Name: Injection Viral intracerebroventricular do Neonatal do rato do cérebro para a transdução neuronal persistente e generalizada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Aprenda a técnica de injeção intracerebroventricular viral em camundongos neonatais para transdução neuronal generalizada. Este método permite expressão duradoura de transgenes em todo o cérebro usando AAV.

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Esta pesquisa foi apoiada pela Robert A. and Rene E. Belfer Family Foundation, NIA R21 AG038856 (JLJ), BrightFocus Foundation Alzheimer's Disease research grant A2010097 (JLJ) e NIA Biology of Aging Training grant T32 AG000183 (apoio para SDG).

Realizar todos os procedimentos e protocolos que envolvem animais, de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Os procedimentos aqui descritos foram analisados ​​e aprovados pelo Colégio Baylor de Medicina Animal Care Institucional e Comitê de Uso. Vírus adeno-associado (AAV) os vectores de replicação incompetente para a entrega do transgene no cérebro de roedores são aprovados para uma utilização nível de biosegurança. Consulte o site da CDC para a publicação Governo dos EUA &quot;Biossegurança em Laboratórios de Microbiologia e Biomédicas (BMBL)&quot;, que detalha os requisitos específicos relativos aos procedimentos de proteção e de tratamento de vírus adequadas. Verifique com a equipe de segurança veterinária e ambiental local para saber os requisitos específicos institucionais para procedimentos que utilizam vírus. Regulamentos relativos salas de procedimento, quarentena e identificação de gaiolas de risco biológico variam entre as instituições. 1. Prépare P0 os filhotes e mães adotivas <ol><li> Forneça ração rica em gordura para todas as mulheres grávidas e lactantes para apoiar as demandas de energia de reprodução e lactação. </li><li> À noite, configurar uma gaiola de criação, adicionando uma ou duas fêmeas saudáveis ​​para a gaiola de um único macho residente. Na manhã seguinte, verifique as fêmeas para o acasalamento uma ficha e separar as fêmeas dos machos se um plugue está presente. <ol><li> Use mães adotivas para levantar filhotes de fundo genético com características maternas pobres (por exemplo, C57BL / 6 ou C3HeJ). Mães adotivas aceitar os filhotes de outra ninhada, se os filhotes nascem transferidos no prazo de quatro dias de sua ninhada da mãe adotiva. </li><li> Configurar uma gaiola de acasalamento separado usando ICR ou fêmeas FVB ao lado dos criadores experimentais para que os dois conjuntos de fêmeas dão à luz em aproximadamente ao mesmo tempo. </li></ol></li><li> As fêmeas entregar em 19 ± 1 dias a partir da data de tampão, dependendo da estirpe de fundo. Três dias antes delivery (16 dias após a data de tomada), coloque a fêmea grávida em uma gaiola limpa com material de nidificação fresco e um abrigo coberto. </li><li> Verifique se há filhotes recém-nascidos duas vezes por dia a partir 2 dias antes da data provável do parto (17 dias após a data de plugue). Examine a gaiola com o mínimo de estresse para as mães por espreitar através do fundo para a presença de recém-nascidos de-rosa. Ratos geralmente entregar filhotes de manhã, mas em raras ocasiões, vai entregar na tarde. </li><li> Plano para realizar injeções assim que os filhotes são de enfermagem (o que fica evidenciado por manchas visíveis de leite), ou no prazo de 6 horas de nascimento, o que ocorrer primeiro. </li></ol> 2 Prepare Equipamento para Injeção <ol><li> Prepare uma seringa de 10 mL com uma agulha de 32 G para recém-nascidos gerais P0. Se realizar a injeção estereotáxica, montar a seringa no braço manipulador. </li><li> Se estiver usando um quadro estereotáxico para injectáveis, esfriar a fase neonatal para 4-8 ° C pela adição de 100% Ethanol e gelo seco para o reservatório na extremidade da frente do bloco. Manter a temperatura acima de 1 ° C para evitar o congelamento das crias. </li></ol> 3 Preparar diluições virais para Injeção <ol><li> Prepara-se uma solução de 1% de corante azul de tripano (20x estoque). </li><li> Prepare 5-25 mL alíquotas de vírus (AAV) da adeno-associado dentro de uma cabine de segurança biológica classe 2. Coloque estas alíquotas a -80 ° C para uso futuro. Evitar ciclos de congelamento-descongelamento adicionais como esta faz com que o vírus se perder eficácia de transdução. </li><li> Remove-se uma alíquota de AAV a partir da temperatura de -80 ° C e colocar no congelador de gelo a descongelar. </li><li> Preparar a solução injectável viral por diluição do vírus em solução salina 1x fosfato gelada (PBS). Comece com uma diluição em série de dez vezes (10 outubro - 10 agosto partículas virais / hemisfério) para a otimização inicial do padrão de transdução. </li><li> Adicionar 20x azul de tripano para a solução de AAV para uma concentração final de 0,05%. