Name: Sondagem de alta densidade microarrays proteína funcional para detectar interacções proteína-proteína (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Aprenda a identificar interações proteína-proteína em larga escala usando microarrays de proteínas funcionais. Este método permite analisar milhares de interações simultaneamente de forma não enviesada.

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do NIH. Os ensaios mostrados na Figura 1 foram realizados pelo Dr. Joseph Fasolo. Agradecemos ao Dr. Rui Chen pelos comentários úteis.

1. Preparação Probe <ol><li> Cultura e purificar as sondas V5-quinase de fusão usados ​​para examinar as interacções com outras proteínas, como segue: <ol><li> Use recém-riscado estirpe Y258 levedura (MATa pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112) contendo proteína V5-fusão (expressa a partir pYES-DEST52 vetor gateway). Use a proteína isolada como sonda sobre os microarrays. A chapa completa de levedura-uracilo sintético (Sc-Ura) / 2% de dextrose / Agar e crescer a 30 ° C durante 3 dias de cultura congelada (-80 ° C em glicerol). </li><li> Inocular culturas de arranque (5-20 ml) a partir de uma única colônia e crescer durante a noite em Sc-Ura / 2% de dextrose em plataforma de agitação (220-250 rpm) ou roda a 30 ° C. </li><li> Na manhã seguinte, inocular 400 ml de SC-ura / 2% de rafinose cultura com cultura fermento suficiente para um OD 600 de 0,1 definitiva. </li><li> Cresça os inóculos para DO600 de 0,6, seguido pela indução de galactose do fu V5-cinasesion construção de expressão por adição de uma solução de extracto de levedura 3x / Peptona (YEP) suplementado com 6% de galactose, através da adição de suficiente para diluir o meio de indução por um factor de 3 de modo a que a concentração final de 2% de galactose é. </li><li> Induzir as células a 30 ° C durante 6 horas na mesa vibratória. Usar um balão de Erlenmeyer de 2 L para garantir arejamento adequado. </li><li> Células colheita utilizando um JA-10 (ou equivalente) do rotor de fiação de 400 ml de suspensão de células a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Lavar as células uma vez com 50 ml de tampão gelado PBS e transferir para um tubo de 50 ml. Lave o pellet novamente em tampão PBS frio gelo (sem detergentes ou outros aditivos) utilizados para a lise e transferência de 2 ml snap-cap tubos para a lise. </li><li> Rodar as células a 20.000 xg durante 1 min a 4 ° C, a uma pelete e a pipeta de distância tampão. </li><li> Coloque os tubos em gelo e continue com a etapa de lise. </li><li> Lisar as células (pelete de 250-350 uL) com 00,5 milímetros esferas de zircónia em um 1: 1: 1 de volume de sedimento celular, os grânulos, e solução salina tamponada com fosfato (PBS) de tampão de lise e vórtice a mistura utilizando uma plataforma de agitação 3 vezes em intervalos de 2 min a 4 ° C. </li><li> Centrifugar o lisado a 20.000 x g numa microcentrífuga mesa durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Pipeta sobrenadante para um tubo de centrífuga de policarbonato de alta velocidade e por esclarecer ulracentrufugation durante 30 minutos a 150.000 x g a 4 ° C. </li><li> Transferir o lisado clarificado para um tubo contendo resina de afinidade de Ni 2+ pré-lavada (~ 100 mL) e incuba-se em um nutator durante 2 horas a 4 ° C para capturar Histidina (His) 6X com etiquetas V5-proteína de fusão. </li><li> Lavou-se a resina três vezes durante 10 min a 4 ° C com tampão de lavagem. Pellet da resina utilizando uma centrífuga de topo de mesa durante 5 min a 1000 xg, a 4 ° C e aspirar o sobrenadante. Adicionar tampão de lavagem fresca para cada lavagem e devolver o tubo do nutator para a agitação durante a lavagem. </li><li> Após a lavagem steps estão completos, aplicar a resina é lavada para uma nova coluna G-25 para a eluição. </li><li> Aplicar 25 ul de tampão de eluição de uma forma passo a passo começando com imidazole 100 mM a 500 mM de imidazole em incrementos de 50 mm, para um total de 9 fracções. </li><li> Ensaio das fracções recolhidas utilizando gel de dodecilsulfato de sódio poliacrilamida (SDS-PAGE) e coloração com Coomassie para identificar a fracção (s) mais altamente enriquecida para utilização no ensaio e adicionar glicerol a 30% e armazenar a -80 ° C até serem usadas no ensaio. </li></ol></li></ol> 2. Sondagem os Arrays NOTA: Por favor consulte o passo 2.6 desta seção para preparar a solução de anticorpos antes de iniciar o ensaio. <ol><li> Para detectar interacções, dilui-se o conjugado anticorpo-V5 fluoróforo (isto é AlexaFluor 647) a 260 ng / ml em tampão de sonda e homogeneizar por agitação. NOTA: Preparar esta solução de anticorpo 30 minutos antes da utilização e colocar o tubo sobre um nutatou ou roda para assegurar a mistura completa e uma suspensão homogénea de anticorpo. </li><li> Dilui-se a sonda de proteína V5-fusão numa gama de concentrações de 5-500 ug / ml. NOTA: optimizada para cada ensaio de interacção proteína-proteína, usando tampão de sonda. Optimization envolve a adição de mais sondas para sondar buffer. Tipicamente, 10 ug / ml é utilizada como ponto de partida e ajustado em conformidade com base na intensidade do sinal. </li><li> Remover os microarrays da proteína a partir do congelador (-20 ° C) e trazer a 4 ° C no frigorífico imediatamente antes da utilização. </li><li> Adicionar tampão de bloqueio directamente para o porta-lâminas contendo as proteínas micorarrays e cobrir o topo com parafilme para evitar fugas. Bloquear as matrizes em tampão de bloqueio durante 1 hora, agitando a 50 rpm em uma fase, a 4 ° C. </li><li> Após o bloqueio, as matrizes de transferência para uma câmara humidif içada arrefecida a 4 ° C, e adicionar 90 ul de sonda diluída directamente para a superfície da matriz. Overlay o arrays com um deslizamento levantador levantada e incubar estático (sem agitação) na câmara humidificada a 4 ° C durante 1,5 h. </li><li> Lavam-se as matrizes de três vezes durante 1 min cada em tampão de sonda em três tubos de 50 mL cónicos. Adicionar o slide para tubos cônicos contendo tampão sonda pré-refrigerados suficiente para envolver completamente o slide. Permitir que o deslizamento levantador para deslizar suavemente fora do microarray proteína (não forçá-lo, pois isso pode resultar em danos à superfície da matriz). </li><li> Aplique a solução de anticorpo diretamente a matriz imediatamente após a conclusão da lavagem (passo 2.5) e sobreposição com um deslizamento levantador criado como antes. Incubar as matrizes durante 30 min a 4 ° C na câmara humidificada. </li><li> Execute o mesmo passo de lavagem como anteriormente (3 vezes 1 min em tampão de sonda), e centrifugação num tubo de 50 ml a 800 xg numa centrifugadora de mesa, durante 5 min à temperatura ambiente. Secar as matrizes em um suporte de slides no escuro por 30 minutos antes de a digitalização da matriz em 647 nm. </li></ol>

