Name: Neurônios olfativos obtida através Nasal Biópsia Combinada com Laser-Capture Microdissection: Uma Abordagem Potencial para tratamento estudo Response em Transtornos Mentais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Aprenda a isolar neurônios olfativos por biópsia nasal combinada com microdisseção a laser para estudar resposta ao tratamento em transtorno bipolar. Este método permite análise de expressão gênica em populações neuronais enriquecidas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado por subsídios do USPHS MH-091460 (E.N.), MH-084018 (A.S.), MH-094268 Silvo O. Conte center (A.S.), MH-069853 (A.S.), MH-085226 (A.S.), MH-088753 (A.S.), MH-092443 (A.S.) e MH-096208 (K.I.), subsídios da DANA (E.N.), Stanley (A.S.), RUSK (A.S.), S-R foundations (A.S.), NARSAD (A.S. e K.I.), e Fundo de Pesquisa de Células-Tronco de Maryland (AS e KI).
Agradecemos sinceramente os esforços e contribuições de Pearl Kim, Maria Papapavlou, Nao Gamo, Youjin Chung, Yukiko Lema e Mark Christie para a coordenação do processo de biópsia.

NOTA: Todos os voluntários da pesquisa neste estudo foram administrados documentos de consentimento aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Howard e Johns Hopkins University. Somente os participantes que consentiram ao assinar os documentos de consentimento informado foram incluídos no estudo. A base de estudo para esta análise foram: 20 indivíduos (12 BD e 10 controles, 30% do sexo masculino) e idade (DP) de 38,2 (14,1) anos significam. NOTA: Spray de todas as superfícies com RNase Zap para eliminar a contaminação RNase de superfícies de vidro e plástico. 1. Biópsia Procedimento <ol><li> Pulverize tópica lidocaína (xilocaína) líquido 4% e oximetazolina HCl 0,05% na cavidade nasal do participante do estudo e permitir que 15 minutos de tempo de entorpecente. </li><li> Mergulhe cotonóides cirúrgicos ½ x 3 polegadas em uma mistura de lidocaína e oxymetazoline e inserir na cavidade nasal ao longo da parte superior do septo nasal e deixe descansar por 15 min. </li><li> Usando um 30 ° rígidaendoscópio nasal para localizar a seção superior da cavidade nasal, remover mucosa nasal, utilizando-se de roer forceps nasais a partir da porção superior do septo nasal, tendo várias pequenas amostras. </li></ol> 2. Preparação de blocos de tecidos <ol><li> Imediatamente antes da biópsia, preencher cryomolds tamanho padrão com tecido congelamento médio. </li><li> Com uma pinça autoclavado, montar tecido fresco no meio de congelamento e congelar em gelo seco. Preencha restante cryoblock com o meio de congelamento, congelar cryoblock em gelo seco, e armazenar blocos a -80ºC. </li></ol> 3. cryosectioning <ol><li> Prepare o naftalato de polietileno (PEN) lâminas de vidro imediatamente antes da membrana cryosectioning. Spray de slides com solução RNase Zap por 5 min. Em seguida, lavar as lâminas em dietilpirocarbonato (DEPC) de água e deixe secar por 30 min. Ative lâminas secas sob luz UV por 30 minutos. </li><li> Cada criocorte bloquear completamente a 30 um. Mantenha lâminas sobre i secaCE e cortes congelados, tanto quanto possível. Loja slides em -80 ºC após a conclusão. </li></ol> 4. Laser-Capture Microdissection <ol><li> Comece por desidratação lâminas imediatamente antes microdissection. Vamos lâminas congeladas descongelar por 10 s, e em seguida, aplique a seguinte série de etanol para cada slide: 60% (2 ml, 15 segundos), 80% (2 ml, 15 segundos), 95% (3 ml, 25 seg), 100 % (7 ml, 60 seg). </li><li> Vire microscopia localização fotoactivado (PALM) microscópio e definido para as seguintes condições: Para aumento de 10x definir a energia para 82, o foco para 74, e velocidade para 25 - 30. Para ampliação de 20x, defina a energia para 63, o foco para 67, e velocidade de 5 - 6. Ajustar conforme necessário para se obter resultados óptimos de corte. </li><li> Visualmente identificar neurônios utilizando 20X ou 10X de ampliação. Distinguir a superfície fina camada subjacente neurónio olfactivo de sub-mucosa sob um microscópio sem o uso do procedimento de coloração. Observe neurônios como um aspecto colunar densa 18.