Name: Coerentes anti-Stokes Raman Scattering (CARS) Microscopia visualiza farmacêuticas Comprimidos durante a dissolução (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Aprenda a usar microscopia CARS para visualizar a dissolução de comprimidos farmacêuticos em tempo real. Este método combina imagem quimicamente seletiva com espectroscopia UV para correlacionar mudanças superficiais com taxas de dissolução.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AF é apoiado pela Fundação holandesa Tecnologia STW, que é a divisão de ciência aplicada da NWO, e do Programa de Tecnologia do Ministério dos Assuntos Económicos. (STW OTP 11114).

<img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51847/51847fig1highres.jpg" width="500"> Figura 1. Esquema ilustrando a configuração microscópio CARS com o fluxo intrínseco através da configuração de dissolução. Este valor foi modificado a partir Fussell et al 13. 1. Inicialização do Sistema <ol><li> Ligue o 20 psec pulsava 1.064 nm CARROS laser e permitir que o laser para aquecer (cerca de 1,5 h). </li><li> Ligue a fonte de luz UV lâmpada de deutério e deixe-o aquecer-up (aprox. 10 min). </li><li> Abra o obturador da fonte de luz UV lâmpada de deutério, colocando o interruptor do obturador para "abrir". </li><li> Ligue o PC controle microscópio e abrir o software de controle de microscópio. </li><li> Ligue o espectrômetro UV PC e abra o software de controle do espectrômetro. </li></ol> 2. MiSetup croscope <ol><li> Escolha a objetiva do microscópio desejado. Use um objetivo 20X/0.5 NA para alcançar os resultados apresentados neste trabalho. </li><li> Defina os filtros na torre conjunto de filtros para transmitir lasers de excitação e de refletir o sinal CARROS. Seleccione um 775 nm espelho dicróico passa longo e um 650 nm passa-banda do filtro de 40 nm para reproduzir os resultados apresentados neste trabalho. </li><li> Colocar filtros apropriados na frente do detector de tubo fotomultiplicador (PMT), que transmitem o sinal CARROS e filtrar a luz indesejada. Filtrar a luz com um filtro de passe curto 750 nm e 650 nm filtro passa-banda de 40 nm para reproduzir os experimentos realizados neste trabalho. </li></ol> 3. Teste do Sistema <ol><li> Ligue a bomba peristáltica e meio de dissolução bomba por alguns minutos através da célula de fluxo UV em forma de Z para limpar líquido anterior a partir da tubulação. </li><li> Determinar a taxa de fluxo da bomba por pesagem da quantidade de meio de dissolução bombeado em 2 min. Ajuste a velocidade da bomba until caudal desejado é atingido. Bombear o meio de dissolução a uma taxa de fluxo de 5 mL / min para se obter os resultados relatados no presente trabalho. </li></ol> 4. Medição Dissolução UV <ol><li> No software de controle espectrômetro UV, clique no menu "Arquivo" e depois clique em "medição de absorção Novo" para abrir uma janela que lista todos os espectrômetros disponíveis. </li><li> Clique no espectrômetro UV correta e clique em "Next" para abrir uma janela que exibe os parâmetros de aquisição de dados. </li><li> Definir tanto o tempo de integração e o cálculo da média espectral. Escolha um tempo de integração de 150 ms com 200 médias para replicar os resultados apresentados neste trabalho. </li><li> Clique no botão "Next" para abrir a tela usada para registrar o espectro de referência. </li><li> Clique no botão que aparece como uma lâmpada de luz amarela para gravar um espectro de referência. Bomba meio de dissolução continuamente durante esta medida. </li><li> Feche o obturador da fonte de luz UV lâmpada de deutério, definindo o interruptor para "fechado". </li><li> Clique no botão "Next" para abrir a tela usada para registrar o espectro escuro. </li><li> Clique no botão que aparece como uma lâmpada cinza para gravar um espectro escuro. Bomba meio de dissolução continuamente durante esta medida. </li><li> Clique no botão que diz "Finish" para iniciar as medidas de absorbância UV. </li></ol> 5. CARROS Dissolução vídeo <ol><li> No CARROS controle microscópio clique software no botão que seleciona uma medida "XYT". </li><li> Clique na caixa drop-down e selecione o tamanho da imagem em pixels. Escolha um tamanho de imagem de 512 x 512 pixels para reproduzir as imagens apresentadas neste trabalho. </li><li> Arraste o controle deslizante de velocidade de imagem, quer ao "fast", "médio" ou posição "lento". Use a velocidade de digitalização rápida (1,12 segundos por imagem) para alcançaros resultados apresentados neste trabalho. </li><li> Clique nas setas rotuladas "zoom" para ajustar o nível de zoom. Selecione zoom "2x" para replicar o nível de zoom e campo de visão (350 x 350 mm) utilizado por esses resultados. </li><li> Clique na caixa drop-down e selecione o objetivo utilizada. </li><li> Clique na caixa de entrada e digite a quantidade de quadros necessários para o vídeo dissolução CARS (dependendo da duração da experiência). Conduzir dissolução por cerca de 15 minutos de gravação de 900 quadros para reproduzir os resultados apresentados neste trabalho. </li></ol> 6. CARROS Wavelength Sintonia <ol><li> Usando o oscilador paramétrico óptico (OPO) controlador ajustar as configurações da OPO, como temperatura, posição piezo, ea posição do filtro Lyot até saída do laser máxima na freqüência Raman desejado seja alcançado. Sintonize o OPO para 2.960 centímetros -1 para gravar os mesmos resultados que os apresentados neste artigo. </li></ol> 7. The Experiment Dissolução<ol><li> Coloque um comprimido em porta-amostras do costume carros construídos célula de fluxo, parafuso porta-amostras hermeticamente fechada para evitar vazamentos. </li><li> Prenda a tubulação aos carros de célula de fluxo que liga os CARROS célula de fluxo para o copo contendo o meio de dissolução e da bomba peristáltica. </li><li> Coloque a célula de fluxo CARROS contendo um comprimido sobre a platina do microscópio. </li><li> Verificar se os CARROS célula de fluxo está ligado ao meio de dissolução proveta, a bomba peristáltica, a célula de fluxo de UV em forma de Z e da taça de recolha de resíduos. </li><li> Clique no botão "XY repeat" para iniciar a verificação do sistema de microscópio em um modo de varredura contínua. </li><li> Ajustar a focagem do microscópio, movendo o objectivo, até a superfície da pastilha está no campo de vista no ecrã do computador de controlo do microscópio. </li><li> Clique no controle deslizante no software de controle de microscópio rotulado de "PMT". Ajuste a sensibilidade do detector de aumento / diminuição da tensão PMT atéuma imagem satisfatória (nem muito escuro nem saturada) é visível na tela. NOTA: Tome cuidado para não sobrecarregar o PMT usando alta tensão. Para este trabalho, utilizou-se uma tensão de PMT em torno de 600 V, mas este pode variar dependendo da PMT utilizado. </li><li> Clique em "Stop" no software de controle de microscópio para interromper a verificação contínua. </li><li> Simultaneamente (ou o mais próximo possível) começar a bombear meio de dissolução, iniciar a gravação de uma única varredura XYT, e iniciar a coleta de espectros de absorção UV. </li><li> Durante o experimento dissolução, monitorar a gravação de vídeo e ajustar manualmente o foco do microscópio para garantir o tablet está continuamente em foco. </li></ol> 8. Pós Dissolução <ol><li> Pare a bomba peristáltica por desligá-lo. </li><li> Clique no menu "Arquivo" e clique em "Salvar como vídeo" no software de controle de microscópio para salvar a digitalização XYT como um vídeo. </li><li> Clique no menu "Arquivo" e clique em "Salvar "e clique em" Stop Export "no software de controle de espectrômetro de interromper a coleta de espectros de absorção UV. </li><li> Retire os CARROS célula de fluxo do estágio do microscópio e remover o comprimido da célula de fluxo CARROS. </li><li> Lave os CARROS célula de fluxo com água e etanol, em seguida, seque com papel de seda. </li></ol>

