Name: Murino Endoscopia para In Vivo Cura Multimodal imagem de Carcinogênese e Avaliação de Intestinal ferida e inflamação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Aprenda endoscopia murina para avaliação de carcinogênese, cicatrização de feridas e inflamação intestinal in vivo. Este método permite exames seriados e intervenções terapêuticas em modelos de câncer colorretal.

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Agradecemos Sonja Dufentester e Elke Weber para assistência técnica especializada. Agradecemos Faekah Gohar pela revisão do manuscrito e Stefan Brückner para suporte informática médica. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa interdisciplinar do Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A94). D. Bettenworth foi apoiado por uma bolsa de pesquisa da Faculdade de Medicina da Westfälische Wilhelms-Universität Münster. M. Brückner foi apoiado por uma &quot;Gerok&quot; posição de rotação da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB1009B8). Agradecemos Heike Blum para ilustração do desenho animado mouse.

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) de acordo com a Lei de Proteção de Animais alemão. 1. Materiais e montagem de experimento <ol><li> Cuidados com os animais <ol><li> Use feminino ou camundongos machos de qualquer tensão pesando 20 a 25 g e abrigá-los de acordo com a legislação cuidado animal local. </li><li> Alimentar ratos com comida para roedores e especial aplicar ração isenta de alfafa pelo menos três dias antes da fluorescência exames para minimizar endoluminal auto-fluorescência. </li><li> Fornecer autoclavado beber água ad libitum. </li></ol></li><li> A indução da colite induzida por DSS aguda <ol><li> Prepara-se uma 3% (w / v) de sulfato de sódio de dextrano (DSS, peso molecular: 36,000-50,000 Da) solução por dissolução de 3 g de DSS em 100 ml de água autoclavada. Oferecer esta solução como a água potável exclusiva para ad libitum camundongos e calcular 5 ml de solução por DSS-mouse / dia. Alimentação contcamundongos rol com água autoclavada sem DSS ad libitum 9. </li></ol></li><li> A indução de câncer colorretal <ol><li> Dissolver azoximetano mutagénicas (OMA) (CUIDADO Pode causar cancro e defeitos genéticos!) Em solução salina isotónica estéril para se obter uma concentração final de 1 mg / ml. Aplicar uma dose única de 10 mg por kg de peso corporal OMA intra-peritoneal com uma seringa de 1 ml (30 g) 10. </li><li> Camundongos desafio (excluindo os ratos de controle) com ciclos repetitivos de 3% (w / v) DSS do dia 0-7, dia 14-21, dia 28-35 e dia 42 a 49 de induzir inflamatória impulsionado cancerogenesis colorretal. Alimentar ratos com água esterilizada apenas entre esses desafios (ver Figura 4A por um cronograma detalhado). Alimentar ratos de controle em água esterilizada durante todo o experimento. </li></ol></li><li> Preparação de fluorescência endoscopia (FE) <ol><li> Use Fluorescein-Isothiocyanat (ITCF) - dextrano (peso molecular de 70.000 Da; FITC: glicose = 1: 250) para detecção de adenoma do cólon por realce visual de displasia associada padrão vascular. </li><li> Administrar 60 mg de dextrano conjugado com FITC diluído em 100 ul de PBS por via intravenosa 5 minutos antes da análise de fluorescência endoscópica. </li></ol></li><li> Anestesia <ol><li> Fornecer um suprimento contínuo para anestesia de isoflurano (1,5 LO 2 / min; 1,5-2% em volume de isoflurano [2-cloro-2-(difluorometoxi) -1,1,1-trifluoro-etano]). Use equipamentos especiais anestesia veterinária, com uma máscara para controlar firmemente a anestesia. </li></ol></li><li> Preparação de enema <ol><li> Instilar 2 ml de fluido de enema (conteúdo: hidrogenofosfato dissódico 1,5% (w / v) e di-hidrogenofosfato de sódio a 11% (w / v)) para o cólon, se se suspeita de significativa fecal que podem obscurecer a visão. </li></ol></li></ol> 2 Equipamento técnico <ol><li> Use uma estação de trabalho endoscópica veterinária que é desenvolvida e aprovada para o uso de animais pequenos endoscopia. Conecte o workstation para uma unidade de câmera, uma fonte de luz xenon, uma bomba de ar e um monitor convencional PC para luz branca endoscopia. Em seguida, conecte a câmera eo telescópio rígido em miniatura (diâmetro externo 1,9 milímetros, 10 cm de comprimento; Figura 5). </li><li> Use bainha endoscópio com canal de trabalho (Figura 5D) para a aplicação de pinça de biópsia ou tubo de injecção. Use a bainha sem canal de trabalho para colonoscopia diagnóstica. </li><li> Defina as configurações da fonte de luz para fluorescência endoscopia para excitar traçadores utilizado (por exemplo, 490 nm para dextrano FITC-conjugado). Além disso, a integração de um filtro de passagem de banda adequada entre o telescópio e a câmara (por exemplo, 525 nm para o dextrano conjugado com FITC). </li><li> Insira uma pinça de biópsia flexível (3, 28. Charr cm) através do canal de trabalho do endoscópio para obter biópsias. </li><li> Introduzir tubo de injecção flexível (0,96 mm), através do canal de trabalho para tópica, intramucosal ou Endoluminal umdministração de agentes de diagnóstico ou terapêuticos. </li><li> Use uma mesa de exame aquecida com uma temperatura de 42 ° C. Isso evita que os ratos se tornando hipotermia durante o exame. </li></ol> 3 Anestesia de Animais <ol><li> Coloque rato numa caixa à prova de fugas, mas pequena e administrar isoflurano (100% (v / v), 5% em volume, de 3 L / min). Espere até que o mouse perde a consciência. </li><li> Transferir o mouse sobre a mesa de exame de endoscopia. Continue inalação isoflurano via máscara facial com uma dose de 100% v / v, 1,5 vol%, 1,5 L / min. Sempre aplique pomada para evitar o ressecamento dos olhos e sob anestesia. </li><li> Avaliar a eficácia da anestesia, verificando os reflexos. Verifique a &#39;volta em torno do reflexo &quot;: se suficientemente anestesiado, um rato que coloca em suas costas não deve virar. Confira os &#39;pés reflex &quot;: quando a anestesia é adequado, macio apertando entre os dedos do animal não deve conduzir à retirada da perna (fase detolerância cirúrgico). </li></ol> 4. Colonoscopia <ol><li> Coloque rato anestesiado propenso / de costas na mesa de exame. </li><li> Administrar 2 ml de enema através de uma cânula abotoado no cólon se houver suspeita de acúmulo fecal significativo que pode obscurecer a visão. Espere por ratos para defecar após a administração do enema. Insira o endoscópio com muito cuidado para evitar a perfuração. </li><li> Abrir ambas as válvulas da bainha com um deles estar ligado à bomba de ar. Selar a outra válvula com o dedo indicador para dispensar o ar. Inflar cólon com ar, lentamente e com cuidado, em especial no caso de biópsia ou de injecção. </li><li> Avance endoscópio apenas até a articulação do cólon direito de evitar a perfuração (4-5 cm de ânus). </li><li> Colonoscopia diagnóstica <ol><li> Examine a mucosa por alterações inflamatórias ou malignas, enquanto puxa de volta o endoscópio. Puxar lentamente para avaliar toda a circunferência do intestino. Avaliar pa intraluminalthologies utilizando sistemas de pontuação estabelecidos apropriados necessários. </li><li> Para justificar a posição endoscópica idêntico para a aquisição de imagens durante as visualizações repetitivas das áreas das feridas, observe a distância entre o ânus murino ea lesão da mucosa. Além disso, utilizar a ponta da pinça de biópsia como um espaçador, para atingir a distância idêntica entre o endoscópio e a área da ferida durante a aquisição de