</li><li> Usando a função Pencil no microscópio acima mencionado na etapa 4.2, contorne a camada neuronal. Traçar um pouco longe de neurônios para evitar a queima de neurônios de laser. Isto é essencial para a obtenção de RNA de alta qualidade. Em seguida, inicie o corte a laser guiada. </li><li> Pegue seções dissecadas usando uma pinça de ponta fina microdissecção e colocar o tecido em um microtubo contendo 100 mL de tampão de lise em gelo. Repita o procedimento para todas as seções neuronais obtidos a partir de uma única amostra. Tempo de dissecção total por amostra não deve ultrapassar 50 min. </li><li> Uma vez que a dissecção é completas, imediatamente lisados ​​amostra de vórtice e manter em gelo seco. Armazene as amostras a -80ºC para isolamento do RNA total. </li></ol> 5. Isolamento de ARN total e análise de controle de qualidade <ol><li> Lisados ​​amostra Descongele no gelo. Realizar isolamento total RNA com RNAqueous Micro Kit com DNase-I inativação, seguindo o protocolo do fabricante, sem modificações (veja &lt;forte&gt; Figura 1). O volume total de eluição é de aproximadamente 20 l. </li><li> Medir a concentração de RNA e avaliar a qualidade do RNA com RNA Integrity Number (RIN) usando Bioanalyzer. As amostras que atendem aos critérios de controle de qualidade na Figura 2 pode ser usado para a síntese de cDNA. </li></ol> 6. Síntese de ADNc <ol><li> Sintetizar cDNA utilizando um kit comercial validado (ver Tabela de Reagentes). Realizar o passo de recozimento através da combinação de 0,1-1,0 ng de ARN (dependendo da disponibilidade) e RNase isenta de água para um volume total de 8 ul por tubo. Em seguida, adicionar 1 ml de oligo d (T) 20 e iniciador 1 ul de 10 mM de dNTP mix por tubo, para um volume total de 10 ul. </li><li> Delicadamente amostras de vórtice e centrifugação e amostras de recozimento a 65 ° C por 5 min. Depois da reacção estar completa, as amostras frescas imediatamente em gelo. </li><li> Preparar a solução de mistura principal de acordo com as especificações da Tabela 1. Em seguida, adicione 9,5 μmistura l mestre e 0,5 ul de preparados comercialmente transcriptase reversa (TR) para cada tubo. Adicionar 0,5 mL de água livre de RNase para controlar tubo em vez de RT. </li><li> Executar uma reacção de RT com a primeira incubação a 50 ºC durante 50 min, em seguida 85 ° C durante 5 min e uma retenção finais 4 ° C, sem ciclagem. </li><li> Diluir todas as amostras de 5x com água e alíquota. Armazene as amostras a -80 ºC. </li></ol> 7. PCR em Tempo Real - Confirme Neuronal Enriquecimento <ol><li> Preparar a solução de mistura principal de acordo com as especificações da Tabela 2. Use um controle interno, como GAPDH. Compare expressão olfativa proteína marcadora (OMP) no tecido microdissecados com expressão OMP no tecido não dissecado para determinar enriquecimento neuronal. NOTA: OMP é um marcador de neurônios olfativos. OMP sequência: para a frente, 5&#39;-CTGTCGGACCTGGCCAAG-3 &#39; reverso, 5&#39;-CACCCTCGCCAAAGGTGA-3 &#39; Seqüência GAPDH: para a frente, 5&#39;-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 &#39; reverso, 5&#39;-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3 &#39;. </li><li> Configurar placa PCR adicionando 7 l de mistura principal em cada poço e 3 l de cDNA. </li><li> Placa Centrifugar durante 5 minutos a 300 xg (1300 rpm). Reação Run real Time-PCR utilizando as condições de ciclos térmicos padrão especificado para Supermix comercial tal como SYBR Greener qPCR. </li><li> Analisar dados (ver Figura 2 para as especificações). </li></ol> 8. PCR em Tempo Real - Expressão de genes de interesse <ol><li> Realizar em amostras que mostram o enriquecimento neuronal de 2 vezes ou mais. </li><li> Prepare mix mestre em gelo para cada sonda (sonda marcada com FAM de interesse e VIC marcado GAPDH) em tubos separados de acordo com as especificações da Tabela 3. </li><li> Configurar uma placa de PCR com mix mestre 8 mL em cada poço e 2 l de cDNA. </li><li> Centrifugar a placa durante 5 minutos a 300 xg (1300 rpm). Execute reação real Time-PCR usando o defcondições de ciclos térmicos ault conforme o protocolo de mistura principal expressão do gene fornecido pelo fabricante. Analisar os resultados de expressão (veja a Figura 2 para obter as especificações). </li></ol>