<ol><li>Ku, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Biopharmaceutical+Classification+System+in+Early+Drug+Development%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of the Biopharmaceutical Classification System in Early Drug Development.</a> The AAPS Journal. 10, 208-212 (2008).</li>
<li>The United States Pharmacopeia. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22United+States+Pharmacopeial+Convention+32nd+ed%22">United States Pharmacopeial Convention 32nd ed</a>. , Rockville, MD. 1-8 (2009).</li>
<li>Florence, A. J., Johnston, A. Applications of ATR UV/vis spectroscopy in physical form characterisation of pharmaceuticals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlorence%2C+AJ+%22Spectrosc.+Eur%22">Spectrosc. Eur</a>. 4, John Wiley & Sons Ltd. (2004).</li>
<li>Aaltonen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+measurement+of+solvent-mediated+phase+transformations+during+dissolution+testing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">In situ measurement of solvent-mediated phase transformations during dissolution testing.</a> J. Pharm. Sci. 95, 2730-2737 (2006).</li>
<li>Savolainen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+understanding+of+dissolution+behaviour+of+amorphous+drugs+by+in+situ+solid-state+analysis+using+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Better understanding of dissolution behaviour of amorphous drugs by in situ solid-state analysis using Raman spectroscopy.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 71, 71-79 (2009).</li>
<li>Slipchenko, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrational+imaging+of+tablets+by+epi-detected+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Vibrational imaging of tablets by epi-detected stimulated Raman scattering microscopy.</a> Analyst. 135, 2613-2619 (2010).</li>
<li>Parekh, S. H., Lee, Y. J., Aamer, K. A., Cicerone, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Cellular+Imaging+by+Broadband+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Scattering+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Label-Free Cellular Imaging by Broadband Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy.</a> Biophys. J. 99, 2695-2704 (2010).</li>
<li>Kang, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Visualization+of+Paclitaxel+Distribution+and+Release+by+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Scattering+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">In Situ Visualization of Paclitaxel Distribution and Release by Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy.</a> Anal. Chem. 78, 8036-8043 (2006).</li>
<li>Kang, E., Robinson, J., Park, K., Cheng, J. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paclitaxel+distribution+in+poly%28ethylene+glycol%29%2Fpoly%28lactide-co-glycolic+acid%29+blends+and+its+release+visualized+by+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Paclitaxel distribution in poly(ethylene glycol)/poly(lactide-co-glycolic acid) blends and its release visualized by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> J. Controlled Release. 122, 261-268 (2007).</li>
<li>Kang, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+coherent+anti-stokes+Raman+scattering+microscopy+to+image+the+changes+in+a+paclitaxel-poly%28styrene-b-isobutylene-b-styrene%29+matrix+pre-+and+post-drug+elution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Application of coherent anti-stokes Raman scattering microscopy to image the changes in a paclitaxel-poly(styrene-b-isobutylene-b-styrene) matrix pre- and post-drug elution.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87A, 913-920 (2008).</li>
<li>Jurna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy+to+monitor+drug+dissolution+in+different+oral+pharmaceutical+tablets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Innovative+Optical+Health+Sciences%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy to monitor drug dissolution in different oral pharmaceutical tablets.</a> Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2, 37-43 (2009).</li>
<li>Windbergs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Imaging+of+Oral+Solid+Dosage+Forms+and+Changes+upon+Dissolution+Using+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Scattering+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical Imaging of Oral Solid Dosage Forms and Changes upon Dissolution Using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy.</a> Anal. Chem. 81, 2085-2091 (2009).</li>
<li>Fussell, A., Garbacik, E., Offerhaus, H., Kleinebudde, P., Strachan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+dissolution+analysis+using+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+%28CARS%29+and+hyperspectral+CARS+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">In situ dissolution analysis using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) and hyperspectral CARS microscopy.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85, 1141-1147 (2013).</li>
<li>Lua, Y. -Y., Cao, X., Rohrs, B. R., Aldrich, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Characterizations+of+Spin-Coated+Films+of+Ethylcellulose+and+Hydroxypropyl+Methylcellulose+Blends.+%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Surface Characterizations of Spin-Coated Films of Ethylcellulose and Hydroxypropyl Methylcellulose Blends. </a> Langmuir. 23, 4286-4292 (2007).</li>
<li>Skoog,, Holler, F. J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkoog%2C++%22Principles+of+Instrument+analysis.+6+ed%22">Principles of Instrument analysis. 6 ed</a>. , Thomson Brooks/Cole. (2007).</li>
<li>Rodríguez-Hornedo, N., Lechuga-Ballesteros, D., Hsiu-Jean, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+transition+and+heterogeneous%2Fepitaxial+nucleation+of+hydrated+and+anhydrous+theophylline+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Phase transition and heterogeneous/epitaxial nucleation of hydrated and anhydrous theophylline crystals.</a> Int. J. Pharm. 85, 149-162 (1992).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Ao realizar experimentos de dissolução microscópica CARS, existem alguns aspectos críticos que precisam ser monitorados durante o experimento. Em primeiro lugar, a introdução do meio de dissolução na célula de fluxo CARS faz com que o foco se mova. Isso significa que a imagem é imediatamente perdida e são necessários alguns mícrons de ajuste objetivo para encontrar a superfície novamente. Em segundo lugar, existe o risco de vazamento de líquido da célula de fluxo CARS se a tampa de vidro quebrar durante o experimento. Isso pode causar danos líquidos à ótica, por isso é importante ouvir qualquer som de rachadura que possa significar que o vidro quebrou. Finalmente, há também uma pequena chance de que a tubulação possa ficar bloqueada devido ao material particulado no sistema durante o experimento, isso pode ser visto como uma mudança repentina e incomum nos espectros UV e também através da verificação periódica do fluxo durante o experimento.
O bloqueio de partículas da tubulação é principalmente um problema com comprimidos que foram projetados para se desintegrar durante a dissolução. Esta é uma das limitações desta técnica, pois este sistema requer que a superfície do comprimido permaneça intacta durante toda a dissolução para permitir a obtenção de imagens. Além de comprimidos em desintegração, atualmente não é possível obter imagens de comprimidos projetados para inchar durante a dissolução, pois isso pode levar à quebra da célula de fluxo CARS.
Os comprimidos de imagem durante a dissolução fornecem uma maior compreensão do que está ocorrendo na superfície de um comprimido em dissolução. Os métodos convencionais de dissolução farmacêutica concentram-se apenas no conteúdo do medicamento dissolvido no meio de dissolução, que pode identificar se o comprimido passa ou não no padrão exigido. No entanto, no caso de um teste com falha, é difícil determinar o que causou a falha. O caso de um teste de dissolução com falha é potencialmente onde a análise de dissolução in situ usando microscopia CARS pode fornecer respostas.
Aplicações futuras para análise de dissolução in situ usando microscopia CARS podem incluir investigações usando comprimidos mais complicados contendo mais de um medicamento ou excipiente, em particular formas farmacêuticas de liberação sustentada ou controlada sem inchaço durante o desenvolvimento da formulação. Além disso, pode ser possível investigar amostras usando meios de dissolução biorelevantes, criando condições mais intimamente relacionadas ao in vivo. 
Em conclusão, este trabalho mostra que a microscopia CARS é capaz de imagens químicas específicas rápidas com base nas frequências vibracionais Raman, permitindo imagens seletivas do medicamento em um comprimido contendo medicamento e excipiente. Além disso, a microscopia CARS combinada com a espectroscopia de absorção UV em linha é uma ferramenta poderosa capaz de monitorar a superfície de comprimidos em dissolução e correlacionar as mudanças de superfície observadas usando CARS com mudanças na taxa de dissolução.

