Combinando Sorting magnética de células mãe e testes de flutuação para Analisar Genoma Instabilidade Durante Mitotic envelhecimento celular em Saccharomyces cerevisiae

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar se as mudanças nas frequências de mutação com o aumento da replicação. A idade das células de levedura se deve simplesmente a rodadas adicionais de divisão celular ou a mudanças específicas da idade nas taxas de mutações acumuladas. Isso é obtido medindo primeiro as frequências e taxas de mutação em células jovens, espalhando as células em meios seletivos e não seletivos para calcular uma frequência de mutação prevista para células de idades crescentes devido ao acúmulo de mutações a cada rodada de divisão celular.

Em seguida, uma população de células de levedura é marcada com biotina cultivada em cultura líquida e as células marcadas originais são recuperadas por classificação magnética para obter células-mãe envelhecidas que sofreram várias divisões celulares. Em seguida, as células-mãe envelhecidas são regeneradas para aumentar sua idade e, em seguida, classificadas novamente ou coradas para cicatrizes de nádegas e, em seguida, espalhadas em meios seletivos e não seletivos, a fim de determinar sua idade replicativa média e resultados de frequência de mutação são obtidos que mostram se há algum aumento ou diminuição específico da idade no acúmulo de mutações com base em uma comparação da frequência de mutação observada experimentalmente com a frequência de mutação prevista para células do idade média observada. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do envelhecimento, como mudanças nas taxas de acúmulo de danos genéticos contribuem para o envelhecimento normal ou se a expectativa de vida altera os efeitos de vários fatores genéticos e ambientais, em parte devido a mudanças nas taxas de mutação.

Demonstrando o procedimento estará Melissa Patterson, uma estudante de pós-graduação em meu laboratório, para estabelecer uma taxa de mutação de linha de base por geração de células usando testes de flutuação para células cultivadas em condições de cultura padrão. Para cada cultura replicada, dilua as células de um a 2000 e espalhe de um a quatro microlitros em meio não seletivo para determinar as unidades formadoras de colônias por mililitro. Pulverize as células restantes a 2.400 Gs por um minuto em uma microcentrífuga e use 100 microlitros de água para ressuspendê-las antes de espalhar em meio seletivo para identificar mutantes.

Depois de incubar as placas a 30 graus Celsius por três dias, conte as colônias, determine a taxa e a frequência de mutação inicial de acordo com o protocolo de texto que acompanha para rotular o CCI charmy com biotina Comece listrando a cultura de um estoque de glicerol em meio YPD e incube a 30 graus Celsius por um a três dias. Usando uma ponta de pipeta estéril, transfira as células da placa para pelo menos um mililitro de água. Tendo em mente que um a um centímetro e meio de uma porção densamente crescida da faixa dará aproximadamente 10 para as oito células.

Use um hemocitômetro para determinar a densidade celular exata para cada cepa ou condição de tratamento. Use um estoque de reagente de biotina de cinco milimolares para rotular de 10 a oito células por ponto de coleta de acordo com o procedimento padrão do fabricante. Execute todas as etapas de centrifugação por cinco minutos a quatro graus Celsius após a lavagem final.

Use água para suspender as células marcadas a uma concentração final de 10 a oito células por mililitro para verificar a viabilidade celular para diluir 10 microlitros de células com 23 microlitros de água e 67 microlitros de 0,4% Triam blue em um XPBS incube as células por 40 minutos em temperatura ambiente antes de usar um hemocitômetro para pontuar células vivas ou não coradas e mortas ou coradas. Depois de medir os valores basais para a idade celular e a frequência de mutação, de acordo com o protocolo de texto, transfira as células marcadas com biotina para 20 mililitros de meio YPD. Finja as oito células.

Cultive as culturas por 16 a 18 horas a 20 graus Celsius a cerca de 10 a oito células por mililitro. Não permita que as células atinjam a fase estacionária e, se necessário, mantenha as células a quatro graus Celsius por várias horas para otimizar o tempo do período de crescimento e coleta. Depois de determinar a densidade celular e peletizar as células a quatro graus Celsius, lave as células adicionando 30 mililitros de rotulagem de contas, tampão e vórtice, gire a suspensão e despeje o sobrenadante.

Após uma segunda lavagem, suspendemos as células em 50 microlitros de tampão de rotulagem de contas. Finja para as oito células totais por vórtice. Adicione dois microlitros de contas magnéticas, finja as oito células totais e, após o vórtice, incube brevemente no gelo por 10 minutos, invertendo periodicamente.

Em seguida, use 30 mililitros de tampão de rotulagem de contas para lavar as células três vezes. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de tampão de rotulagem de contas. Finja para o total de oito células e subtraia brevemente o pellet em uma configuração média apenas até que as células sejam ressuspensas.