<ol><li>Fasolo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+protein+kinase+interactions+identified+by+protein+microarrays+reveal+novel+connections+between+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes.</a> Genes. 25, 767-778 (2011).</li>
<li>Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProCAT%3A+a+data+analysis+approach+for+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays.</a> Genome biology. 7, R110(2006).</li>
<li>Breitkreutz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+protein+kinase+and+phosphatase+interaction+network+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast.</a> Science. 328, 1043-1046 (2010).</li>
<li>Gavin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+yeast+proteome+by+systematic+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes.</a> Nature. 415, 141-147 (2002).</li>
<li>Jeong, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+monospecific+monoclonal+antibodies+using+a+human+proteome+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).</li>
<li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440, 637-643 (2006).</li>
<li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293, 2101-2105 (2001).</li>
<li>Ptacek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+phosphorylation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein phosphorylation in yeast.</a> Nature. 438, 679-684 (2005).</li>
<li>Haab, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+arrays+in+cancer+research.+Molecular+%26+cellular+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Antibody arrays in cancer research. Molecular & cellular proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (4), 377-383 (2005).</li>
<li>Kopf, E., Zharhary, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+arrays--an+emerging+tool+in+cancer+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 39, 1305-1317 (2007).</li>
<li>Berrade, L., Garcia, A. E., Camarero, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarrays%3A+novel+developments+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">Protein microarrays: novel developments and applications.</a> Pharmaceutical research. 28, 1480-1499 (2011).</li>
<li>Balboni, I., Limb, C., Tenenbaum, J. D., Utz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+microarray+surfaces+and+arraying+parameters+for+autoantibody+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of microarray surfaces and arraying parameters for autoantibody profiling.</a> Proteomics. 8, 3443-3449 (2008).</li>
<li>Gelperin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes & development. 19, 2816-2826 (2005).</li>
<li>Fasolo, J., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein microarrays.</a> Methods Mol. Biol. 548, 209-222 (2009).</li>
<li>Im, H., Snyder, M., et al. Preparation of recombinant protein spotted arrays for proteome-wide identification of kinase targets. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIm%2C+H+%22Current+protocols+in+protein+science%22">Current protocols in protein science</a>. Coligan, J. E. 27, Unit 27 24(2013).</li>
<li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science. 289, 1760-1763 (2000).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O protocolo apresentado foi inicialmente realizada usando 85 proteínas de fusão de cinase-V5 únicas proteínas de levedura para comparar a actividade de ligação entre as famílias distintas e relacionadas de proteína-quinases de levedura, resultando na identificação de novas redes de interacção quinase in vivo 1. Como uma tecnologia de criação de perfil proteômica emergentes, o desenvolvimento de Alto Rendimento (HTP) rastreio de proteomas usando microarrays da proteína contavam com bibliotecas de pépt...