<ol><li>Goodwin, F. K., Jamison, K. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoodwin%2C+FK+%22Manic-depressive+illness%22">Manic-depressive illness</a>. , Oxford University Press. (1990).</li>
<li>Einat, H., Manji, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+plasticity+cascades%3A+genes-to-behavior+pathways+in+animal+models+of+bipolar+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cellular plasticity cascades: genes-to-behavior pathways in animal models of bipolar disorder.</a> Biol Psychiatry. 59 (12), 1160-1171 (2006).</li>
<li>Severino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacogenomics+of+bipolar+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics%22%5BJournal%5D)">Pharmacogenomics of bipolar disorder.</a> Pharmacogenomics. 14 (6), 655-674 (2013).</li>
<li>Beech, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-expression+differences+in+peripheral+blood+between+lithium+responders+and+non-responders+in+the+Lithium+Treatment-Moderate+dose+Use+Study+%28LiTMUS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics+J%22%5BJournal%5D)">Gene-expression differences in peripheral blood between lithium responders and non-responders in the Lithium Treatment-Moderate dose Use Study (LiTMUS).</a> Pharmacogenomics J. 14 (2), 182-191 (2013).</li>
<li>Horiuchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+cells+via+nasal+biopsy+reflect+the+developing+brain+in+gene+expression+profiles%3A+utility+and+limitation+of+the+surrogate+tissues+in+research+for+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Olfactory cells via nasal biopsy reflect the developing brain in gene expression profiles: utility and limitation of the surrogate tissues in research for brain disorders.</a> Neurosci Res. 77 (4), 247-250 (2013).</li>
<li>Dryer, L., Graziadei, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+the+olfactory+bulb+in+an+elasmobranch+fish%2C+Sphyrna+tiburo%3A+segregation+of+inputs+in+the+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol+%28Berl%22%5BJournal%5D)">Projections of the olfactory bulb in an elasmobranch fish, Sphyrna tiburo: segregation of inputs in the telencephalon.</a> Anat Embryol (Berl. 190 (6), 563-572 (1994).</li>
<li>Hahn, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+neurogenesis+in+human+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro neurogenesis in human olfactory epithelium.</a> J Comp Neurol. 483 (2), 154-163 (2005).</li>
<li>Cascella, N. G., Takaki, M., Lin, S., Sawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+involvement+in+schizophrenia%3A+the+olfactory+epithelium+as+an+alternative+model+for+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental involvement in schizophrenia: the olfactory epithelium as an alternative model for research.</a> J Neurochem. 102 (3), 587-594 (2007).</li>
<li>Sawa, A., Cascella, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+olfactory+system+for+clinical+and+basic+psychiatry%3A+a+promising+entry+point+to+the+mystery+of+brain+mechanism+and+biomarker+identification+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Peripheral olfactory system for clinical and basic psychiatry: a promising entry point to the mystery of brain mechanism and biomarker identification in schizophrenia.</a> Am J Psychiatry. 166 (2), 137-139 (2009).</li>
<li>Mor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-382+expression+is+elevated+in+the+olfactory+neuroepithelium+of+schizophrenia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-382 expression is elevated in the olfactory neuroepithelium of schizophrenia patients.</a> Neurobiol Dis. 55, 1-10 (2013).</li>
<li>Kano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiling+of+multiple+histone+methylations+in+olfactory+cells%3A+further+implications+for+cellular+susceptibility+to+oxidative+stress+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiling of multiple histone methylations in olfactory cells: further implications for cellular susceptibility to oxidative stress in schizophrenia.</a> Mol Psychiatry. 18 (7), 740-742 (2013).</li>