imagem. O tamanho da ferida está relacionada com o tamanho da bainha de endoscópio, que é composta por 3 mm. NOTA: Coloque endoscópio em posição idêntica em comparação óptica com documentação fotográfica dos exames anteriores. Lesões de medidas no mesmo ângulo e distância em cada seguimento exame endoscópico. </li></ol></li><li> Procedimento de biópsia <ol><li> Tome biópsias com a ajuda de dois investigadores. Introduzir uma pinça de biópsia com cuidado através do canal de trabalho até que a ponta da pinça é visível no monitor para o segundo investigador. Fórceps Abra e feche com cuidado para aperfuração vazio. </li><li> Mover uma pinça para o local da patologia. </li></ol></li><li> Procedimento de injeção <ol><li> Executar um procedimento de injecção, com a ajuda de dois investigadores. Pré-enchimento do tubo flexível de injecção (0,96 mm) completamente com o agente a ser administrado. Empurre tubo através do canal de trabalho até que a cânula (30 G) é visível no monitor para o segundo investigador. Preparar seringa fino e suavemente administrar a quantidade de agente de diagnóstico ou terapêutico requerido. Os volumes de injecção deve ser de 50 máximo l. </li><li> Insira a agulha no submocosa em um ângulo de 15-30 graus. Encare o chanfro na direção da mucosa. A mucosa mostra um sinal de elevação característica após a injeção de sucesso. </li></ol></li><li> Fluorescência endoscopia (FE) <ol><li> Administrar 60 mg de dextrano conjugado com FITC diluído em 100 ul de PBS por via intravenosa antes fluorescência exame endoscópico. </li><li> Verifique o ponto de tempo ideal entre a injeção deo traçador fluorescente marcado e o procedimento de imagem o qual é dependente do traçador farmacologia. Configurar as definições de sistema de filtro de banda de acordo com o comprimento de onda de excitação e emissão do traçador utilizado. Realizar endoscopia para marcadores de fluorescência de volume de sangue não-específicos (por exemplo, FITC), imediatamente após a injecção intravenosa do corante fluorescente para avaliar o padrão vascular da superfície da mucosa. </li><li> Considere imaginando várias horas após a aplicação do traçador no caso dos marcadores direcionados ou &quot;sondas inteligentes&quot; para proporcionar uma melhor alvo para fundo de razão. </li><li> Realizar foto e vídeo-documentação dos resultados. </li></ol></li></ol> 5 Pós-colonoscopia <ol><li> Separe o rato em uma gaiola vazia e coloque-a sobre uma toalha de papel para proteger o mouse de aspiração de areia. Aqueça o mouse com uma lâmpada de luz vermelha para evitar a hipotermia. Observe o mouse e não deixe sem vigilância até que recuperou suficienteconsciência para manter decúbito esternal. Uma vez completamente consciente, coloque o mouse de volta para sua respectiva gaiola. </li><li> No final da experiência, o lugar do rato numa caixa à prova de fugas, mas pequena e administrar CO 2 (100% (v / v), 100% em volume, de 3 L / min). Espere até que o mouse perde a consciência completa e pára de respirar. Despacho do mouse por fratura do colo. Realizar laparotomia eo explantar cólon. Abra o cólon longitudinalmente e lavá-lo para posterior avaliação histológica ou molecular. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Cicatrização do epitélio é um processo contínuo. Esfoliação fisiológica contínua de células superficiais da mucosa gastrointestinal ocorre exigindo a regeneração frequente de células epiteliais 16. Consequentemente, a cicatrização de feridas prejudicada tem um imenso impacto sobre várias doenças, incluindo úlceras gastrointestinais e vazamento da anastomose 17 18. Avaliação da base molecular, assim como potenciais candidatos a medicamentos para estimular a cicatrização, só pode ser realizada de for...