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Estadiamento do recém-nascido Filhotes para Injeção <ol><li> Coloque uma pequena placa de alumínio no gelo para esfriar. Inserir uma tarefa seco limpar no topo da placa para proteger a pele do filhote de metal frio. Isto serve como uma superfície plana frio para anestesiar e injetando os filhotes. </li><li> Prepare uma almofada de aquecimento adequado para manter os ratos neonatal quente antes e após a injeção. </li><li> Uma vez que os filhotes recém-nascidos começaram a enfermeira, remover cerca de metade deles da gaiola e deixar a outra metade com a mãe. Coloque os filhotes recolhidos no bloco de aquecimento, enquanto se aguarda a injeção. NOTA: Se a mãe biológica não se importa com os filhotes, remova todo o lixo da jaula imediatamente e colocar os filhotes em uma almofada de aquecimento para aguardar injeção. Esta situação pode ocorrer com a primeira ninhada nasceu para C57BL / 6 fêmeas ou com outras linhagens puras que têm características de reprodução pobres. Nesta situação, manchas de leite não será visível em filhotes recém-nascidos. </li><li>Transferir um filhote de cachorro da almofada de aquecimento sobre a placa de metal frio para induzir a anestesia hipotermia. Espere 2-3 minutos para o filhote de cachorro para se tornar totalmente anestesiado. Confirme anestesia apertando muito suavemente uma pata e monitorar por falta de movimento ou respiração. </li></ol> 5 Injeção de AAV em Neonatal Ratos <ol><li> Free-mão injeção intracraniana de AAV em ratos neonatal: <ol><li> Carga 5 ul de AAV diluída com 0,05% de azul de tripano para a seringa de injecção. </li><li> Limpe cuidadosamente a cabeça do cachorro anestesiado com um cotonete embebido em álcool 70%. </li><li> Identificar os locais de injecção em 2/5 da distância entre a sutura lambda para cada olho. Um local de injeção alternativa está localizada a aproximadamente 0,8-1 mm lateral da sutura sagital, a meio caminho entre lambda e bregma. Estes marcos são visíveis através da pele em P0. </li><li> Marque o local da injecção com uma caneta de laboratório não-tóxico. </li><li> Segure a seringa com a escala visível para monimento do volume de solução administrada. </li><li> Certifique-se de que o polegar pode alcançar o topo do êmbolo. Em seguida, retire o polegar do êmbolo ao posicionar a agulha para evitar que acidentalmente distribuir vírus. </li><li> Encontre uma posição confortável para preparar o braço para injeção, colocando o cotovelo no banco e apoiando-se no braço do balde de gelo. </li><li> Deite o cachorro de lado com a cabeça diretamente sob a seringa. Vire a cabeça do cachorro para que o local da injecção marcada é voltada para cima, e gentilmente, mas com firmeza manter esta posição com a mão aberta. </li><li> Segurar a seringa perpendicular à superfície do crânio e inserir a agulha no local de injecção marcado a uma profundidade de aproximadamente 3 mm. Injectar a agulha até que a resistência diminui ligeiramente, indicando que a agulha tenha penetrado no ventrículo lateral. Se for necessária uma referência, marca de 3 mm a partir da ponta da agulha com a máquina não-tóxico. Ajuste a profundidade de injeção para tamanho e tensão cachorro com base em corante targeting dos ventrículos. </li><li> Segurar a seringa rigidamente de modo que o êmbolo pode ser deprimido, sem mover a agulha mais para dentro do cérebro. Se a injecção é deslocado para o tálamo, propagação viral será severamente limitado. </li><li> Comece injectando lentamente o vírus durante a monitorização do volume a distribuir a partir da seringa. Administrar um volume máximo de 2 ul em cada ventrículo. Se a agulha se encontra na posição correcta, o corante se espalhe para preencher o ventrículo. </li><li> Lentamente, retirar a agulha. </li><li> Permitir que o primeiro local da injeção para fechar antes de injetar o outro hemisfério. NOTA: Não injetar no mesmo local mais de uma vez. Reinserir