Injection Viral intracerebroventricular do Neonatal do rato do cérebro para a transdução neuronal persistente e generalizada

O objetivo geral deste procedimento é transduzir neurônios viralmente em todo o cérebro. Isso é realizado por crioanestesia de filhotes recém-nascidos, seguida pela transferência do recém-nascido para o estágio resfriado para injeção. Em seguida, identifique o local da injeção para atingir os ventrículos laterais entre a sutura Lambda e cada olho ou lateral da sutura sagital a meio caminho entre Lambda e Bgma.

A etapa final é inserir a agulha na profundidade correta e infundir lentamente até dois microlitros de solução viral no ventrículo lateral de cada hemisfério. Em última análise, uma marca fluorescente ou imunofluorescência para o gene de interesse é usada para mostrar o padrão de expressão do transgene resultante da injeção intraventricular. Geralmente, os indivíduos novos nessa técnica terão dificuldade em direcionar com precisão os ventrículos laterais.

Esta técnica é demonstrada tanto por injeção intracraniana à mão livre quanto por injeção estereotáxica, demonstrando que a técnica à mão livre será outro pós-doutorado em meu laboratório. Para começar, prepare uma seringa de injeção de 10 microlitros com uma agulha de calibre 32 para recém-nascidos gerais no dia zero pós-natal. Em seguida, coloque uma pequena placa de alumínio no gelo para esfriar e coloque um lenço seco em cima da placa para proteger a pele do filhote do metal frio.

Isso serve como uma superfície plana e fria para anestesiar e injetar os filhotes. Em seguida, prepare uma almofada de aquecimento adequada para manter os camundongos recém-nascidos aquecidos antes e depois da injeção. Assim que os filhotes recém-nascidos começarem a mamar, remova aproximadamente metade deles da gaiola e deixe a outra metade com a mãe.

Coloque os filhotes coletados na almofada de aquecimento enquanto aguarda a injeção. Transfira um filhote da almofada de aquecimento para a placa de metal fria para induzir a hipotermia. Anestesia. Aguarde de dois a três minutos para que o filhote fique totalmente anestesiado.

Confirme a anestesia apertando suavemente uma pata e monitore a falta de movimento ou respiração gratuitamente. A injeção intracraniana manual carrega cinco microlitros de vírus adeno-associado diluído, ou um AV com 0,05% de azul Trian na seringa de injeção. Limpe suavemente a cabeça do filhote anestesiado com um cotonete embebido em etanol 70%.

Identifique os locais de injeção a dois quintos da distância da sutura lambda a cada olho e o local de injeção alternativo está localizado a aproximadamente 0,8 a um milímetro lateral da sutura sagital a meio caminho entre Lambda e Bgma. Esses pontos de referência são visíveis através da pele no dia zero pós-natal. Marque o local da injeção com uma caneta de laboratório não tóxica.

Segure a seringa com uma escala visível para monitorar o volume da solução dispensada. Certifique-se de que o polegar possa alcançar o topo do êmbolo. Em seguida, remova o polegar do êmbolo enquanto posiciona a agulha.

Para evitar a distribuição acidental do vírus, coloque o filhote de lado com a cabeça diretamente sob a seringa. Gire a cabeça do P'S de modo que o local de injeção marcado fique voltado para cima e suavemente, mas com firmeza. Mantenha esta posição com a mão aberta.

Segure a seringa perpendicularmente à superfície do crânio e insira a agulha no local de injeção marcado a uma profundidade de aproximadamente três milímetros. Injete a agulha até que a resistência diminua ligeiramente, indicando que a agulha penetrou no ventrículo lateral. Comece a injetar lentamente o vírus enquanto monitora o volume dispensado da seringa.

Administre um volume máximo de dois microlitros no ventrículo. Retire lentamente a agulha. Deixe o primeiro local de injeção fechar antes de injetar o outro hemisfério.