Durante o desenvolvimento de formas de dosagem farmacêuticas orais, tais como comprimidos e cápsulas, há uma forte ênfase em testes de dissolução. Formas de dosagem oral são necessários para dissolver antes de poderem ser absorvidas para a eficácia terapêutica. Fármacos pouco solúveis em geral têm problemas que atingem uma concentração adequada que faz com que os ensaios de dissolução particularmente importantes 1. Métodos de dissolução da Farmacopeia são mais comumente usados ​​para a análise de dissolução. Na maioria dos casos, isto requer a preparação do fármaco, como um comprimido ou cápsula, que é então colocado num copo de precipitação de fluir meio de dissolução. A concentração da droga dissolvida é depois determinada por análise de amostras do meio de dissolução, usando uma técnica de espectroscopia padrão tais como a espectroscopia de absorção de UV 2. Estes métodos de dissolução farmacêutica tradicionais não fornecem qualquer análise directa da amostra ou quaisquer alterações que possam ser ocorrem na superfície de dissolução da forma de dosagem.A análise direta da amostra durante a dissolução pode fornecer mais informações sobre a forma de dosagem de dissolução e, potencialmente, identificar problemas que causam falha no teste de dissolução. A análise directa de formas de dosagem de dissolução requer a utilização de técnicas analíticas em situ que são capazes de monitorizar o processo de dissolução. Para gravar in situ durante a dissolução, a técnica analítica não deve ser influenciada pela presença do meio de dissolução e da técnica necessita de uma alta resolução temporal para medir de forma fiável alterações à forma de dosagem de dissolução da ordem de segundos. Espectroscopia de reflectância total atenuada de UV demonstrou ser adequado para a medição de alterações durante a dissolução, mas não tem resolução espacial fornecida por técnicas de imagem 3. Técnicas de imagem farmacêutica tradicionais, como a microscopia eletrônica de varredura (MEV), e mapeamento Raman espontâneo ambos têm fatores que impedem seu uso na limitaçãositu para a dissolução. Imagem MEV é uma técnica rápida de imagiologia de alta resolução susceptível de representação gráfica da superfície de formas farmacêuticas. No entanto, SEM imagem geralmente é realizada sob condições de vácuo e requer revestimento amostra tornando-o inadequado para in situ dissolução de imagem. A espectroscopia de Raman espontânea acoplado a fibra combinado com um fluxo através da célula e espectroscopia de absorção de UV de fluxo contínuo, foi realizada para monitorizar vários sistemas de droga in situ durante a dissolução, incluindo teofilina 4, carbamazepina, indometacina e 5. A espectroscopia Raman foi capaz de identificar alterações da superfície que ocorrem durante a dissolução, mas não deu nenhuma informação espacial sobre onde as mudanças de superfície foram ocorrendo. Mapeamento Raman espontânea usa espectros Raman e fornece informação espacial sobre a superfície da amostra mas a imagem demora na ordem de minutos a horas, dependendo da área de imagem, tornandoinadequado para in situ dissolução de imagem. Microscopia Coherent anti-Stokes Raman (CARS) é uma técnica de imagem rápida e combinada com espectroscopia de absorção de UV em linha, que nos permitiu desenvolver uma técnica capaz de nos ensaios de dissolução situ. Microscopia CARROS fornece rápida imagiologia química selectiva, que não é influenciada pela presença de meio de dissolução tornando-se uma técnica adequada para a análise de dissolução in situ. Técnicas carros são divididos basicamente em dois grupos com base na duração do pulso dos lasers; sendo um deles CARROS de banda estreita (picosegundo lasers pulsados), e os outros sendo CARROS de banda larga (lasers pulsados ​​de femtossegundos). Um sistema de microscópio típico CARROS consiste de duas fontes de laser pulsado e um microscópio invertido. Para produzir um sinal CARROS, um dos lasers pulsados ​​deve ser ajustável para que haja uma diferença de frequência entre os dois lasers que corresponde a uma vibração de Raman. Adicionalmente,os dois lasers são necessários para se sobrepor no espaço (espacial) e tempo (temporal), com pulsos de ambos os lasers que chegam na mesma área de amostra ao mesmo tempo. Como vibrações Raman são quimicamente específica e sinal CARS só é gerado dentro do volume focal do microscópio, microscopia CARS é capaz de imagem quimicamente seletiva com uma resolução até o limite de difração. Microscopia banda estreita CARS utilizando um único modo vibracional Raman permite imagens sobre 100x mais rápido em comparação com técnicas de mapeamento Raman espontâneas 6. CARROS Banda Larga imagens de microscopia em uma faixa espectral mais larga (600-3,200 cm -1 vs ~ 4 cm-1), mas tem uma resolução mais baixa do espectro (cerca de 10 cm -1 vs ~ 4 cm-1) e menor velocidade de imagem (50 ms / pixel vs ~ 5 ms / pixel) em comparação com a microscopia CARS estreita 7. Microscopia de banda estreita CARROS foi utilizado para a imagem Drug libertação de alguns sistemas farmacêuticos. Na área das formulações farmacêuticas, Kang et al. 8-10 películas de polímeros carregadas com droga fotografada. Inicialmente, fotografou a distribuição da droga carregada, o que foi seguido por imagiologia da libertação do fármaco a partir de um meio de dissolução estático. Jurna et al. 11 e Windbergs et al. 12 foi um passo além e fotografada em primeiro lugar a distribuição de teofilina em formas de dosagem de lipídios seguido pela imagem da dissolução do fármaco através de um meio de dissolução dinâmica. Nós desenvolvemos um novo método analítico para monitorar simultaneamente alterações da superfície do tablet submetidos a dissolução com microscopia CARS banda estreita durante a gravação da concentração do fármaco dissolvido com espectroscopia de absorção de UV. Nós ilustramos o uso deste método de imagem comprimidos contendo teofilina modelo combinado com etilcelulose sofrer dissolução com água como meio de dissolução.