Modelos animais têm muito enriquecido nossa compreensão de inúmeras patologias intestinais. O rato de laboratório (Mus musculus) surgiu como um modelo animal primordial na investigação biomédica devido à sua informação genética e genômica abundante e está prontamente disponível em linhagens transgênicas e mata-mata. Além de reforçar a compreensão patogênese da doença, modelos animais também são usados ​​principalmente para testar drogas candidatos, bem como intervenções diagnósticas ou terapêuticas pré-clínicos. No entanto, apesar da variedade de modelos de ratos, simulando a doença humana, muitas opções de diagnóstico e de intervenção que são rotineiramente usados ​​no tratamento do paciente não estão disponíveis para os ratos. Deste modo, as estratégias de vigilância para controlar o curso da doença de murino ou o efeito de intervenções terapêuticas são geralmente limitados para observações indirectas ou post mortem análises. Embora existam procedimentos não-invasivos para os ratos de monitoramento vitalidade como índices de atividade da doença, quantification de perda de peso ou ganho, sangue, urina e fezes análises, estas são apenas indicadores indiretos e são influenciados pela variabilidade inter-individual. Além disso, análises post mortem evitar observações longitudinais em momentos repetitivos. Técnicas de imagem sofisticados para monitorar a atividade da doença em camundongos só recentemente foram introduzidos 1,2. Embora essas técnicas de imagem permitem análises repetitivas, eles apenas fornecem uma visão descritiva e muitas vezes imprecisas sobre o intestino, não permitir a visualização da mucosa direta ou permitir intervenções diagnósticas ou terapêuticas, como a aquisição de biópsia ou aplicação tópica e intramucosal de candidatos a fármacos. Recentemente, os sistemas de endoscopia de alta resolução para utilização em ratos vivos foram desenvolvidos 3,4. Pela primeira vez, essas técnicas endoscópicas permitir a visualização direta de patologias de doenças do cólon endoluminal como cicatrização de feridas ou inflamação intestinal proporcionando objective estado, em tempo real, permitindo estudos longitudinais no mesmo animal em intervalos de tempo repetitivos. Além de permitir que as biópsias repetidas em um ratinho individual, sistemas de endoscopia também pode ser utilizado para influenciar terapeuticamente um tumor distinta ou inflamação localizada, permitindo a aplicação directa de uma substância para a área de interesse. Além disso, como substâncias terapêuticas e de controlo podem ser entregues directamente para a área de interesse, esta pode ser realizada no mesmo ratinho, não incluindo a variabilidade inter-individual. Estes sistemas de terem sido utilizadas para a avaliação da inflamação do cólon, cicatrização de feridas, biópsias hepáticas laparoscópicas e indução ortotópico de tumores hepáticos 8 e desenvolvimento do tumor através de vários sistemas de pontuação, tais como o índice endoscópica murino de gravidade da colite (MEICS) 5-7. MEICS consiste de cinco parâmetros para avaliar a inflamação: espessamento da parede do cólon, alterações do padrão vascular, presença de fibrina, a granularidade dos Mucossuperfície al, e fezes de consistência. Neste protocolo, descrevem o uso de endoscopia rígida em modelos murinos de cicatrização intestinal, inflamação e câncer de cólon. Em primeiro lugar, demonstrar a avaliação endoscópica da cicatrização e inflamação do cólon, bem como a avaliação longitudinal da atividade colite eo estudo da cancerogenesis no cólon murino. Além do uso descritivo da endoscopia murino, nós fornecemos instruções detalhadas sobre o uso de instrumentos endoscópicos para obter biópsias, bem como a aplicação tópica e intramucosal de diferentes componentes de interesse (por exemplo, candidatos a fármacos ou células tumorais). Finalmente, demonstramos a utilização de endoscopia fluorescência murino, que emprega técnicas sofisticadas de imagens moleculares, na definição de tumores colo-rectais.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagentes</td></tr><tr><td>Dieta sem alfafa</td><td>Harlan Laboritories, Madison, EUA</td><td>2014</td><td></td></tr><tr><td>Azoximetano (AOM)</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemanha</td><td>A5486</td><td></td></tr><tr><td>Pomada para os olhos Bepanthen</td><td>Bayer, Leverkusen, Alemanha</td><td>80469764</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de dextrano sódico (DSS)</td><td>TdB Consulatancy, Uppsala, Suécia</td><td>DB001</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemanha</td><td>E 4382</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemanha</td><td>E 9884</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 50 ml</td><td>BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Florene 100 V/V</td><td>Abbott, Wiesbaden, Alemanha</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemanha</td><td>HHS32-1L</td><td></td></tr><tr><td>Isopentano (2-Metilbutano)</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemanha</td><td>M32631-1L</td><td></td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>1159430025</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Tissue Tek compound&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sakura, Zoeterwonde, Holanda</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Omnican F - canula</td><td>Braun, Melsungen, Alemanha</td><td>9161502</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato, PBS</td><td>Lonza, Verviers, Bélgica</td><td>4629</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio 0,9%</td> <td>Braun, Melsungen, Alemanha</td><td>5/12211095/0411</td><td></td></tr><tr><td>Dieta padrão</td><td>Altromin, Lage, Alemanha</td><td>1320</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, Leiden, Holanda</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Vitro &ndash; Clusão&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>R. Langenbrinck, Teningen, Alemanha</td><td>04-0002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipamento</td></tr><tr><td>AIDA Control</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha</td><td>20 096020</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda</td><td>Semrock, Rochester, EUA</td><td>HC 716/40</td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda</td><td>Semrock, Rochester, EUA</td><td>HC 809/81</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de biópsia, 3 Fr., 28 cm</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha</td><td>61071ZJ</td><td></td></tr><tr><td>Dell Monitor</td><td>Dell, Frankfurt am Main, Alemanha</td><td>U2412Mb</td><td></td></tr><tr><td>Bainha de Exame, 9 Fr.Karl</td> <td>Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha</td><td>61029D</td><td></td></tr><tr><td>Bainha de Exame, 9 Fr.Karl</td> <td>Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha</td><td>61029C</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de Luz de Fibra Óptica, 3,5 mm</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha</td><td>69495NL</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceína Azul Sistema de Filtro</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha</td><td>20100032</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Barreira de Fluoresceína</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha</td><td>20100033</td><td></td></tr><tr><td>Pedal</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha</td><td>20010430</td><td></td></tr><tr><td>Telescópio HOPKINS, 1,9 mm, Comprimento 10 cm</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha</td><td>1830231</td><td></td></tr><tr><td>SCB D-light P&nbsp;</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha</td><td>20 133720</td><td></td></tr><tr><td>SCB tricam SL II</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha</td><td>20 2230 20</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de instrumentos de tubulação VETPUMP II</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha</td><td>69811</td><td></td></tr><tr><td>Tricam PDD PAL</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha</td><td>20221037</td><td></td></tr><tr><td>UniVet Porta</td><td>Groppler Medizintechnik, Deggendorf, Alemanha</td><td>BKGM 0451</td><td></td></tr><tr><td>Vetpump 2</td><td>Karl Storz - Endoskope, Tuttlingen, Alemanha</td><td>69321620</td><td></td></tr></tbody></table>