o vírus forças agulha que já foi injetada a vazar e causar ferimentos ou morte do filhote. </li><li> Injectar o ventrículo contralateral utilizando o mesmo procedimento. </li></ol></li><li> Injecção estereotáxica de AAV em murganhos neonatais: <ol><li> Carga 5 ul de AAV diluída com 0,05% de azul de tripano into da seringa de injeção realizada pelo manipulador estereotáxica. </li><li> Delicadamente, coloque a cabeça do cachorro entre as barras de ouvido do quadro neonatal. Certifique-se a cabeça é o nível no eixo Y (da frente para trás), verificando que a linha entre lambda e bregma é paralela à fase. Certifique-se a cabeça é o nível no eixo X (lado a lado) com a verificação de que uma linha imaginada entre as orelhas, ou de uma linha entre os olhos, é paralela à fase. </li><li> Limpe cuidadosamente a cabeça do cachorro anestesiado com um cotonete embebido em álcool 70%. </li><li> Use o manipulador estereotáxica para posicionar a seringa acima lambda e depois zerar o coordenadas X e Y. Mover os braços estereotáxica de (X, Y) = (0,8, 1,5) mm para filhotes P0 padrão. Nota: O tamanho do filhote de cachorro e coordenadas estereotáxica pode variar por estirpe e idade. Ajuste coordenadas com base em injeções de corante, conforme necessário para atingir os ventrículos laterais. </li><li> Lentamente abaixe a agulha no local da injeção. A superfície do crânio vai indent e solte uma vez que a agulha penetrou a pele. Retrair a agulha até que o crânio recupera a sua forma côncava normal, mas manter o bisel da agulha sob a pele. Zero coordenada Z neste momento. </li><li> Insira a agulha até Z = -1,7 mm e, em seguida, retirar a -1,5 mm. </li><li> Lentamente injetar o vírus. Cada hemisfério pode aceitar-se a 2 mL de solução. </li><li> Manter a seringa no local por 30-60 segundos após o término da injeção e, em seguida, retirar lentamente a agulha durante 1-2 min. </li><li> Repita o procedimento para o hemisfério contralateral, utilizando coordenadas negativas no eixo X para o local da injeção. NOTA: coordenadas alternativos para a injecção são (X, Y, Z) = (0,8, 2,0, -1,5) mm e (1.2, 1.0, -1.5) mm. Realizar a primeira injeção em (0.8, 2.0), em seguida, passar a (0,8, -2,0), (1.2, 1.0) e, finalmente, (1,2, -1,0). Injectar 1 ul da solução em cada local, para um total de 2 ul por hemisfério. Mova-se rapidamente entre as injeções para concluir o procedimento em less de 10 min. </li></ol></li></ol> 6 Pós-injeção de Cuidados <ol><li> Depois de completar as injeções em ambos os hemisférios, coloque o filhote de volta na plataforma de aquecimento até a temperatura do corpo e cor da pele volta ao normal eo filhote começa a se mover. </li><li> Se estiver usando a mãe biológica de amamentar os recém-nascidos injetados, devolver os filhotes injetados para a mãe biológica depois de recuperar o movimento normal. Coloque os restantes filhotes uninjected na almofada de aquecimento. Repita o procedimento até que todos os camundongos foram injetados. </li><li> Se estiver usando uma mãe adotiva para amamentar os recém-nascidos injetados, transferir todos os filhotes injetados para a mãe adotiva de cuidados depois de recuperar o movimento normal. <ol><li> Remover a maior parte ou a totalidade das crias pertencentes à mãe adoptiva da gaiola para garantir o sucesso dos animais injectados. </li><li> Se os filhotes da mãe adotiva e injetados filhotes têm o mesmo olho e cor da pele, marcar os filhotes da mãe adotiva com uma caneta de laboratório para que possam serdistinguidos mais tarde. </li><li> Coloque os filhotes da mãe adotiva e um pouco de sua cama junto com os filhotes injetadas. Certifique-se de que os filhotes injetados adquirir o perfume de sua prole biológica para melhorar a aceitação dos novos filhotes. </li><li> Coloque apenas os filhotes injetados de volta na gaiola da mãe adotiva. Abater todos os filhotes restantes da mãe adotiva. </li></ol></li><li> Certifique-se de que a mãe está atendendo e amamentação dos filhotes injetados dentro de 10 min de colocá-los na gaiola. Se a mãe não recolhe os filhotes dentro deste tempo, transferir os filhotes para outra mãe adotiva. </li><li> Rotular a gaiola com um cartão de perigo biológico para mostrar que ele contém animais por vírus injetado. Casa gaiola numa área aprovada durante 72 horas. </li><li> Após o período de quarentena de 72 horas, a transferência da mãe e filhotes (mas não de cama ou outros