Se a agulha estiver na posição correta, o corante se espalhará para preencher o ventrículo. Resfrie o estágio neonatal entre quatro e oito graus Celsius adicionando 100% de etanol e gelo seco ao reservatório. Na extremidade frontal do bloqueio do bloco.

Mantenha a temperatura acima de um grau Celsius para evitar queimaduras nos filhotes. Carregue cinco microlitros de AAV diluído com 0,05% de azul triano na seringa de injeção segurada pelo manipulador estereotáxico. Mais tarde, coloque suavemente a cabeça do filhote entre as barras auriculares da estrutura neonatal.

Certifique-se de que a cabeça esteja nivelada no eixo Y, verificando se a linha entre lambda e Bgma é paralela ao palco. Certifique-se de que a cabeça esteja nivelada no eixo x, verificando se uma linha imaginária entre as orelhas ou uma linha entre os olhos é paralela ao palco. Limpe suavemente a cabeça do filhote anestesiado com um cotonete embebido em etanol a 70%.

Em seguida, use o manipulador estereotáxico para posicionar a seringa acima de Lambda e zero. As coordenadas x e y. Mova os braços estereotáxicos para uma posição 0,8 milímetros lateral e 1,5 milímetros anterior à sutura lambda ou filhotes padrão pós-natal dia zero abaixe lentamente a agulha no local da injeção.

A superfície do crânio recuará e depois se soltará. Uma vez que a agulha tenha penetrado na pele, retraia a agulha até que o crânio recupere sua forma côncava normal, mas mantenha o chanfro da agulha sob a pele zero. A coordenada Z neste ponto.

Insira a agulha até que Z seja igual a menos 1,7 milímetros e, em seguida, retraia para menos 1,5 milímetros. Injete lentamente o vírus. Cada hemisfério pode aceitar até dois microlitros de solução.

Mantenha a seringa no lugar durante 30 a 60 segundos após completar a injeção e, em seguida, retraia lentamente a agulha durante um a dois minutos. Repita para o hemisfério contralateral usando coordenadas negativas no eixo x para o local da injeção. Depois de completar as injeções em ambos os hemisférios, coloque o filhote de volta na almofada de aquecimento até que a temperatura corporal e a cor da pele voltem ao normal e o filhote comece a se mover.

Em seguida, remova os filhotes injetados restantes para a almofada de aquecimento e retorne os filhotes injetados para a gaiola depois que eles recuperarem o movimento normal. Repita o procedimento até que todos os camundongos tenham sido injetados. A injeção viral intraventricular bem-sucedida produz resultados generalizados e robustos.

A expressão neuronal, as construções gênicas fluorescentes do tomate YFP ou TD foram empacotadas em um V oito e injetadas nos ventrículos laterais de camundongos neonatais. Altos títulos virais resultaram em marcação densa do bulbo olfatório, estriado, córtex cerebral, hipocampo e cerebelo. A marcação também foi aparente nos neurônios de purkinje cerebelares, mas notavelmente ausente nos neurônios granulares cerebelares que ainda não estão presentes em grande número no dia zero pós-natal, a injeção de menos partículas virais resultou em marcação esparsa e expressão de menor intensidade.

Usar AA V oito dentro de uma faixa de concentração entre 10 a sétima e 10 a 10ª partículas por é uma maneira fácil e confiável de controlar o grau de mosaicismo transgênico produzido por injeção. Vários transgenes podem ser expressos pela co-injeção de dois ou mais vírus. A injeção de Co de dois vírus empacotados no mesmo sorotipo influencia a transdução resultante para populações neuronais sobrepostas, de modo que muitas células expressam ambos os transgenes em concentrações mais baixas.

Os padrões de expressão tornam-se mais independentes e a porcentagem de células marcadas com co é diminuída. A expressão não sobreposta também pode ser alcançada pela injeção de diferentes sorotipos a a v co injeção de AAV um e AAV oito. A codificação de repórteres fluorescentes distintos produz um padrão amplamente independente de mosaicismo dual, uma vez dominado.

Essa técnica pode ser concluída em cinco a 10 minutos por neonato, se feita corretamente.