A necessidade de se realizar análises globais de bioquímica de proteínas e actividade in vivo de ligação resultou no desenvolvimento de novos métodos para perfilar as interacções proteína-proteína (IBP) e as modificações pós-traducionais de proteomas inteiros 1,3-8. Microarrays da proteína são fabricados como microarrays funcionais de proteínas utilizando proteínas funcionais full-length 4-6,8,9, ou microarrays da proteína analíticas contendo anticorpos 10,11. Eles foram concebidos para conter uma elevada densidade de proteínas dispostas em lâminas de microscópio com uma variedade de químicas de superfície para facilitar uma variedade de condições experimentais necessários para a realização de uma ampla análises bioquímicas 12. Nitrocelulose e de superfície aldeído químicas para fixação química através de métodos de lisina ou de fixação de afinidade, tais como lâminas de quelatos de níquel para a fixação de proteínas His-tag e glutationa para fixação afinidade entre outros 13. </p&gt; A utilização de microarranjos de proteínas funcionais para detectar interacções proteína-proteína requer acesso a uma biblioteca de proteínas de alta qualidade funcional 14. S. cerevisiae é favorável à produção de uma tal biblioteca através do emparelhamento de afinidade de elevada cópia etiquetados com construções de proteínas de alto rendimento técnicas de purificação cromatográfica. A grande maioria do genoma da levedura foi sequenciado e quase todo o proteoma pode ser expresso a partir de um plasmídeo de elevado número de cópias para a purificação e análises bioquímicas 12. Uma vez que as proteínas são obtidas e dispostos em formato de 384 poços, eles são impressas em uma lâmina de microscópio permitindo a análise bioquímica rápida paralelo multi-paramétricos e interrogatório bioinformática 8,14-16. Protein microarrays foram utilizadas para ensaios enzimáticos e interacções com proteínas, lípidos, moléculas pequenas, e ácidos nucleicos, entre muitas outras aplicações. A acessibilidade de proteínas na superfície de proteomamatrizes de torná-los passíveis de diferentes tipos de detecção analítica, incluindo imuno-afinidade, Surface Plasmon Resonance, fluorescência e muitas outras técnicas. Além disso, permite o controle preciso da condição experimental, onde ele pode ser difícil de fazer in vivo. O objectivo deste protocolo é para demonstrar o uso apropriado de microarrays de proteína funcionais para detectar interacções proteína-proteína. Esta aplicação permite a análise bioquímica paralela de alta taxa de transferência de actividades de ligação de proteínas utilizando uma substância altamente purificado (proteína) de interesse. Um C-terminal (C-terminal) com a etiqueta de proteína isco V5-fusão de interesse é produzida a partir de um plasmídeo de elevado número de cópias numa estirpe de levedura optimizado para a purificação de proteínas. Marcação de C-terminal assegura que a proteína de comprimento completo foi traduzido. A proteína utilizada no presente estudo é Tda1-V5 proteína de fusão de cinase, que é purificado utilizando resina de afinidade de níquel através de uma marcação His6X. A construç fusão Tda1-V5t é purificado através de eluição em série, utilizando um gradiente de imidazole para eluir a fracção mais altamente enriquecida para uso no ensaio.