itens de gaiola) para uma gaiola limpa. Realize esta transferência dentro de um nível de gabinete 2 de biossegurança para evitar a exposição a qualquer cama de forma viral contaminado. Regressar a gaiola limpa com os animais injetados para a instalação normal do mouse. </li><li> Coloque a gaiola suja em um saco de risco biológico, esterilizar em autoclave, e depois voltar a gaiola para o viveiro. </li></ol> 7 Cleanup <ol><li> Coloque a solução de vírus restante a 4 ° C para uso futuro. O vírus mantém a eficiência de transdução durante pelo menos 2 meses, quando armazenada a 4 ° C 8. </li><li> Desinfetar a agulha de injeção e uma seringa com 2% de água sanitária, seguido por lavagens repetidas em água deionizada. </li><li> Limpe a área de trabalho com 2% de alvejante seguido por 70% de etanol. </li><li> Colete todos os itens descartáveis, incluindo pontas de pipetas, tubos, máscara e luvas em um saco plástico de risco biológico. Descarte de resíduos, conforme exigido pela legislação local e as políticas institucionais (ie autoclave ou queime). </li></ol> 8 Prepare mouse Brains for Imaging <ol><li> Inserir um rato injectado numa câmara de dióxido de carbono a 3 eutanásia4 semanas após a injecção. Siga as orientações institucionais para procedimentos de eutanásia adequadas. Não perfuse animais com paraformaldeído como isso irá apagar o rótulo de fluorescência. </li><li> Remover os cérebros inteiros do crânio e corrigir para 3-12 h em paraformaldeído a 4% em PBS a 4 ° C. </li><li> Transferir o cérebro fixa a 30% de sacarose para crioprotecção. Incubar a 4 ° C até que o cérebro se deposita no fundo. </li><li> Colete um balde de gelo seco finamente picado. Corte o cérebro pela metade para baixo da linha média. Bury as metades cerebrais em gelo seco para congelar. </li><li> Arrefece-se a fase micrótomo por adição de gelo seco e etanol a 100%. </li><li> Prenda o cérebro para o palco com a linha média para baixo, usando PBS, e deixe congelar. </li><li> Seção através do cérebro em 30-45 espessura um utilizando um micrótomo deslizante de congelamento. </li><li> Colocar as secções em placas de 24 poços contendo a solução de anticongelante (250 ml de glicerol, 300 ml de etileno glicol, 500 ml de tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4). Placas de cobertura wiª folha de alumínio e armazenar a -20 ° C para uso futuro. </li><li> Colete seções 1-4 poços e lavar 3x em PBS. </li><li> Seções montar em lâminas de microscópio e lamela. Deixar as lâminas para secar em um local escuro. </li><li> Lâminas de imagem usando filtros adequados para YFP nativa ou tdTomato para verificar o padrão de transdução de vírus. </li></ol>

<ol><li>De Vry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+the+central+nervous+system%3A+a+non-viral+approach+for+targeted+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery.</a> Progress in neurobiology. 92, 227-244 (2010).</li>
<li>Sun, B., Gan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+gene+expression+in+the+central+nervous+system+with+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Manipulation of gene expression in the central nervous system with lentiviral vectors.</a> Methods Mol Biol. 670, 155-168 (2011).</li>
<li>Puntel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+rat+brain+using+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors.</a> Curr Protoc Neurosci. 4, (2010).</li>
<li>Passini, M. A., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+gene+delivery+and+structure-specific+patterns+of+expression+in+the+brain+after+intraventricular+injections+of+neonatal+mice+with+an+adeno-associated+virus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Widespread gene delivery and structure-specific patterns of expression in the brain after intraventricular injections of neonatal mice with an adeno-associated virus vector.</a> J Virol. 75, 12382-12392 (2001).</li>
<li>Passini, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraventricular+brain+injection+of+adeno-associated+virus+type+1+%28AAV1%29+in+neonatal+mice+results+in+complementary+patterns+of+neuronal+transduction+to+AAV2+and+total+long-term+correction+of+storage+lesions+in+the+brains+of+beta-glucuronidase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice.</a> J Virol. 77, 7034-7040 (2003).</li>