<li>Toritsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficits+in+microRNA-mediated+Cxcr4%2FCxcl12+signaling+in+neurodevelopmental+deficits+in+a+22q11+deletion+syndrome+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Deficits in microRNA-mediated Cxcr4/Cxcl12 signaling in neurodevelopmental deficits in a 22q11 deletion syndrome mouse model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17552-17557 (2013).</li>
<li>Evgrafov, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+neuroepithelium-derived+neural+progenitor+cells+as+a+model+system+for+investigating+the+molecular+mechanisms+of+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Psychiatr+Genet%22%5BJournal%5D)">Olfactory neuroepithelium-derived neural progenitor cells as a model system for investigating the molecular mechanisms of neuropsychiatric disorders.</a> Psychiatr Genet. 21 (5), 217-228 (2011).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+dynamics+are+altered+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion dynamics are altered in schizophrenia.</a> Biol Psychiatry. 74 (6), 418-426 (2013).</li>
<li>Ishizuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+symptoms+of+schizophrenia+correlate+with+impairment+on+the+University+of+Pennsylvania+smell+identification+test%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Negative symptoms of schizophrenia correlate with impairment on the University of Pennsylvania smell identification test.</a> Neurosci Res. 66, 106-110 (2010).</li>
<li>Sattler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+nasal+olfactory+epithelium+as+a+dynamic+marker+for+CNS+therapy+development%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Human nasal olfactory epithelium as a dynamic marker for CNS therapy development.</a> Exp Neurol. 232 (2), 203-211 (2011).</li>
<li>Rimbault, M., Robin, S., Vaysse, A., Galibert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+profiles+of+rat+olfactory+epithelia%3A+individual+and+age+related+variations%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">RNA profiles of rat olfactory epithelia: individual and age related variations.</a> BMC Genomics. 10, 572(2009).</li>
<li>Tajinda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+biomarkers+from+patients+with+mental+illnesses%3A+a+novel+method+through+nasal+biopsy+combined+with+laser-captured+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Neuronal biomarkers from patients with mental illnesses: a novel method through nasal biopsy combined with laser-captured microdissection.</a> Mol Psychiatry. 15 (3), 231-232 (2010).</li>
<li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+molecular+analysis+of+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).</li>
<li>Fink, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantitative+RT-PCR+after+laser-assisted+cell+picking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time quantitative RT-PCR after laser-assisted cell picking.</a> Nat Med. 4 (11), 1329-1333 (1998).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li>
<li>Nurnberger, J. I. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+interview+for+genetic+studies.+Rationale%2C+unique+features%2C+and+training%5BTitle%5D)+AND+%22NIMH+Genetics+Initiative.+Arch+Gen+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Diagnostic interview for genetic studies. Rationale, unique features, and training.</a> NIMH Genetics Initiative. Arch Gen Psychiatry. 51 (11), 849-859 (1994).</li>
<li>Montgomery, S. A., Asberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+depression+scale+designed+to+be+sensitive+to+change%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">A new depression scale designed to be sensitive to change.</a> Br J Psychiatry. 134, 382-389 (1979).</li>
<li>Young, R. C., Biggs, J. T., Ziegler, V. E., Meyer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rating+scale+for+mania%3A+reliability%2C+validity+and+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">A rating scale for mania: reliability, validity and sensitivity.</a> Br J Psychiatry. 133, 429-435 (1978).</li>
</ol>