murino endoscopia para in vivo cura multimodal imagem de carcinogênese e avaliação de intestinal ferida e inflamação

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Modelos de mouse são amplamente utilizados para estudar patogênese de doenças humanas e para avaliar os procedimentos de diagnóstico, bem como intervenções terapêuticas pré-clínicos. No entanto, a avaliação válida de alterações patológicas, muitas vezes requer análise histológica, e quando realizado ex vivo, necessita de morte do animal. Portanto, em situações experimentais convencionais, exames de acompanhamento intra-individuais são raramente possível. Assim, o desenvolvimento de endoscopia de murino em ratinhos vivos investigadores permite pela primeira vez a ambos visualizar diretamente a mucosa gastrointestinal e também repetir o processo para a monitorização de alterações. Existem inúmeras aplicações para in vivo murino endoscopia, incluindo estudar inflamação intestinal ou cicatrização de feridas, a obtenção de biópsias da mucosa repetidamente, e localmente administrar agentes de diagnóstico ou terapêuticos em uso de cateter de injeção em miniatura. Mo de diagnóstico por imagem, mais recentemente, a imagem molecular tem estendidodalidades permitindo a detecção específica de moléculas alvo específicas distintas, usando as fotossondas. Em conclusão, a endoscopia murino surgiu como uma nova tecnologia de ponta para o diagnóstico experimental in vivo de imagens e pode ter um impacto significativo em pesquisas pré-clínicas em vários campos.

Na monitorização in vivo da cicatrização do intestino Durante a endoscopia de rotina, feridas na mucosa foram induzidas mecanicamente por uma pinça de biópsia em miniatura com um diâmetro de 3 Francês (igual a 1 mm; Figura 1A). Subsequentemente, a cicatrização de feridas foi monitorada por exames endoscópicos diários e quantificada por medição da área de ferida residual utilizando o software de edição, por exemplo, o ImageJ (Figura 1B). O...

Pequenas técnicas de imagem animais permitem exames de diagnóstico de série e intervenções terapêuticas in vivo. Recentemente, o leque de aplicações tem aumentado significativamente e atualmente inclui avaliação do desenvolvimento de tumor do cólon, cicatrização de feridas e monitoramento da inflamação. Este protocolo ilustra essas aplicações potenciais diferentes de endoscopia murino.