<li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+transduction+of+the+neonatal+brain+delivers+controllable+genetic+mosaicism+for+visualising+and+manipulating+neuronal+circuits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo.</a> Eur J Neurosci. 37, 1203-1220 (2013).</li>
<li>Chakrabarty, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsid+serotype+and+timing+of+injection+determines+AAV+transduction+in+the+neonatal+mice+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Croyle, M. A., Cheng, X., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+formulations+that+enhance+physical+stability+of+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Development of formulations that enhance physical stability of viral vectors for gene therapy.</a> Gene therapy. 8, 1281-1290 (2001).</li>
<li>Bauer, H. C., Bauer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+induction+of+the+blood-brain+barrier%3A+still+an+enigma%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neural induction of the blood-brain barrier: still an enigma.</a> Cellular and molecular neurobiology. 20, 13-28 (2000).</li>
<li>Cearley, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+repertoire+of+AAV+vector+serotypes+mediate+unique+patterns+of+transduction+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Expanded repertoire of AAV vector serotypes mediate unique patterns of transduction in mouse brain.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1710-1718 (2008).</li>
<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+gene+therapy+vector+evolution+via+multispecies+interbreeding+and+retargeting+of+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses.</a> J Virol. 82, 5887-5911 (2008).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Nós descrevemos um procedimento versátil para manipular a expressão de genes usando neuronal AAV como um veículo para a entrega generalizada no cérebro neonatal mouse. Em comparação com outros métodos de transgénese neuronal, tais como no útero electroporação ou uma injecção intracraniana estereotáxico 2,3, injecção neonatal viral é relativamente fácil e simples. O procedimento básico pode ser realizada em minutos com apenas um balde de gelo e uma seringa de microlitro. Sobrevivência Optimal e expr...

Os métodos tradicionais para modificar a expressão do gene neural exigem demoradas e dispendiosas manipulações da linha germinativa. Alternativa de novo se aproxima, como em eletroporação utero ou injeção lentiviral estereotáxica dar resultados mais rápidos e menos caros, mas têm a desvantagem de necessitar de intervenção cirúrgica complexa 1-3. Além disso, a expressão do transgene tem um intervalo espacial limitada a estes métodos. Aqui, nós descrevemos um método rápido, fácil e económico para a manipulação neuronal difundido através de injecção intraventricular de vírus adeno-associado (AAV) para o cérebro do rato neonatal. O método foi descrito pela primeira vez por John Wolfe e Marco Passini em 2001, onde eles sugeriram pequeno tamanho de partícula de AAV permitiu-se difundir no fluido cérebro-espinal, uma vez que passa a partir dos ventrículos laterais através da barreira ependimal imaturos e para o parênquima cerebral 4, 5. Injecção intraventricular de AAV no interior do frimeira 24 h depois do nascimento rendimentos de transdução virai generalizada de subconjuntos neurais que abrangem todas as regiões do cérebro, a partir dos bolbos olfactivos até o tronco cerebral 6,7. Transgenes Virally-entregues são expressos e ativo dentro de dias de injeção e persistir por até um ano após a transdução. Assim, esta manipulação versátil permite estudos vão desde o desenvolvimento pós-natal precoce do cérebro com o envelhecimento e degeneração no adulto. Ao adaptar a técnica às nossas necessidades específicas experimental, temos focado principalmente na AAV8 sorotipo porque ele é o mais eficiente na transdução de neurônios 6. Nós mostramos que o título viral pode ser diluído para controlar a densidade de neurónios transduzidas para consequências intrínsecas às células de teste experiências de manipulação genética. Além disso, demonstra-se que dois vírus pode ser co-injectado para produzir os padrões de expressão que favorecem a conjuntos distintos ou de sobreposição de neurónios, dependendo dos serotipos escolhidos paraempacotamento viral. O nosso trabalho expande a versatilidade desta técnica para utilização numa ampla variedade de configurações de neuroscience experimentais.