Os autores relatam relações financeiras com interesses comerciais.

Uma nova plataforma para a obtenção de camadas de neurônios olfativos enriquecidos pela combinação de biópsia nasal e LCM é apresentado e foi validado neste estudo. Esta técnica pode ter grandes implicações. Ele pode ser aplicado para os estudos de biomarcadores, incluindo aqueles para a resposta ao tratamento, e os esforços de descoberta de medicamentos para outras doenças neuropsiquiátricas, fazendo um impacto mais amplo no campo. Para obter neurônios de alta qualidade passíveis de aplicaç...

O transtorno bipolar (TB) é uma doença neuropsiquiátrica grave, caracterizada por alterações patológicas do humor, conduzir e cognição 1. Lítio utilizada para o tratamento de BD tem sido mostrado para alterar os níveis de mRNA de estado estacionário de um grande número de genes em estudos com animais 2, mas continua a ser desconhecida, se qualquer destas moléculas está associada com a resposta clínica em seres humanos 2. Compreender o mecanismo de resposta de lítio exigiria investigar alterações moleculares induzidas por lítio em tecidos neuronais. Infelizmente, não é prático para a obtenção de biópsias do cérebro de pacientes com TB pré e pós-terapia de lítio para identificar assinaturas moleculares de resposta de lítio. Tecidos cerebrais pós-morte foram usados ​​para estudar biomarcadores em BD, no entanto, eles não podem ser usados ​​para avaliar marcadores moleculares associados com mudanças dinâmicas na emoções, cognição e dirigir; e a validade do retrospectivamente apurado resposta ao tratamento de lítio pode ser problemático 4. Os linfócitos e outras células do sangue pode ser útil, mas as mudanças moleculares nas células do sangue podem não refletir alterações neuronal 3-5. O líquido cefalorraquidiano pode ser insuficiente para obter informações sobre as moléculas intracelulares que podem refletir mudanças intrínsecas associados à doença e medicação reversível. O epitélio olfatório (OE) é uma parte única do sistema nervoso central (SNC), relacionada com a embryologically de estruturas límbicas 6; e é facilmente acessível através de biópsias nasais. É constituída por glial-células como células de suporte (ou seja, sustentaculares), basais em proliferação e neurónios dos receptores olfactivos em diferentes fases de desenvolvimento 7-9. Portanto, OE oferece uma oportunidade única para estudar acessível mudanças dinâmicas no SNC de pacientes com doenças neuropsiquiátricas 7. Estudos demonstram a utilidade do OE como um substituto do tecido para investigar acontecimentos de doença associados que reflectem aquelas occurring nos neurônios do cérebro 8,9. Por exemplo, estudos têm utilizado OE para investigar os perfis moleculares associados com condições psiquiátricas 10-14. Olfactiva sistema também serve para identificar endophenoytpes clínicos, tais como défices cheiro que estão associados com sintomas negativos da esquizofrenia 15. Além disso, os processos de desenvolvimento neurológico continuar no OE ao longo da vida, fornecendo um caminho útil para modelar a fisiopatologia subjacente de condições psiquiátricas 8,9. No entanto, uma desvantagem da utilização deste tecido é a contaminação substancial de biópsias olfactivos com células não-neuronais 16. Por exemplo, o RNA total usado para estudos de expressão de genes em estudos anteriores OE continha RNA extraído de todo o tecido biopsiado nasal incluindo ARN a partir de células não-neuronais 17. Portanto, abordagens anteriores têm sido limitados pela qualidade das células. Para superar esse problema, uma nova abordagem para obter<html> populações de células neuronais enriquecido por combinando biópsias nasais com captura a laser microdissection (LCM) foi desenvolvido 18. LCM é uma técnica que permite o isolamento selectivo de células usando corte por laser combinado com UV de infra-vermelho do laser 