<table><tbody><tr><td>Paladino 1.064 nm laser</td><td>Coerente</td><td></td><td>Modelo de protótipo não está à venda</td></tr><tr><td>Levante Emerald Oscilador paramétrico óptico</td><td>APE Berlin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IX71 Microscópio</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoview 300 unidade de varredura</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo fotomultiplicador R3896</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Óptica independente / filtros</td><td>Bomba peristáltica Thorlabs e Chroma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reglo</td> Espectrômetro <td>ISMATEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>USB2000+</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fonte de luz DT-MINI-2-GS</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Célula de fluxo em forma de Z FIA-Z-SMA-TEF Ocean</td><td>Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QP400-2-SR-BX fibra óptica</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubulação</td><td></td> de plástico ISMATEC <td></td><td></td></tr><tr><td>CARS célula de fluxo de comprimidos de dissolução</td> Homebuilt na universidade - projetado para conter comprimidos de 12 mm de diâmetro e 3 mm de espessura.<td></td><td></td><td> A célula de fluxo tem uma profundidade de canal de cerca de 0,5 mm.</td></tr><tr><td>Copos de vidro</td><td>VWR</td><td>D108980</td><td></td></tr><tr><td>Teofilina anidra</td><td>BASF</td><td>30058079</td><td></td></tr><tr><td>Etil celulose</td><td>Colorcon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