<table><tbody><tr><td>Camundongos consanguíneos</td><td>ICR Harlan</td><td>Hsd:ICR (CD-1)</td><td>Esta cepa também é conhecida como camundongos endogâmicos CD-1</td></tr><tr><td>FVB</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>1800</td><td>5-6 semanas de idade</td></tr><tr><td>Nestlets</td><td>Lab Supply</td><td>NESTLETS</td><td></td></tr><tr><td>Shepherd shacks</td><td>Lab Supply</td><td>SS-mouse</td><td></td></tr><tr><td>ração para roedores com alto teor de gordura</td><td>Purina Mills</td><td>PicoLab Mouse diet 20, #5058</td><td>Esta é a nossa ração padrão para</td></tr><tr><td>roedores com alto teor de gordura (alternativa)</td> <td>Harlan Laboratories</td><td>Teklad Global 19% de proteína dieta para roedores #2019S</td><td>Se for necessária uma dieta autoclavável com baixo teor de fitoestrogênio</td></tr><tr><td>Seringa de injeção</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td>Seringa de 10 ml</td></tr><tr><td>Agulhas de injeção</td><td>Hamilton</td><td>7803-04, RN 6PK PT4, 0,375 "</td><td>32 G, para injeções padrão P0</td></tr><tr><td>Placa de metal para crioanestesia</td><td>McMaster Carr</td><td>8975K439</td><td>Placa de alumínio bruto, 6" x 12", 0.25" de espessura, precisará ser cortada em 3 partes iguais e bordas lixadas por oficina mecânica local</td></tr><tr><td>Dispositivo estereotáxico para pequenos animais com leitura digital</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modelo 940</td><td></td></tr><tr><td>Suporte universal para seringa com pé de suporte de agulha</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modelo 1772-F1</td><td></td></tr><tr><td>Quadro neonatal</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td>Oficialmente chamado de adaptador de rato e rato neonatal</td></tr><tr><td>Sacos de eliminação de risco biológico com indicador estéril</td><td>VWR</td><td>14220-030</td><td>Importante! &ndash; Verifique com a equipe veterinária e de segurança ambiental local para saber o seu instituto' Protocolo para Descarte de Resíduos de Risco Biológico</td></tr></tbody></table>

injection viral intracerebroventricular do neonatal do rato do cérebro para a transdução neuronal persistente e generalizada

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Com o ritmo de avanço científico acelerando rapidamente, são necessários novos métodos para a neurociência experimental de forma rápida e facilmente manipular a expressão genética no cérebro do rato. Aqui nós descrevemos uma técnica introduzida por Passini e Wolfe para entrega intracraniana direta de transgenes viralmente codificadas no cérebro neonatal mouse. Em sua forma mais básica, o procedimento requer apenas um balde de gelo e uma seringa microlitro. No entanto, o protocolo pode também ser adaptado para utilização com quadros estereotáxicas para melhorar a consistência dos investigadores novas para a técnica. O método baseia-se na capacidade do vírus adeno-associado (AAV) para mover-se livremente a partir dos ventrículos cerebrais para o parênquima cerebral, enquanto o revestimento ainda está ependimária imaturos durante a primeira hora após o parto 12-24. Injeção intraventricular de AAV nesta idade resulta na transdução generalizada de neurônios em todo o cérebro. Expressão começa dentro de dias de injeção e persiste durante a lifetime do animal. Título viral pode ser ajustado para controlar a densidade de neurónios transduzidas, enquanto a co-expressão de uma proteína fluorescente proporciona um rótulo vital das células transduzidas. Com a crescente disponibilidade de instalações nucleares virais para fornecer reagentes tanto off-the-shelf, pré-embalados e preparação personalizado viral, esta abordagem oferece um método oportuna para manipular a expressão genética no cérebro do rato que é rápido, fácil, e muito menos dispendioso de engenharia de células germinativas tradicional.