Despeje a suspensão através de um filtro de células de 40 mícrons em um tubo de 50 mililitros para remover quaisquer aglomerados de células restantes. Se necessário, deixe as células no gelo por uma a duas horas antes de carregar na coluna. Siga o protocolo recomendado pelo fabricante para as colunas magnéticas usando até duas vezes 10 elevado ao total de nove células por.

Tome cuidado para remover qualquer airable ao carregar as colunas e remova e recoloque a coluna no separador entre as lavagens para evitar que as células fiquem presas entre os grânulos. Ao usar separadores de várias colunas para processar várias colunas da mesma amostra, eluia-as todas no mesmo tubo de coleta para reduzir o tempo de manuseio e diminuir a perda de células, se desejar. Salve o fluxo das etapas de ligação e lavagem para analisar as células jovens produzidas pelas células-mãe após concentrar as células por centrifugação a 3000 Gs por cinco minutos a quatro graus Celsius, aspirar todos, exceto um mililitro de tampão.

Finja as oito células originais marcadas com biotina. Em seguida, vórtice brevemente para suspender as células no tampão restante. Use azul triam para corar uma alíquota de células diluídas e use um hemocitômetro para determinar a densidade e a viabilidade celular.

Em seguida, calcule o número total de células recuperadas. Se o número de células for substancialmente maior do que o esperado, passe a amostra de eluição por outra coluna para tentar remover as células jovens contaminantes. Se o número de células for substancialmente menor do que o esperado, passe o fluxo salvo.

Faça uma amostra em outra coluna para tentar melhorar o rendimento das células-mãe, se desejar. Regenere as células para aumentar a idade replicativa e siga a rotulagem e classificação do grânulo sem a rotulagem da biotina. Para determinar a idade replicativa, transfira 25 microlitros de células recuperadas para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e use um mililitro de um XPBS para lavar as células duas vezes para rotular cicatrizes de botões na superfície das células.

Use 180 microlitros de um XPBS e 20 microlitros de WGA conjugado com fluorescência para ressuspender as células, cubra o tubo de centrífuga de 1,5 mililitro com papel alumínio e incube com balanço suave a 30 graus Celsius por 30 minutos após a incubação. Use um XPBS para lavar as células três vezes. Em seguida, para microscopia fluorescente, use um reagente Antifa para montar as células em lâminas para evitar o movimento celular durante a imagem.

Catalise totalmente as lâminas no escuro por até alguns dias. Conte as cicatrizes dos botões em pelo menos 50 células por amostra para obter uma medida representativa da idade celular. Alternativamente, depois de suspender as células em um XPBS, realize citometria de fluxo usando as configurações descritas no protocolo de texto grafar cicatrizes de botões em células jovens e células de idade contadas por microscopia no eixo Y contra a média geométrica normalizada da fluorescência conjugada WGA das mesmas populações de células no eixo x.

Finalmente, obtenha a equação de uma linha de tendência linear para esta relação Para substituto subsequente, a média geométrica normalizada da intensidade de fluorescência conjugada WGA de uma população de células para X na equação e resolva para Y para determinar a idade celular média de uma amostra. Este gráfico ilustra que a taxa de mutação no gene can one foi semelhante antes e depois da marcação de biotina Em populações de leveduras jovens independentes, as frequências de mutação também foram semelhantes em células jovens antes e depois da marcação de biotina quando cultivadas a 20 graus Celsius ou 30 graus Celsius. O gráfico mostrado aqui demonstra o que pode ser observado ao contar as células recuperadas após a marcação e classificação da biotina de células não tratadas ou células tratadas com um peróxido de hidrogênio milimolar após a primeira classificação.

O número de células pode parecer maior do que o esperado após a primeira classificação, e uma pequena perda progressiva de células é esperada com a classificação contínua. A idade replicativa foi determinada pela contagem manual de cicatrizes marcadas com fluorescência, mas nas células, como demonstrado aqui, como visto nesta figura. O sinal fluorescente, mas cicatricial, da citometria de fluxo foi comparado às contagens manuais para obter uma relação linear que permite que a idade replicativa da mãe e das populações de células controle seja determinada por citometria de fluxo.

Esses gráficos mostram exemplos de frequências de mutação observadas semelhantes ou elevadas de células-mãe envelhecidas em comparação com as frequências previstas calculadas a partir da idade média das células-mãe e das frequências e taxas de mutação obtidas para populações de células jovens. Dependendo da localização genômica do pode um gene Após este procedimento. Outros métodos podem ser usados, como coloração para espécies reativas de oxigênio ou morfologia ular, para responder a perguntas adicionais, como quais mudanças na fisiologia celular estão associadas a mudanças relacionadas à idade no acúmulo de mutações.