coerentes anti-stokes raman scattering (cars) microscopia visualiza farmacêuticas comprimidos durante a dissolução

Coherent anti-Stokes Raman Scattering (CARS) Microscopy Visualizes Pharmaceutical Tablets During Dissolution

Os testes tradicionais de dissolução farmacêuticas determinar a quantidade de droga dissolvida ao longo do tempo por medição do teor de droga no meio de dissolução. Este método fornece pouca informação direta sobre o que está acontecendo na superfície do comprimido dissolução. Como a composição da superfície do comprimido e estrutura pode alterar durante a dissolução, é essencial monitorizar durante um ensaio de dissolução. Neste trabalho microscopia espalhamento anti-Stokes Raman coerente é utilizada para a imagem da superfície de comprimidos durante a dissolução, enquanto a espectroscopia de absorção de UV está fornecendo simultaneamente análise em linha de concentração do fármaco dissolvido de comprimidos contendo uma mistura de 50% de teofilina anidra e celulose de etilo. As medições mostraram que, em CARROS situ microscopia é capaz de imagiologia teofilina selectivamente na presença de acetato de celulose. Além disso, a teofilina anidra convertido para mono-hidrato de teofilina durante a dissolução, com choro em forma de agulhaStals crescendo na superfície do tablet durante a dissolução. A conversão de teofilina anidra de mono-hidrato, combinado com menor exposição do fármaco ao meio de dissolução de fluxo resultou em taxas de dissolução diminuiu. Nossos resultados mostram que, em microscopia CARS situ combinada com espectroscopia de absorção de UV em linha é capaz de monitorar farmacêutica dissolução tablet e correlacionando alterações superficiais com as mudanças na taxa de dissolução.