Bem sucedidos intraventricular rendimentos injeção viral expressão neuronal disseminada e robusto. Aqui nós avaliamos a transdução viral usando YFP ou tdTomato genes fluorescentes sob o controle do frango beta actina promotor (CBA promotor). Estas construções foram embalados em AAV8 e injetado nos ventrículos laterais de ratos neonatos (P0) ICR. Títulos virais elevadas (10 10 partículas por hemisfério) resultou na marcação densa do bulbo olfatório, estriado, córtex cerebral, hipocampo e cerebelo (Figu...

Aqui demonstramos uma técnica para transdução neuronal generalizada por injeção intraventricular de vírus adeno-associado no cérebro de camundongo neonatal. Este método fornece uma maneira rápida e fácil de obter a expressão vitalícia de transgenes entregues por vírus.

Injection Viral intracerebroventricular do Neonatal do rato do cérebro para a transdução neuronal persistente e generalizada

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

O objetivo geral deste procedimento é transduzir neurônios viralmente em todo o cérebro. Isso é realizado por crioanestesia de filhotes recém-nascidos, seguida pela transferência do recém-nascido para o estágio resfriado para injeção. Em seguida, identifique o local da injeção para atingir os ventrículos laterais entre a sutura Lambda e cada olho ou lateral da sutura sagital a meio caminho entre Lambda e Bgma.A etapa final é inserir a agulha na profundidade correta e infundir lentamente até dois microlitros de solução viral no ventrículo lateral de cada hemisfério. Em última análise, uma marca fluorescente ou imunofluorescência para o gene de interesse é usada para mostrar o padrão de expressão do transgene resultante da injeção intraventricular. Geralmente, os indivíduos novos nessa técnica terão dificuldade em direcionar com precisão os ventrículos laterais.Esta técnica é demonstrada tanto por injeção intracraniana à mão livre quanto por injeção estereotáxica, demonstrando que a técnica à mão livre será outro pós-doutorado em meu laboratório. Para começar, prepare uma seringa de injeção de 10 microlitros com uma agulha de calibre 32 para recém-nascidos gerais no dia zero pós-natal. Em seguida, coloque uma pequena placa de alumínio no gelo para esfriar e coloque um lenço seco em cima da placa para proteger a pele do filhote do metal frio.Isso serve como uma superfície plana e fria para anestesiar e injetar os filhotes. Em seguida, prepare uma almofada de aquecimento adequada para manter os camundongos recém-nascidos aquecidos antes e depois da injeção. Assim que os filhotes recém-nascidos começarem a mamar, remova aproximadamente metade deles da gaiola e deixe a outra metade com a mãe.Coloque os filhotes coletados na almofada de aquecimento enquanto aguarda a injeção. Transfira um filhote da almofada de aquecimento para a placa de metal fria para induzir a hipotermia. Anestesia. Aguarde de dois a três minutos para que o filhote fique totalmente anestesiado.Confirme a anestesia apertando suavemente uma pata e monitore a falta de movimento ou respiração gratuitamente. A injeção intracraniana manual carrega cinco microlitros de vírus adeno-associado diluído, ou um AV com 0,05% de azul Trian na seringa de injeção. Limpe suavemente a cabeça do filhote anestesiado com um cotonete embebido em etanol 70%.Identifique os locais de injeção a dois quintos da distância da sutura lambda a cada olho e o local de injeção alternativo está localizado a aproximadamente 0,8 a um milímetro lateral da sutura sagital a meio caminho entre Lambda e Bgma. Esses pontos de referência são visíveis através da pele no dia zero pós-natal. Marque o local da injeção com uma caneta de laboratório não tóxica.Segure a seringa com uma escala visível para monitorar o volume da solução dispensada. Certifique-se de que o polegar possa alcançar o topo do êmbolo. Em seguida, remova o polegar do êmbolo enquanto posiciona a agulha.Para evitar a distribuição acidental do vírus, coloque o filhote de lado com a cabeça diretamente sob a seringa. Gire a cabeça do P'S de modo que o local de injeção marcado fique voltado para cima e suavemente, mas com firmeza. Mantenha esta posição com a mão aberta.Segure a seringa perpendicularmente à superfície do crânio e insira a agulha no local de injeção marcado a uma profundidade de aproximadamente três milímetros. Injete a agulha até que a resistência diminua ligeiramente, indicando