<table><tbody><tr><td>Placas de Petri</td><td>VWR</td><td>NC-10747</td><td>ou extrato de</td></tr><tr><td>levedura Bacto</td> comparável <td>Difco</td><td>0217-17</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptona</td><td>Difco</td><td>0118-17</td><td></td></tr><tr><td>Ágar Bacto</td><td>Difco</td><td>0140-01</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>Rafinose</td><td>Sigma</td><td>R0514</td><td></td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Sigma</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>Sc-Ura drop out media</td><td>MP Bio 114410622</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultura pequenos</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer grande Frasco</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor JA-10</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga (500 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo Falcon (50 ml)</td><td>VWR/Fisher</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>PBS Tablets</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep Tubes (tubo de tampa de rosca de 2 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máquina FastPrep</td><td>MP Biomedicals</td><td>116004500</td><td></td></tr><tr><td>Zircon Beads</td><td>BioSpec</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>TDT</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol (pH = 7,4)</td><td>Sigma</td><td>I5513&nbsp;</td><td></td></tr> Coquetel Inibidor Completo <tr><td>PMSF</td><td></td><td>Sigma 93482</td><td></td></tr><tr><td>(Livre de EDTA)</td> <td>Coquetel Inibidor</td> de Fosfatase <td>Roche 11873580001</td><td></td></tr><tr><td>1</td><td>sigma</td><td>P2850</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A1852</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora Agitada (30 &deg; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Resina de Afinidade de Níquel</td><td>Life Technologies</td><td>R901-01</td><td></td></tr><tr><td>G25 coluna</td><td>GE ciências da vida</td><td>27-5325-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>VWR / Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Gel (NuPage)</td> <td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue Stain</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo V5 monoclonal</td><td>Life Technologies</td><td>R960-25</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 Tagged anticorpo V5 monoclonal</td><td>Life Technologies</td><td>451098</td><td></td></tr><tr><td>Microarrays de proteínas Kit</td><td>Life Technologies</td><td>PAH0525013</td><td></td></tr><tr><td>Genepix Scanner</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lifter Slips</td> Tampão <td>http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/</td> Lisis <td>Thomas Scientific</td><td></td></tr><tr><td>: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Coquetel completo de inibidor de protease &ndash; Inibidor de fosfatase sem EDTA Coquetel 1, 1 mM PMSF&nbsp; (adicione antes de usar)</td><td></td><td></td><td>Adicione os reagentes a 1x PBS (tampão fosfato 0,01 M, cloreto de potássio 0,0027 M, cloreto de sódio 0,137 M; pH 7,4) para obter o volume desejado de solução de lise</td></tr><tr><td>Tampão de bloqueio: albumina de soro bovino (BSA) a 1%, Tween-20</td><td></td><td></td> a 0,1% <td>Adicione os reagentes a 1x PBS para obter o volume desejado de tampão</td></tr> <tr><td>de bloqueioTampão de sonda: 2 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 0,05% Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 &mu; M ATP (para quinases), 1% BSA</td><td></td><td></td><td>Adicione o reagente a 1x PBS para obter o volume desejado de tampão de sonda</td></tr><tr><td>Tampão de lavagem: 0,1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 50 mM de imidazol (pH 7,4), 2 mM MgCl2</td><td></td><td></td><td>Adicione o reagente a 1x PBS para obter o volume desejado de tampão</td></tr> <tr><td>de sondaTampão de eluição: 0,1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 - ndash; 500 mM de imidazol (pH 7,4), coquetel completo de inibidores de protease &ndash; Coquetel 1, inibidor de fosfatase sem EDTA, 1 mM PMSF (adicione antes de usar)</td><td></td><td></td><td>Antes de começar, é importante observar o gradiente de concentração de imidazol (50 - 500 mM) e criar tubos separados para cada concentração (é aconselhável criar o intervalo usando incrementos de 50 mM). Adicione o reagente a 1x PBS para obter o volume desejado de tampão de sonda</td></tr><tr><td>3x YEP +6% galactose: Dissolva 30 g de extrato de levedura e 60 g de peptona em 700 ml de H2O, e autoclave. Adicione 300 ml de galactose 20% esterilizada por filtro (peso/vol)</td><td></td><td></td><td>&nbsp; A galactose não deve ser autoclavada</td></tr></tbody></table>

sondagem de alta densidade microarrays proteína funcional para detectar interacções proteína-proteína