Na análise in situ de dissolução utilizando CARROS microscopia foi realizada em pastilhas (12 mm de diâmetro, de face plana) que contêm uma mistura do modelo de teofilina anidra e celulose de etilo, com água destilada bombeada a 5 mL / min de 50:50, como o meio de dissolução. CARROS imagens (512 x 512 pixels), foram recolhidas todos os 1,12 segundos na frequência vibratória Raman 2.960 centímetros -1 que é selectivo para o conteúdo de teofilina do comprimido para a duração da experiência de dissolução. Figura 2 mostra quadros seleccionados a partir do vídeo de dissolução. No início de dissolução (Figura 2, o tempo de 0 segundos) existem áreas de verde que mostram o conteúdo de teofilina do comprimido e também existem áreas escuras em que existe apenas acetato de celulose presente na superfície do comprimido. Nas áreas escuras na superfície do comprimido, é possível ver o conteúdo fracamente etilcelulose. Isso é porque ele é relatado que cellulo etílicose tem Raman freqüências vibratórias com maxima em torno de 2.930 e 2.975 centímetros -1 14. Após cerca de 60 segundos não parece ser o início de mono-hidrato de teofilina crescimento de cristais na superfície, que pode ser visto na forma de cristais em forma de agulha estreitas crescimento para o exterior a partir de pelo menos um núcleo de cristal no centro do quadro (figura 2, o tempo de 60 seg) . O crescimento de cristais de mono-hidrato pode ser visto mais claramente muito depois de 130 segundos (Figura 2, o tempo de 130 segundos). Além disso, no ponto de tempo de 130 segundos, pode ser visto que o cristal de mono-hidrato de não se espalhou inteiramente através da superfície do comprimido. Parece que a presença das regiões de celulose acetato bloqueou fisicamente o alongamento das agulhas de mono-hidrato. Após 250 segundos, que pode ser visto que a cobertura de mono-hidrato de a superfície não é tão proeminente que sugere que os cristais de mono-hidrato são eles próprios começam a dissolver-se. Figura 2. Quadros de CARS vídeo dissolução. Imagens selecionadas Carros (2960 centímetros -1) a partir de um vídeo de dissolução para uma anidro teofilina com tablet etilcelulose. A imagem 0 seg é gravado em uma área da amostra, enquanto os 60, 130, 250 e seg imagens são gravadas em uma outra área da amostra. O vídeo CARS está disponível como informações suplementares. Barra de escala é de 50 m. Ultra-violeta (UV), espectroscopia é uma forma de espectroscopia de absorção utilizando luz UV como fonte de excitação. Medidas de espectroscopia de UV elétron transições a partir do estado fundamental para um estado animado 15. A teofilina tem um pico largo centrado em torno de 270 nm, enquanto que a etilcelulose é praticamente insolúvel em modo não se espera que o meio de dissolução para contribuir para o espectro de UV gravada. Análise da dissociaçãomeio lução usando a célula de fluxo de UV em forma de z embutido nos permite determinar quantitativamente a quantidade de droga dissolvida durante a dissolução. Figura 3 mostra o perfil de UV-dissolução para a dissolução do anidrato de teofilina com comprimido etilcelulose. O perfil de dissolução de UV (Figura 3) mostra que a dissolução de teofilina anidra começa rapidamente, atingindo uma concentração máxima de cerca de 90 ng / ml dentro de 120 segundos; após este ponto de tempo a taxa de dissolução começa a diminuir. A diminuição da taxa de dissolução pode ser devido à presença do mono-hidrato de teofilina (solubilidade de 6 mg / ml a 25 ° C 16) de cristais sobre a superfície, que são menos solúveis do que a teofilina anidra (solubilidade de 12 mg / ml a 25 ° C 16 ) e claramente visto no vídeo CARROS dissolução (Figura 2), neste ponto de tempo. A taxa de dissolução reduzindo gradualmente também poderia ser parcialmente explicado bya redução na exposição à teofilina para o fluído. Esta redução ocorre porque o acetato de celulose é praticamente insolúvel em água, assim como a teofilina dissolve o acetato de celulose restante impede a exposição teofilina para o meio de dissolução. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51847/51847fig3highres.jpg" width="500"> Perfil de dissolução UV Figura 3.. Concentração versus tempo para uma trama anidrato de teofilina comprimido combinado com a celulose de etilo, mostrando a concentração de teofilina no meio de dissolução durante a experiência de dissolução.

Microscopia de coerência de anti-Stokes Raman (CARS) é combinado com uma instalação de dissolução intrínseca de fluxo para permitir a visualização in situ e em tempo real da superfície de comprimidos farmacêuticos submetidos a dissolução. Usando esta configuração custom-built, é possível correlacionar CARROS vídeos com perfis de dissolução de medicamentos registrados usando espectroscopia de absorção UV embutida.

Coerentes anti-Stokes Raman Scattering (CARS) Microscopia visualiza farmacêuticas Comprimidos durante a dissolução

