asséptica, anestesia e analgesia

Este protocolo apresenta uma abordagem trans-escleral guiada por visão transpupilar para entregar com segurança e precisão enxertos celulares sub-retinianos, com baixa taxa de complicações cirúrgicas, em receptores de camundongos com ou sem degeneração retiniana.

Transplante transpupilar-guiado trans-escleral de enxertos sub-retinianos em modelo de camundongo com degeneração retiniana

Este estudo estabelece dois modelos padronizados de xenotransplante murino para replicar especificamente a rejeição celular aguda e a rejeição aguda mediada por anticorpos. Esses modelos servem como uma plataforma confiável para investigar mecanismos de rejeição imune de xenoenxertos, avaliar estratégias imunossupressoras e avançar na pesquisa pré-clínica em xenotransplante.

Um modelo murino padronizado com um fluxo de trabalho de três pessoas para estudar rejeição celular aguda e mediada por anticorpos em xenotransplante

Este protocolo apresenta uma técnica simplificada de anastomose de sutura ponta a ponta para transplante cardíaco cervical murino, fornecendo um modelo robusto e reprodutível para o estudo da imunologia de transplantes.

Transplante cardíaco de camundongo heterópico cervical usando a técnica de anastomose ponta a lateral para estudar imunologia de transplante

Aprenda o transplante de córnea murino para estudar rejeição de enxerto em imunologia usando camundongos. Este modelo permite avaliar a integridade do enxerto e testar estratégias terapêuticas.

Murino transplante de córnea: Um modelo para estudar a forma mais comum de Transplante de Órgãos Sólidos

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