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Microarrays proteicos funcionais de alta densidade contendo ~ 4200 proteínas de levedura recombinantes são examinados para interacções proteína-proteína-quinase, utilizando uma proteína de fusão purificada por afinidade, de levedura de quinase contendo uma etiqueta de epitopo-V5 para read-out. Quinase purificada é obtida através da cultura de uma estirpe de levedura optimizado para a produção de proteínas de cópias elevado contendo um plasmídeo contendo uma fusão de quinase-V5 construir sob um promotor GAL indutível. A levedura é cultivada em meios restritiva com uma fonte de carbono neutro durante 6 horas, seguido por indução com galactose a 2%. Em seguida, a cultura é colhida e quinase é purificado usando técnicas cromatográficas padrão de afinidade para se obter uma proteína-quinase de elevada pureza para utilização no ensaio. A quinase purificada é diluída com tampão de quinase de um conjunto adequado para o ensaio e os microarrays da proteína estão bloqueados antes da hibridação com o microarray da proteína. Após a hibridação, as matrizes são sondados com V5 monoclonal ANTIBody para identificar proteínas ligadas pela proteína cinase-V5. Finalmente, as matrizes são digitalizados utilizando um scanner de microarray padrão, e os dados são extraídos para a análise informática jusante 1,2 para determinar uma confiança elevada conjunto de interacções de proteínas a jusante para validação in vivo.

A actividade de interacção proteína-proteína foi observada usando um leitor de chip padrão para avaliar a Tda1-V5 proteína quinase construção de fusão como uma proteína de isco contra um microarray proteico funcional levedura contendo aproximadamente 4200 único S. proteínas de fusão com GST cerevisiae. Além disso interrogatório com o software GenePix revelou uma infinidade de eventos de diferentes intensidades de ligação. A afinidade foi medida a partir da intensidade do sinal graduada derivado de um a...

Utilizando microarrays de proteína que contêm quase toda a S. cerevisiae proteoma é sondado para um rápido interrogatório imparcial de milhares de interações proteína-proteína em paralelo. Este método pode ser utilizado para a molécula de proteína-pequena, a modificação pós-traducional, e outros ensaios in high-throughput.

Sondagem de alta densidade microarrays proteína funcional para detectar interacções proteína-proteína

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar proteínas, interações proteicas dentro de um determinado proteoma de maneira paralela e imparcial, o que não é possível com outras tecnologias. Isso é feito pela primeira hibridização e proteína marcada com epítopo de interesse com uma biblioteca de proteínas funcionais altamente purificada e de comprimento total depositada em um plano de coordenadas na superfície de uma lâmina de microscópio. Uma vez que a proteína tenha atingido o equilíbrio com cada uma de suas respectivas proteínas-alvo na matriz, a fração não ligada é lavada e as interações proteicas são detectadas com um anticorpo monoclonal para o epítopo conjugado a uma porção fluorescente usando um scanner de microarray padrão.As imagens resultantes são entrelaçadas com informações sobre a intensidade de cada característica em relação à proteína ligada e ao sinal fluorescente. Essas informações são extrapoladas com o auxílio do software de análise de microarray para gerar uma lista de valores de intensidade para cada recurso no array. As informações sobre o par de interação proteína-proteína podem ser exportadas para o software de análise bioinformática downstream para pont

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Biologia

Este vídeo mostra experimentos com posterior análise de interações proteína-proteína através da utilização de micro-padrão superfícies. A abordagem oferece a possibilidade de detectar as interações de proteínas em células vivas e combina alta capacidade de processamento com a possibilidade de extrair informações quantitativas.