Traditional pharmaceutical dissolution tests determine the amount of drug dissolved over time by measuring drug content in the dissolution medium. This ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar imagens quimicamente seletivas na superfície de um comprimido submetido à dissolução farmacêutica usando análise de dissolução de carro in situ. Isso é feito primeiro ajustando o sistema de laser do carro para uma frequência seletiva para o produto químico de interesse no comprimido e configurando o espectrômetro de absorção UV para registrar espectros. O segundo passo é colocar um comprimido na célula de fluxo de dissolução do carro e aparafusar bem fechado.Em seguida, a célula de fluxo de dissolução do carro é colocada no estágio do microscópio e a tubulação a conecta à bomba e ao meio de dissolução. A etapa final é gravar simultaneamente o vídeo de dissolução de um carro enquanto bombeia o meio de dissolução e registra os espectros de absorção UV. Em última análise, a análise de dissolução do carro in situ é usada para mostrar que as mudanças na superfície durante a dissolução podem ser visualizadas e correlacionadas com as mudanças na taxa de dissolução.A principal vantagem dessa técnica sobre as técnicas existentes, como os métodos de dissolução da farmacopia, é que a análise de dissolução do carro inicial fornece informações detalhadas sobre a superfície de um comprimido, que pode mudar durante a dissolução. Para começar, ligue o laser do carro e a fonte de luz ultravioleta ou UV da lâmpada de deutério e deixe-o aquecer. Abra o obturador na fonte de luz UV da lâmpada de deutério colocando o interruptor do obturador em aberto.Em seguida, ligue o PC de controle do microscópio e abra o software de controle do microscópio. Ligue o PC do espectrômetro UV e abra o software de controle do espectrômetro. Selecione a objetiva de microscópio desejada.Defina os filtros na torre do conjunto de filtros para transmitir lasers de excitação e refletir o sinal do carro. Coloque os filtros apropriados na frente do detector de tubo multiplicador de fotos para transmitir o sinal do carro e filtrar a luz indesejada. Para teste do sistema, ligue a bomba peristáltica e o meio de dissolução da bomba através da célula de fluxo UV em forma de V por alguns minutos para limpar o líquido anterior da tubulação.Determine a vazão da bomba pesando a quantidade de meio de dissolução bombeada por dois minutos. Ajuste a velocidade da bomba até atingir a vazão desejada. Para medição de dissolução UV no software de controle do espectrômetro UV, clique no menu file.Em seguida, clique em Nova medição de absorbância para abrir uma janela, que lista todos os espectrômetros disponíveis. Clique no espectrômetro UV correto e, em seguida, clique em próximo para abrir uma janela, que exibe os parâmetros de aquisição de dados. Defina o tempo de integração e a média espectral.Clique no botão ao lado para abrir a tela usada para registrar o espectro de referência. Clique no botão que aparece como uma lâmpada amarela para gravar continuamente um meio de dissolução da bomba de espectro de referência. Durante esta medição, feche o obturador da fonte de luz UV da lâmpada de deutério colocando o interruptor como fechado.Clique no botão ao lado para abrir a tela usada para gravar o espectro escuro. Clique no botão que aparece como uma lâmpada cinza para gravar continuamente um meio de dissolução da bomba de espectro escuro. Durante esta medição, clique no botão que diz terminar para iniciar as medições de absorbância UV no software de controle do microscópio do carro, clique no botão que seleciona uma medição XYT.Clique na caixa suspensa e selecione o tamanho da imagem em pixels. Arraste o controle deslizante de velocidade de imagem para a posição rápida, média ou lenta. Clique nas setas rotuladas zoom para ajustar o nível de zoom.Em seguida, clique na caixa suspensa e selecione o objetivo usado. Clique na caixa de entrada e digite a quantidade de quadros necessários para o vídeo de dissolução do carro Usando o oscilador paramétrico óptico ou o controlador OPO, ajuste as configurações do OPO, como temperatura, posição do pazo e posição do filtro LEO, até que a saída máxima do laser na frequência ramen desejada seja atingida. Coloque um comprimido no porta-amostras da célula de fluxo do carro personalizado e aperte bem o porta-amostras.Para evitar vazamentos, conecte a tubulação à célula de fluxo do carro, conectando a célula de fluxo do carro ao béquer que contém o meio de dissolução e a bomba peristáltica. Coloque a célula de fluxo do carro contendo um comprimido no microscópio stage. Verifique se a célula de fluxo do carro está conectada ao béquer do meio de dissolução.A bomba peristáltica, a célula de fluxo UV em forma de V e o copo de coleta de resíduos. Clique no botão de repetição XY para iniciar a varredura do sistema de microscópio em um modo de varredura contínua. Ajuste o foco do microscópio movendo a objetiva até que a superfície do tablet esteja no campo de view na tela do computador de controle do microscópio.Clique no controle deslizante no software de controle do microscópio rotulado PMT. Ajuste a sensibilidade do detector aumentando ou diminuindo a tensão PMT até que uma imagem satisfatória esteja visível na tela. Clique em parar no software de controle do microscópio para interromper a varredura contínua simultaneamente.Comece a bombear o meio de dissolução. Comece a gravar uma única varredura XYT e comece a coletar espectros absorventes de UV. Durante o experimento de dissolução, monitore a gravação de vídeo e ajuste manualmente o foco do microscópio.Para garantir que o tablet esteja continuamente em foco. Pare a bomba peristáltica desligando-a. Clique no menu file e, em seguida, clique em salvar como vídeo no software de controle do microscópio para salvar a varredura XYT como um vídeo no software de controle do espectrômetro, clique no menu file salvar e, em seguida, clique em parar exportação.Para interromper a coleta de espectros de absorção de UV, remova a célula de fluxo do carro do estágio do microscópio e remova o comprimido da célula de fluxo do carro. Como etapa final, lave a célula de fluxo do carro com água e etanol e depois seque com papel de seda. Os quadros selecionados do vídeo de dissolução do carro são mostrados aqui no início da dissolução.Existem áreas verdes mostrando o conteúdo de teofilina do comprimido. As áreas escuras são onde há apenas etilcelulose presente na superfície do comprimido. Após cerca de 60 segundos, o início do crescimento do cristal de monohidrato de teofilina é observado na superfície como cristais estreitos em forma de agulha crescendo para fora de pelo menos um núcleo de cristal no centro do quadro.O crescimento do cristal monohidratado pode ser visto claramente após 130 segundos. Neste momento, o cristal monohidratado não se espalhou totalmente pela superfície do comprimido. A presença das regiões de etilcelulose pode bloquear fisicamente o alongamento das agulhas monohidratadas.Após 250 segundos, pode-se ver que a cobertura monohidratada da superfície não é tão proeminente, sugerindo que os cristais monohidratados estão começando a dissolver o perfil de dissolução UV para a dissolução da teofilina anhy com comprimido de etilcelulose mostra que a dissolução da teofilina anidra atinge rapidamente uma concentração máxima de cerca de 90 microgramas por mililitro em 120 segundos. Após esse período, a taxa de dissolução começa a diminuir. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como realizar a análise de dissolução in situ usando microscopia cos.Essa técnica permite uma melhor compreensão do processo de dissolução, monitorando a superfície de um comprimido de dissolução usando imagens quimicamente seletivas.

coherent-anti-stokes-raman-scattering-cars-microscopy-visualizes

Research

JoVE Journal

Engineering

Engenharia

A combinação de três único comprimento de onda curto lasers pulsados ​​é usado para gerar espalhamento anti-Stokes Raman coerente (CARS) e CARS duplamente ressonante (DR-CARS). A diferença entre estes sinais fornece maior sensibilidade para a outra forma difíceis de detectar sinais Raman coerente, permitindo que imagens de fraca dispersores Raman.