19-21. Combinando LCM com OE abordagem minimiza a contaminação substancial de OE por células não-neuronais, aumentando assim o enriquecimento de células neuronais 18. Além disso, a camada neuronal pode ser distinguida a partir da submucosa, sob um microscópio, eliminando assim a necessidade de coloração. Tipos de células neuronais pode ainda ser distinguida de outras populações de células, utilizando anticorpos primários que são expressas pelo tipo celular de interesse 7. Por conseguinte, este procedimento estabelece um método mais fácil para o enriquecimento da população de células quase puramente neuronal que pode ser utilizada para estudos de expressão de genes, imuno-histoquímica e outras investigações morfológicas. ve_content &quot;&gt; Este estudo visa estabelecer uma plataforma experimental para investigar as alterações moleculares em neurônios olfativos associadas a estados de doença e resposta ao tratamento. Para resolver isso, um pequeno grupo de pacientes não-fumantes, que preencheram os critérios diagnósticos do DSM-IV para BD baseado em Entrevista Diagnóstica para Estudos Genéticos (DIG) 22 foi recrutado para passar por duas biópsias nasais: uma biópsia pré-tratamento com lítio e a segunda biópsia, após 6 semanas de tratamento com lítio oral diária Além disso, os pacientes com TB elegíveis devem ser:. sintomático para a depressão , com base na pontuação ≥10 de 60 em o clínico administrado Montgomery-Asberg Rating Scale (MADRS) 23; sintomática de hipomania ou mania, baseado em uma pontuação ≥10 de 56 sobre o clínico administrado Young-Mania Rating Scale (YMRS) 24;. ≥10 ou em ambos MADRS e YMRS coeficiente Rater-Inter-Rater de acordo entre os clínicos para ambas as escalas é&gt; 0,96 Depois de biópsias, os neurônios foram enri.ched do OE por LCM. Na sequência das medidas adicionais de controle de qualidade, para garantir a extração de RNA de alta qualidade a partir do tecido e enriquecimento neuronal, Tempo real RT PCR foi realizado para investigar os níveis pré e pós-tratamento de expressão de genes de interesse. As seções seguintes, conter uma descrição da validação desta abordagem, com destaque para a otimização do protocolo e as estratégias que foram aplicadas para o protocolo de resolução de problemas.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Preparação de Tecido</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Moldes Cryomold</td><td>Sakura Finetek</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Composto</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cryosectioning</td></tr><tr><td>Membrane Slide 1.0 PEN (D)</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>415190-9041-000</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Zap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>DEPC Qualidade da Água Tratada</td><td>Biológica</td><td>351-068-131</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microdissecação</td></tr><tr><td>Microscópio: Sistema MicroLaser da Série PALM</td><td>Modelo de Microscopia</td><td></td> Carl Zeiss<td>: Axiovert 200M 
Software: Robo v3.2</td></tr><tr><td>No. 5 Dumont Microdissction Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-49085</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">RNA Extraction</td></tr><tr><td>RNAqueous Micro Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">cDNA Synthesis</td></tr><tr><td>SuperScript III First Strand Synthesis Kit</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">OMP qPCR</td></tr><tr><td>SYBR GreenER qPCR SuperMix</td><td>Invitrogen</td><td>11760-500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Taqman qPCR</td></tr><tr><td>TaqMan Sondas de Ensaio de Expressão</td><td>Applied Biosystems</td><td>Vários</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Expressão Gênica Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4369016</td><td></td></tr></tbody></table>

