Sondagem de alta densidade microarrays proteína funcional para detectar interacções proteína-proteína

O objetivo geral deste procedimento é identificar proteínas, interações proteicas dentro de um determinado proteoma de maneira paralela e imparcial, o que não é possível com outras tecnologias. Isso é feito pela primeira hibridização e proteína marcada com epítopo de interesse com uma biblioteca de proteínas funcionais altamente purificada e de comprimento total depositada em um plano de coordenadas na superfície de uma lâmina de microscópio. Uma vez que a proteína tenha atingido o equilíbrio com cada uma de suas respectivas proteínas-alvo na matriz, a fração não ligada é lavada e as interações proteicas são detectadas com um anticorpo monoclonal para o epítopo conjugado a uma porção fluorescente usando um scanner de microarray padrão.

As imagens resultantes são entrelaçadas com informações sobre a intensidade de cada característica em relação à proteína ligada e ao sinal fluorescente. Essas informações são extrapoladas com o auxílio do software de análise de microarray para gerar uma lista de valores de intensidade para cada recurso no array. As informações sobre o par de interação proteína-proteína podem ser exportadas para o software de análise bioinformática downstream para pontuar os dados específicos do recurso e identificar as interações proteína-proteína entre a proteína de interesse e as proteínas no microarray.

Os dados brutos de intensidade do sinal são compilados em dois ou mais microarrays de proteínas para levar em conta a variação inter e intra-ensaio, e os dados são normalizados para pontuar cada uma das interações. A saída resultante gera uma lista de alvos de proteínas que interagem, que pode ser usada para orientar a interrogação adicional das interações proteína-proteína. O microarray de proteínas funcionais in vivo foi desenvolvido no laboratório de Michael Snyder há mais de 15 anos.

Desde então, houve muitas aplicações bem-sucedidas dessa tecnologia devido à sua versatilidade e ensaios proteômicos bioquímicos. Esta técnica facilita o estudo de interações proteicas e redes de sinalização modulares, bem como conectividade alternativa e cascatas de sinalização previamente conhecidas Para cultivar e purificar as sondas de quinase de fusão V cinco, use a cepa de levedura recém-listrada Y 2 58 contendo placa de proteína de fusão V cinco, a levedura em uracila completa sintética, ágar 2% dextrose e cresça a 30 graus Celsius por três dias a partir de cultura congelada. Inocular culturas iniciais de uma única colônia e crescer durante a noite em uracila sintética completa.

2% de dextrose em uma plataforma ou roda agitada a 30 graus Celsius. Na manhã seguinte, inocule 400 mililitros de um uracilo sintético completo. Cultura de 2% de rafinose com cultura inicial suficiente para atingir uma densidade óptica final de 600 nanômetros ou um OD 600 de 0,1.

Aumente os inóculos até um OD 600 de 0,6 e, em seguida, induza a expressão da construção de fusão V cinco quinase adicionando três x extrato de levedura suficiente. Tom estimulante suplementado com 6% de galactose para diluir o meio de indução por um fator de três ou uma concentração final de galactose de 2% Induza as células a 30 graus Celsius por seis horas em uma plataforma agitada. Utilizar um erlenmeyer de dois litros para assegurar um arejamento adequado.

Colha as células girando 400 mililitros da suspensão celular a 1000 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Lave as células uma vez com 50 mililitros de tampão PBS gelado e transfira para um tubo cônico de 50 mililitros. Lave o pellet novamente em solução salina tamponada com fosfato gelado ou tampão A PBS e transfira para tubos de tampa de encaixe de dois mililitros para lise.

Depois de girar as células a 20.000 vezes G por um minuto a quatro graus Celsius, remova o tampão com uma pipeta e coloque os tubos no gelo. Ligue as células com grânulos de zircônia de 0,5 milímetros em um volume de um para um de pellet celular para grânulos para lise PBS, tampão. Em seguida, vórtice a mistura três vezes usando uma plataforma de agitação por intervalos de dois minutos a quatro graus Celsius.

Centrifugue o lisado a 20.000 vezes, G em uma microfuga de mesa por 10 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o lisado clarificado para um tubo contendo aproximadamente 100 microlitros de resina de afinidade de níquel pré-lavada e incube em um nutato por duas horas a quatro graus Celsius. Para capturar a histamina, seis x marcados com V cinco proteínas de fusão granulam a resina usando uma centrífuga de mesa por cinco minutos a 1000 vezes G e quatro graus Celsius após a remoção do sobrenadante.

Lave a resina com tampão de lavagem por 10 minutos a quatro graus Celsius no mutador. Repita a lavagem mais duas vezes com tampão de lavagem fresco. Eluir as proteínas com dois volumes de 100 microlitros de 200 milimolares ole.

Adicione glicerol a uma concentração final de 30% das amostras e armazene a 80 graus Celsius negativos até ser usado no ensaio. Para detectar interações. Diluir o anticorpo conjugado V cinco fluoro quatro a 260 nanogramas por mililitro na sonda, tampão e misturar bem por agitação.

Em seguida, diluir a sonda de proteínas de fusão V cinco numa gama de concentrações de cinco a 500 microgramas por mililitro. Em seguida, remova os microarrays de proteínas do freezer e leve a quatro graus Celsius na geladeira antes de usar. Adicione o tampão de bloqueio diretamente ao suporte da lâmina contendo os microarrays de proteínas e cubra a parte superior com paraforma para evitar vazamentos.

Bloqueie as matrizes no buffer de bloqueio por uma hora agitando a 50 RP em um estágio a quatro graus Celsius. Após o bloqueio, transfira as matrizes para uma câmara umidificada, ladrilhada a quatro graus Celsius e adicione 90 microlitros de sonda diluída diretamente na superfície da matriz. Sobreponha as matrizes com um deslizamento de levantador elevado e incube sem agitar na câmara umidificada a quatro graus Celsius por uma hora e meia Após a incubação, adicione a lâmina a um tubo cônico de 50 mililitros contendo tampão de sonda pré-resfriado suficiente para envolver completamente a lâmina, permitindo que o deslizamento do levantador deslize suavemente para fora do microarray de proteínas.

Lave as matrizes três vezes por um minuto cada em três tubos cônicos. Aplique a solução de anticorpos diretamente na matriz imediatamente após concluir a lavagem e cubra com o deslizamento do levantador apagado. Como antes, incube as matrizes por 30 minutos a quatro graus Celsius na câmara umidificada.

Execute a mesma etapa de lavagem de antes e gire em um tubo cônico de 15 mililitros a 800 vezes G em uma centrífuga de mesa por cinco minutos. À temperatura ambiente, seque as matrizes ao ar em um suporte de lâminas no escuro por 30 minutos antes de escanear a matriz a 647 nanômetros. Neste experimento, a atividade de ligação do TDA um V cinco foi investigada.

Microarrays de proteínas de levedura manchados em duplicata com aproximadamente 4.200 proteínas de fusão GST de comprimento total foram incubados com o controle vetorial vazio ou com sondas TDA um V cinco. Os painéis inseridos comparam a região idêntica em ambas as matrizes. Digno de nota é o RIM 11, que curiosamente também foi identificado como um alvo fosforilado do TDA em um estudo publicado anteriormente.

Uma vez identificados os alvos, eles podem ser testados quanto à atividade bioquímica e funcional in vivo. Se você estiver assistindo a este vídeo, deverá ter uma melhor compreensão de como usar microarrays de proteínas funcionais como um meio de identificar interações de proteínas candidatas a proteínas para validação e interrogação in vivo adicionais.