Murino Endoscopia para In Vivo Cura Multimodal imagem de Carcinogênese e Avaliação de Intestinal ferida e inflamação

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Neste vídeo, uma variedade de aplicações da endoscopia de neurônios será apresentada na primeira aplicação. Como usar o endoscópio para pontuar a gravidade da doença em um modelo de colite em camundongos será mostrado na segunda aplicação. O uso da endoscopia para monitorar a cicatrização de feridas mucosas in vivo será demonstrado na última aplicação.O uso da endoscopia de fluorescência para detectar tumores intestinais e a técnica de injeção intramucosa de agentes serão apresentados em última instância na cicatrização de feridas intestinais, inflamação e câncer. A agenesia pode ser avaliada com base nos achados da análise endoscópica. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a análise histológica da colite experimental, é que, com esta técnica, é possível realizar exames de acompanhamento intra individual e avaliar repetidamente as alterações da mucosa.Portanto, esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da inflamação intestinal experimental, como qual é o estabelecimento temporal da colite. As implicações dessa técnica se estendem à terapia do câncer colorretal devido à possibilidade de caracterizar funcionalmente as lesões neoplásicas. Embora esse método possa fornecer informações sobre o desenvolvimento do câncer colorretal, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como doença inflamatória intestinal ou colite infecciosa.Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades devido ao desafio de manusear o endoscópio de fluorescência de pequena escala. A endoscopia expande o potencial da endoscopia de luz ampla para imagens moleculares por meio do direcionamento específico de estruturas celulares por traços marcados com fluorescência durante exames endoscópicos. Para induzir o câncer colorretal nos animais experimentais, primeiro use uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 30 para injetar 10 miligramas por quilograma são mutagênicos recém-preparados como oximetano em cada camundongo.Desafie o grupo experimental de camundongos com ciclos repetitivos de 3% de peso por volume, sulfato de dextrano sódico ou DSS do dia zero ao 7, 21 a 28 e 42 a 49 para induzir o câncer colorretal inflamatório. Agenesis fornecendo aos camundongos água em autoclave entre os desafios no dia da colonoscopia. Depois de confirmar a sedação por pinça do dedo do pé, use uma cânula abotoada para instilar dois mililitros de enema de fluido no cólon de um animal experimental.Se houver suspeita de carga fecal significativa, enquanto espera o camundongo defecar, conecte uma estação de trabalho endoscópica veterinária de pequenos animais à unidade de câmera para endoscopia de luz branca. Defina as configurações da fonte de luz para excitar os traços a serem injetados e, em seguida, integre um filtro passa-banda apropriado entre o telescópio e a câmera. Agora, coloque o mouse na mesa de exame e insira o endoscópio com muito cuidado.Para evitar perfuração, abra ambas as válvulas da bainha. Uma válvula deve ser conectada à bomba de ar. O outro deve ser selado com um dedo indicador para controlar o ar.Em seguida, encha lenta e cuidadosamente o cólon, avançando o endoscópio apenas até o flexor do cólon direito para evitar a perfuração a cerca de 4,5 centímetros do ânus. Agora, puxe lentamente o endoscópio para trás e examine a mucosa em busca de alterações inflamatórias ou malignas e avalie toda a circunferência do intestino. Em seguida, para recuperar uma amostra de biópsia, introduza a pinça de biópsia cuidadosamente através do canal de trabalho até que a ponta da pinça fique visível no monitor.Abra e feche a pinça com cuidado para evitar perfuração e mova-a para o local da patologia. Para aplicação de agentes farmacológicos na mucosa interra, pré-encha completamente um tubo de injeção flexível com o agente de interesse e, em seguida, empurre o tubo através do canal de trabalho até que a cânula fique visível no monitor. Em