neurônios olfativos obtida através nasal biópsia combinada com laser-capture microdissection: uma abordagem potencial para tratamento estudo response em transtornos mentais

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

O transtorno bipolar (TB) é uma doença neuropsiquiátrica grave com fisiopatologia mal compreendido e, normalmente tratados com o estabilizador de humor, carbonato de lítio. Os estudos em animais, bem como estudos genéticos humanos indicam que o lítio afecta alvos moleculares que estão envolvidas no crescimento neuronal, a sobrevivência e a maturação, e nomeadamente as moléculas envolvidas na sinalização de Wnt. Dado o desafio ético para a obtenção de biópsias cerebrais para investigar as alterações moleculares associadas a dinâmicas de lítio-resposta no sistema nervoso central (SNC), pode-se considerar o uso de neurônios obtidos a partir de tecidos olfativos para alcançar este goal.The epitélio olfatório contém neurônios receptores olfativos em diferentes fases de desenvolvimento e glia do tipo células de suporte. Isso proporciona uma oportunidade única para estudar as alterações dinâmicas do CNS de pacientes com doenças neuropsiquiátricas, usando tecido olfativo obtido com segurança a partir de biópsias nasais. Para superar o problema colocado por substantial contaminação de tecido biopsiado olfactivo com células não neuronais, uma nova abordagem para a obtenção de populações de células neuronais enriquecido foi desenvolvido através da combinação de biópsias nasais com captura por laser microdissecação. Neste estudo, um sistema para investigar as alterações moleculares dinâmicas associadas ao tratamento no tecido neuronal foi desenvolvido e validado, utilizando uma pequena amostra piloto de pacientes com TB recrutados para o estudo dos mecanismos moleculares de resposta ao tratamento de lítio.

A estratégia de protocolo e solução de problemas no estudo de assinaturas moleculares foram otimizados com sucesso. Qualidade e critérios de enriquecimento de ARN para neuronais amostras para ser utilizado em mais a jusante análise PCR em tempo real foram padronizadas. RIN e concentração de RNA foram examinados como fatores de confusão para os níveis de expressão detectados. Com base na análise de diversas amostras com RINs variando de 1 - 10, foi determinado que um RIN mínimo de ~ 3,0 e acima é suficiente para a anális...

Neste estudo, um romance plataforma para investigar assinaturas moleculares intraneuronal de resposta ao tratamento do transtorno bipolar (TB) foi desenvolvido e validado. O epitélio olfatório de pacientes com TB foi obtido através de biópsias nasais. Em seguida, captura a laser microdissection foi combinado com Tempo real RT PCR para investigar a assinatura molecular de resposta de lítio em BD.

Neurônios olfativos obtida através Nasal Biópsia Combinada com Laser-Capture Microdissection: Uma Abordagem Potencial para tratamento estudo Response em Transtornos Mentais

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Este procedimento detalha o uso de micro dissecção de captura a laser para isolar camadas neuronais do tecido do epitélio olfatório e também descreve algumas análises de expressão gênica a jusante. Comece com uma biópsia nasal para obter o tecido do epitélio olfatório. Em seguida, execute a microdissecção por captura a laser para isolar as camadas neuronais.Em seguida, isole o RNA das amostras. Transcrição reversa para CDNA e análise da expressão gênica por QPCR. Em última análise, a microdissecção por captura a laser é usada para mostrar que uma população enriquecida de neurônios pode ser isolada do tecido do epitélio olfatório e aplicada a inúmeras aplicações a jusante.A principal vantagem dessa técnica sobre os metais existentes, como culturas de células neuronais, é que ela nos permite estudar mudanças de estado e dinâmicas em um contexto neuronal. Tivemos a ideia para este projeto pela primeira vez quando descobrimos o potencial de combinar micro dissecção de captura a laser com biópsias olfativas para obter populações neuronais enriquecidas. Este método foi estabelecido e demonstrado pela TDA.Expandimos essa metodologia e combinamos a análise Q-R-T-P-C-R downstream em pacient

olfactory-neurons-obtained-through-nasal-biopsy-combined-with-laser

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Descrevemos aqui um método para biopsying mucosa olfativa de ratos e humanos cavidades nasais. Essas biópsias podem ser utilizados tanto para identificar anomalias molecular em doenças cerebrais ou isolar células-tronco adultas multipotentes que podem ser utilizados para o transplante de células em modelos animais de trauma cerebral / doença.

Isolando Nasal Células-Tronco olfativo dos roedores ou humanos

Neurônios adultos-nascido do bulbo olfativo pode ser controlado usando optogenetically Channelrhodopsin2 expressando injeção lentiviral no fluxo migratório rostral e fotoestimulação crônica com uma miniatura implantado LED.