que a agulha penetrou no ventrículo lateral. Comece a injetar lentamente o vírus enquanto monitora o volume dispensado da seringa.Administre um volume máximo de dois microlitros no ventrículo. Retire lentamente a agulha. Deixe o primeiro local de injeção fechar antes de injetar o outro hemisfério.Se a agulha estiver na posição correta, o corante se espalhará para preencher o ventrículo. Resfrie o estágio neonatal entre quatro e oito graus Celsius adicionando 100% de etanol e gelo seco ao reservatório. Na extremidade frontal do bloqueio do bloco.Mantenha a temperatura acima de um grau Celsius para evitar queimaduras nos filhotes. Carregue cinco microlitros de AAV diluído com 0,05% de azul triano na seringa de injeção segurada pelo manipulador estereotáxico. Mais tarde, coloque suavemente a cabeça do filhote entre as barras auriculares da estrutura neonatal.Certifique-se de que a cabeça esteja nivelada no eixo Y, verificando se a linha entre lambda e Bgma é paralela ao palco. Certifique-se de que a cabeça esteja nivelada no eixo x, verificando se uma linha imaginária entre as orelhas ou uma linha entre os olhos é paralela ao palco. Limpe suavemente a cabeça do filhote anestesiado com um cotonete embebido em etanol a 70%.Em seguida, use o manipulador estereotáxico para posicionar a seringa acima de Lambda e zero. As coordenadas x e y. Mova os braços estereotáxicos para uma posição 0,8 milímetros lateral e 1,5 milímetros anterior à sutura lambda ou filhotes padrão pós-natal dia zero abaixe lentamente a agulha no local da injeção.A superfície do crânio recuará e depois se soltará. Uma vez que a agulha tenha penetrado na pele, retraia a agulha até que o crânio recupere sua forma côncava normal, mas mantenha o chanfro da agulha sob a pele zero. A coordenada Z neste ponto.Insira a agulha até que Z seja igual a menos 1,7 milímetros e, em seguida, retraia para menos 1,5 milímetros. Injete lentamente o vírus. Cada hemisfério pode aceitar até dois microlitros de solução.Mantenha a seringa no lugar durante 30 a 60 segundos após completar a injeção e, em seguida, retraia lentamente a agulha durante um a dois minutos. Repita para o hemisfério contralateral usando coordenadas negativas no eixo x para o local da injeção. Depois de completar as injeções em ambos os hemisférios, coloque o filhote de volta na almofada de aquecimento até que a temperatura corporal e a cor da pele voltem ao normal e o filhote comece a se mover.Em seguida, remova os filhotes injetados restantes para a almofada de aquecimento e retorne os filhotes injetados para a gaiola depois que eles recuperarem o movimento normal. Repita o procedimento até que todos os camundongos tenham sido injetados. A injeção viral intraventricular bem-sucedida produz resultados generalizados e robustos.A expressão neuronal, as construções gênicas fluorescentes do tomate YFP ou TD foram empacotadas em um V oito e injetadas nos ventrículos laterais de camundongos neonatais. Altos títulos virais resultaram em marcação densa do bulbo olfatório, estriado, córtex cerebral, hipocampo e cerebelo. A marcação também foi aparente nos neurônios de purkinje cerebelares, mas notavelmente ausente nos neurônios granulares cerebelares que ainda não estão presentes em grande número no dia zero pós-natal, a injeção de menos partículas virais resultou em marcação esparsa e expressão de menor intensidade.Usar AA V oito dentro de uma faixa de concentração entre 10 a sétima e 10 a 10ª partículas por é uma maneira fácil e confiável de controlar o grau de mosaicismo transgênico produzido por injeção. Vários transgenes podem ser expressos pela co-injeção de dois ou mais vírus. A injeção de Co de dois vírus empacotados no mesmo sorotipo influencia a transdução resultante para populações neuronais sobrepostas, de modo que muitas células expressam ambos os transgenes em concentrações mais baixas.Os padrões de expressão tornam-se mais independentes e a porcentagem de células marcadas com co é diminuída. A expressão não sobreposta também pode ser alcançada pela injeção de diferentes sorotipos a a v co injeção de AAV um e AAV oito. A codificação de repórteres fluorescentes distintos produz um padrão amplamente independente de mosaicismo dual, uma vez dominado.Essa técnica pode ser concluída em cinco a 10 minutos por neonato, se feita corretamente.

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