seguida, coloque uma seringa fina e insira a agulha na submucosa Em um ângulo de 15 a 30 graus voltado para o chanfro na direção da mucosa, administre suavemente até 50 microlitros do agente terapêutico.Após uma injeção bem-sucedida, a mucosa exibirá um lifting característico para realizar a endoscopia de fluorescência, administrar o agente de interesse por via intravenosa antes do exame. Verifique o ponto de tempo ideal entre a injeção do seu traçador marcado com fluorescência e o procedimento de imagem, que depende da farmacologia do traçador. Em seguida, para visualizar o agente injetado por endoscopia fluorescente, defina as configurações do sistema de filtro passa-banda de acordo com os comprimentos de onda de excitação e emissão do traçador injetado.Finalmente, imagine o tecido após a aplicação do traçador para adquirir uma leitura de proporção de alvo para fundo após a indução de colite. Mouses. Apresentar perda de peso começando no terceiro dia com uma perda máxima de peso corporal de 19% ocorrendo no sétimo dia de acordo com a perda de peso corporal. O índice endoscópico de neurônios do escore de gravidade da colite aumenta no sétimo dia após o início da DSS, indicando dano inflamatório maciço da mucosa colônica, que é melhorado no dia 13.Também no sétimo dia, após o início do DSS, o dano histológico é significativamente maior em camundongos tratados com DSS em comparação com os controles, conforme refletido pela desnudação epitelial, ulcerações da mucosa e aumento da infiltração de neutrófilos, todos significativamente melhorados no dia 13. Nessas imagens representativas de uma endoscopia de rotina, as feridas da mucosa foram induzidas mecanicamente por pinças de biópsia em miniatura com uma ferida de um milímetro de diâmetro. A cicatrização foi então monitorada por exame endoscópico diário e quantificada pela medição da área residual da ferida com software de edição de imagens.O fechamento individual da área da ferida ao longo do tempo foi então expresso pelo quociente da área real da ferida pela área inicial da ferida. Por exemplo, um dia três após a geração da ferida, 41% da área da ferida foi recuperada, enquanto aos sete dias, a ferida estava completamente curada. Como de costume, ao final de um experimento, as feridas podem ser ressecadas para avaliação histológica, X vivo como nessas imagens representativas de leitos de feridas coradas com hematina e ESN no dia zero e cinco, aproximadamente 80 dias após a indução do tumor por oximetano e três ciclos de tumores múltiplos de cólon DSS, bem como sinais macroscópicos de inflamação crônica, como mucosa granulada.A endoscopia endoscópica fluorescente do intestino do neurônio sem aplicação de um traçador resulta na falta de detecção de qualquer sinal específico e não são observadas interações com o tecido colônico ou autofluorescência fecal. Em contraste, imediatamente após a aplicação intravenosa de Fitz Dextran, o fluorocromo pode ser observado na mucosa colônica e pode ser usado para avaliação do aumento da vascularização em regiões de inflamação crônica ou mucosa maligna. Assim, a quantificação da intensidade da fluorescência pode ser usada para medir o aumento significativo da captação do fluorocromo no tecido maligno em comparação com a mucosa colônica não afetada.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cinco a 10 minutos se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de avançar o endoscópio rígido cuidadosamente através do cólon marinho. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar a cicatrização de feridas epiteliais, inflamação intestinal e agenesia do câncer durante a colonoscopia marinha.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Íleo pós-operatório (POI) é uma complicação da cirurgia abdominal levando a um aumento da morbidade e permanência hospitalar prolongada. Porque estratégias profiláticas e terapêuticas faltam pesquisa intensificada é necessário. Por isso, estabeleceu um modelo de mouse padronizada e viável para o entendimento da fisiopatologia POI e estudar potenciais opções terapêuticas.