Transdução Viral seletiva de Adultos-nascido neurônios olfativos de crônica In vivo Estímulo Optogenetic

Neurônios receptores olfativos (ORNs) converter sinais de odor primeiro em um receptor de corrente que por sua vez desencadeia potenciais de ação que são transmitidos para os neurônios de segunda ordem no bulbo olfativo. Aqui, descrevemos a técnica da pipeta de sucção para gravar simultaneamente o receptor de odorante induzida atual e os potenciais de ação de ORNs mouse.

Odorante induzidas respostas registradas a partir de neurônios receptores olfativos utilizando a técnica de sucção da pipeta

Nós demonstramos as variações da técnica de gravação extracelular de multi-unidade para caracterizar odor evocadas respostas nas três primeiras etapas da via olfactiva invertebrado. Estas técnicas podem ser facilmente adaptados para examinar a actividade conjunto de outros sistemas neurais também.

Multi-unidade Métodos de gravação para caracterizar a atividade neural no Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuitos olfatórias

Um método eficaz para Desossa manual Prepare Intacto Rato tecido nasal com organização anatômica preservada

Este protocolo introduz o aprendizado precoce da preferência de odor lateralizado em ratos usando oclusão aguda de naris única. A aprendizagem lateralizada permite o exame de resultados comportamentais e mecanismos biológicos subjacentes dentro dos mesmos animais, reduzindo a variância induzida por designs entre animais. Este protocolo pode ser usado para investigar os mecanismos moleculares que sustentam o aprendizado precoce de odores.

Um Modelo de Aprendizagem lateralizados Odor em ratos recém-nascidos para Dissecando Formação Neural dos circuitos Consolidação da Memória

A análise das propriedades fisiológicas dos neurônios sensoriais olfativos ainda enfrenta limitações técnicas. Aqui, nós os registramos por meio de patch-clamp perfurado em uma preparação intacta do epitélio olfatório em camundongos direcionados ao gene. Esta técnica permite a caracterização das propriedades da membrana e respostas a ligantes específicos de neurônios que expressam receptores olfativos definidos.

Perfurado gravação patch-clamp de rato Olfactory neurônios sensoriais na Intact neuroepitélio: Análise Funcional do Neurônios Expressando uma Odorant Receptor Identificados

Este protocolo explica como coletar neurônios únicos, microglia e astrócitos do núcleo central da amígdala com alta precisão e especificidade anatômica usando microdissecção de captura a laser. Além disso, explicamos nosso uso de RT-qPCR microfluido para medir um subconjunto do transcriptome dessas células.

Combinando microdissecção de captura a laser e qPCR microfluido para analisar perfis transcricional de células únicas: uma abordagem de biologia de sistemas para dependência de opióides

Este trabalho descreve o uso de um olfatômetro sincronizado com a respiração para desencadear a estimulação magnética transcraniana (EMT) de bobina única e dupla durante a apresentação do odor sincronizada à respiração nasal humana. Essa combinação nos permite investigar objetivamente como odores agradáveis e desagradáveis afetam a excitabilidade corticoespinhal e a conectividade cerebral efetiva em um determinado indivíduo.

Combinando um Olfatômetro Sincronizado com a Respiração com Simulação Cerebral para Estudar o Impacto dos Odores na Excitabilidade Corticoespinhal e Conectividade Eficaz

Este artigo fornece um protocolo simplificado para a dissecção e dissociação do epitélio olfatório murino para fins de sequenciamento de RNA de núcleo único.

Dissecção rápida e dissociação do epitélio olfatório de camundongo para suspensões de núcleo único

Aprenda a isolar neurônios olfativos por biópsia nasal combinada com microdisseção a laser para estudar resposta ao tratamento em transtorno bipolar. Este método permite análise de expressão gênica em populações neuronais enriquecidas.

Neurônios olfativos obtida através Nasal Biópsia Combinada com Laser-Capture Microdissection: Uma Abordagem Potencial para tratamento estudo Response em Transtornos Mentais (Vídeo) | JoVE Journal

Neurônios olfativos obtida através Nasal Biópsia Combinada com Laser-Capture Microdissection: Uma Abordagem Potencial para tratamento estudo Response em Transtornos Mentais

Explorar mais vídeos