Imagem diferencial de estruturas biológicas com Duplamente-ressonante Scattering Anti-Stokes Raman coerente (CARS)

Fonte: Zhang, M. et al., Teste Rápido de Suscetibilidade Antimicrobiana por Imagem de Espalhamento Raman Estimulado da Incorporação de Deutério em uma única Bactéria. J. Vis. Experiência (2022)Este vídeo demonstra a aplicação da microscopia de espalhamento Raman estimulado para avaliar a suscetibilidade a antibióticos, acompanhando a atividade metabólica marcada com deutério. Ao monitorar sinais de carbono-deutério, o método permite a rápida detecção de populações bacterianas resistentes e...

Detecção da suscetibilidade a antibióticos bacterianos usando um microscópio de espalhamento Raman estimulado

Fonte: McCullagh, E. A., et al. Aplicação de Espectroscopia Raman Anti-Stokes Coerente (CARS) para mielinização de imagem em fatias de cérebro. J. Vis. Exp. (2022)O vídeo demonstra imagens de fluorescência e espectroscopia Raman anti-Stokes coerente (CARS) para visualizar a arquitetura neuronal no tecido cerebral de roedores. A coloração de Nissl marca os corpos celulares ligando-se ao RNA ribossômico, enquanto a imagem CARS tem como alvo a mielina rica em lipídios por meio de sinais induzidos...

Espectroscopia Raman anti-Stokes coerente para visualizar neurônios mielinizados no tecido cerebral de camundongos

Coherent dispersão anti-Stokes Raman (CARS) Microscopia baseado em vibração inerente de títulos molécula permite imagens de células vivas quimicamente seletiva sem rótulo. Este trabalho apresenta a implementação de uma técnica de microscopia complementar sobre um microscópio de varredura a laser padrão multiphoton baseado em um Ti femtosecond: laser de safira e um laser OPO.

Implementação de um sistema coerente Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) em Ti: Safira e OPO Laser Based Laser Standard Scanning Microscope

A microscopia de dispersão de Raman estimulada (SRS) permite imagens seletivas e livres de rótulos de moieties químicos específicos e tem sido efetivamente empregada para imagens de moléculas lipídicas in vivo. Aqui, fornecemos uma breve introdução ao princípio da microscopia SRS e descrevemos métodos para seu uso no armazenamento lipídeto de imagem em Caenorhabditis elegans.

Imagem livre de rótulos da Dinâmica de Armazenamento Lipídido em Elegans caenorhabditis usando microscopia de dispersão raman estimulada

Este protocolo apresenta ensaio rápido de suscetibilidade antimicrobiana (AST) em até 2,5 h por imagem de espalhamento Raman estimulado por célula única do metabolismo de D2O. Este método aplica-se a bactérias no ambiente urinário ou no sangue total, o que é transformador para AST fenotípica de célula única rápida na clínica.

Teste Rápido de Suscetibilidade a Antimicrobianos por Imagem de Dispersão Raman Estimulada da Incorporação de Deutério em uma Única Bactéria

Uma metodologia coerente de imagem de dispersão raman para visualizar e quantificar compostos farmacêuticos dentro da pele é descrita. Este artigo descreve a preparação do tecido da pele (humano e camundongo) e a aplicação da formulação tópica, aquisição de imagens para quantificar perfis de concentração esposteis e análises farmacocinéticas preliminares para avaliar a entrega de medicamentos tópicos.

Visualizando e quantificando compostos farmacêuticos dentro da pele usando imagens coerentes de dispersão de Raman

Este artigo compara diretamente os contrastes de resolução, sensibilidade e imagem da dispersão estimulada de Raman (SRS) e da dispersão coerente anti-Stokes Raman (CARS) integrada à mesma plataforma de microscópio. Os resultados mostram que o CARS tem uma melhor resolução espacial, o SRS dá melhores contrastes e resolução espectral, e ambos os métodos têm sensibilidade semelhante.

Comparação direta da dispersão de Raman estimulada hiperespectral e microscopia de dispersão de Raman coerente para imagem química

Apresentamos um protocolo para adquirir imagens químicas com microscopia de dispersão Raman estimulada por banda larga (SRS). Baseado em um microscópio SRS que opera com detecção diferencial de bloqueio multicanal, o protocolo descreve a preparação da amostra, o ajuste do aparelho SRS e a quimiometria para desembaraçar diferentes constituintes de amostras quimicamente heterogêneas.

Multiplex Imagem química baseada em banda larga estimulada raman dispersão microscopia

Visualizar a mielinização é um objetivo importante para muitos pesquisadores que estudam o sistema nervoso. CARS é uma técnica compatível com a imunofluorescência que pode fotografar nativamente lipídios dentro do tecido, como o cérebro, iluminando estruturas especializadas, como a mielina.

Aplicação coerente de espectroscopia Raman anti-Stokes (CARS) para mielinização por imagem em fatias cerebrais

Aprenda a usar microscopia CARS para visualizar a dissolução de comprimidos farmacêuticos em tempo real. Este método combina imagem quimicamente seletiva com espectroscopia UV para correlacionar mudanças superficiais com taxas de dissolução.

Coerentes anti-Stokes Raman Scattering (CARS) Microscopia visualiza farmacêuticas Comprimidos durante a dissolução

Explorar mais vídeos