In vivo Detecção de interações proteína-proteína em Micro-padrão Superfícies

Neste estudo, nós descrevemos um protocolo melhorado para um microarray anticorpo multiplexado de alto rendimento com o método de detecção de lectina que pode ser usado em perfil de glicosilação de proteínas específicas. Este protocolo apresenta novos reagentes fiáveis ​​e reduz significativamente o tempo, custo e requisitos de equipamento de laboratório, em comparação com o procedimento anterior.

Microarray de anticorpos quimicamente bloqueada para Multiplexed perfil de alta capacidade de glicosilação proteína específica em amostras complexas

Este vídeo demonstra uma técnica que usa peptídeos de penetração de células biotiniladas para detectar interações proteína-proteína intracelular. Os peptídeos que penetram nas células facilitam a entrada do peptídeo conjugado em uma célula e se ligam especificamente às suas proteínas de interação. A biotina, após se ligar à avidina, permite a purificação do complexo de proteínas que interagem a partir de um lisado celular.

Sonda de peptídeo penetrante de células biotiniladas para detectar interações proteína-proteína

Experimentos de imunoprecipitação SILAC representar um poderoso meio para descobrir nova proteína: interações protéicas. Ao permitir que a quantificação relativa exacta da abundância de proteína em ambas as amostras de controlo e de ensaio, os verdadeiros interacções podem ser facilmente distinguidos dos contaminantes experimentais, e interacções de baixa afinidade preservado através da utilização de condições de tampão menos rigorosas.

Identificação de parceiros de interação de proteínas em células de mamíferos utilizando SILAC-imunoprecipitação quantitativos Proteômica

A triagem de matriz de peptídeos é um ensaio de alto rendimento para identificar locais de interação proteína-proteína. Isso permite mapear várias interações de uma proteína-alvo e pode servir como um método para identificar locais para inibidores que têm como alvo uma proteína. Aqui descrevemos um protocolo para triagem e análise de matrizes de peptídeos.

A identificação da proteína-proteína Locais de interacção Usando Peptide Arrays

As proteínas interagem entre si e essas interações determinam em grande parte suas funções. Os parceiros de interação proteica podem ser identificados em alto rendimento in vivo usando um ensaio de aptidão de levedura baseado no ensaio de complementação de fragmentos de proteína diidrofolato redutase (DHFR-PCA).

Genome-wide proteína-proteína Interaction Triagem por proteína-fragmento de Complementação Assay (PCA) em células vivas

Aqui apresenta-se os protocolos para a purificação por afinidade de complexos de proteínas e a sua separação por PAGE nativa azul, seguido pelo perfil correlação protea utilizando espectrometria de massa quantitativo livre etiqueta. Este método é útil para resolver interactoma em complexos de proteínas distintas.

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Aqui, apresentamos um protocolo para tela extracelular da proteína microarrays para identificação de interações ligante-receptor romance em alta taxa de transferência. Também descrevemos um método para realçar a deteção de interações da proteína-proteína transiente usando complexos proteína-Microconta.

Tecnologia de Microarray da proteína extracelular para a deteção de alta taxa de transferência de interações ligante-Receptor de baixa afinidade

As proteínas do domínio J de cognato cooperam com a Chaperona HSP70 para auxiliar em uma infinidade de processos biológicos que vão desde a dobradura de proteínas até a degradação. Aqui, nós descrevemos um ensaio in situ da ligadura da proximidade, que permita a monitoração destas machineries transientemente formadas do acompanhante em bactérias, em fermento e em pilhas humanas.

Monitoração in situ de montagens moleculars formadas Transientemente do chaperone nas bactérias, no fermento, e nas pilhas humanas

Aqui, apresentamos um protocolo para permitir a captura e identificação de interações proteína-proteína específicas da doença de células e tecidos nativos usando sondas químicas e espectrometria de massa. Os conjuntos de dados de interação resultantes são analisados por meio de uma plataforma dedicada baseada na web para revelar disfunções de rede dinâmica e alterações de vias ligadas à doença.

Mapeando interações proteína-proteína disfuncionais na doença

Aprenda a identificar interações proteína-proteína em larga escala usando microarrays de proteínas funcionais. Este método permite analisar milhares de interações simultaneamente de forma não enviesada.

Sondagem de alta densidade microarrays proteína funcional para detectar interacções proteína-proteína

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