Avaliação Funcional da motilidade intestinal e inflamação da parede do intestino em Roedores: Análises em um modelo padronizado de Manipulação Intestinal

Ao longo dos últimos anos, novas endoscópios geração surgiram como importantes auxiliares de pesquisa de diagnóstico para a avaliação de colite murina e tumores colorectais. Apresentamos aqui um protocolo detalhado para a avaliação endoscópica de inflamação e tumores colo-rectal em ratos, bem como um novo sistema de pontuação que utiliza identificadores decimais para documentar a gravidade endoscópico de colite e tumores colorectais.

A colonoscopia flexível em camundongos para avaliar a gravidade da colite e colorretal Tumores Usando um sistema validado endoscópica Scoring

Usando camundongos repórteres transgênicos e marcadores fluorescentes injetáveis, a microscopia confocal de disco giratório intravital de longo prazo permite a visualização direta do comportamento das células mielóides no adenoma intestinal no modelo de câncer colorretal ApcMin / +.

Imagens em tempo real de células mielóides em Dynamics Apc Min / + Intestinal Tumores girando Disk microscopia confocal

Descrevemos métodos para monitoramento longitudinal da eficácia da terapêutica para o tratamento de patologias colônicas em camundongos usando um endoscópio rígido. Este protocolo pode ser prontamente utilizado para a caracterização da resposta terapêutica de um tumor individual em camundongos vivos e também para monitorar a potencial recidiva da doença.

Avaliação não invasiva da eficácia de novos Therapeutics para Intestinal Patologias Usando imagem endoscópica série da Vivo Ratos

A montagem e o uso de um microendoscópio multimodal são descritos, que podem co-registrar dados de imagem de tecido superficial com parâmetros fisiológicos do tecido, incluindo concentração de hemoglobina, concentração de melanina e saturação de oxigênio. Essa técnica pode ser útil para avaliar a estrutura e a perfusão do tecido e pode ser otimizada para as necessidades individuais do investigador.

Multimodal Imaging and Platform microendoscopy Espectroscopia de fibra pacote para não-invasiva,<em&gt; In Vivo</em&gt; Análise Tissue

Sondas de destino-específicos representam uma ferramenta inovadora para a análise de mecanismos moleculares, tais como a expressão da proteína em vários tipos de doença (por exemplo, inflamação, infecção e tumorigênese). Neste estudo, descrevemos uma avaliação tomográfica tridimensional quantitativa da infiltração de macrófagos intestinal em um modelo murino de colite usando tomografia computadorizada mediada por fluorescência de F4/80-específicos.

Tomografia computadorizada mediada por fluorescência para a detecção e quantificação de inflamação Intestinal murino macrófago-relacionados

Aqui, nós apresentamos um protocolo para estabelecer pontos finais importantes e os marcadores proliferative da lesão intestinal pequena e da hiperproliferação compensatória usando um modelo da mucosite quimioterapia-induzida. Nós demonstramos a deteção de pilhas proliferating usando um marcador específico do ciclo de pilha e usando o peso intestinal pequeno, a profundidade da cripta, e a altura do vilosidades como valores-limite.

Pontos de extremidade importantes e marcadores proliferativos para avaliar lesão intestinal pequena e adaptação usando um modelo de mouse de mucosite induzida por quimioterapia

Nós descrevemos um método para visualizar o IELS do ltγδ GFP-etiquetado usando a imagem latente intravital do intestino pequeno murino pela microscopia confocal invertida do disco de giro. Esta técnica permite o rastreamento de células ao vivo dentro da mucosa para até 4 h e pode ser usada para investigar uma variedade de interações imunológicas intestinais.

Imagem latente intravital de linfócitos intraepithelial no intestino pequeno murine

Aproveitando a microscopia intravital, o método aqui apresentado permite a visualização em tempo real do derramamento de células epiteliais intestinais em animais vivos. Portanto, a mucosa intestinal topicamente manchada (acriflavina e rhodamineB-dextran) de camundongos anesthetizados é imageda até a resolução unicelular usando microscopia confocal.

Uma abordagem baseada em microscopia intravital para avaliar a permeabilidade intestinal e o desempenho do derramamento de células epiteliais

Aqui, fornecemos uma descrição detalhada do procedimento para induzir biópsias de pinça guiadas colonoscópicas em camundongos e rastrear o fechamento de feridas em tempo real. Além disso, são fornecidos métodos para a preparação de tecidos para análises histológicas, imunohistoquímicas e moleculares do leito da ferida.

Realizando biópsias de pinça guiadas colonoscópicas em camundongos e avaliando alterações subsequentes de tecido

Apresentamos aqui um método para obter imagens do intestino após ferimento induzido por laser. Ao expor o intestino do camundongo a um laser multifóton, a perda de uma única ou múltiplas criptas é induzida localmente. Ao obter imagens repetidas da área danificada ao longo de meses, a dinâmica em tempo real da recuperação intestinal é capturada.

Ablação a Laser e Microscopia Intravital no Estudo do Remodelamento Intestinal

Aprenda endoscopia murina para avaliação de carcinogênese, cicatrização de feridas e inflamação intestinal in vivo. Este método permite exames seriados e intervenções terapêuticas em modelos de câncer colorretal.

Murino Endoscopia para In Vivo Cura Multimodal imagem de Carcinogênese e Avaliação de Intestinal ferida e inflamação

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