Imunodetecção de membrana externa proteínas por citometria de fluxo de mitocôndrias isoladas

O objetivo geral deste procedimento é imunomarcar proteínas de interesse na membrana mitocondrial do RE com um anticorpo de sua escolha e analisar simultaneamente com a função mitocondrial. Isso é feito coletando primeiro o tecido de interesse, como cérebro, medula espinhal ou fígado de um rato. O segundo passo é isolar as mitocôndrias do tecido, neste caso a medula espinhal.

A medula espinhal é homogeneizada com uma dança. O homogeneizador e outras organelas e detritos do dia celular são removidos por meio de uma série de etapas de centrifugação até que um palato mitocondrial bruto seja alcançado, a mielina, um dos principais contaminantes do tecido nervoso central, é removida pela mistura de mitocôndrias com uma solução de preparação de 12% opti e centrifusão mais uma vez. Em seguida, as mitocôndrias isoladas são marcadas com um anticorpo primário de escolha, seguido por um anticorpo secundário conjugado a um flúor.

A etapa final é adicionar corantes fluorescentes para confirmar a identidade mitocondrial ou parâmetros funcionais. Em última análise, a citometria de fluxo é usada para mostrar a abundância relativa de membranas mitocondriais altas em toda a fisiologia ou doença normal. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a microscopia, é que ela permite alto rendimento e quantificação rápida de milhares de mitocôndrias individuais.

Os animais utilizados neste estudo foram tratados em estrita conformidade com um protocolo aprovado pelo Comitê institucional C-R-C-H-U-M para a proteção de animais, que segue os padrões nacionais descritos pelo Conselho Canadense de Cuidados com os Animais do Ar. Para iniciar este procedimento, coloque toda a medula espinhal intacta que foi coletada de um rato em um homogeneizador de vidro de cinco mililitros contendo cinco volumes de tampão de homogeneização. Coloque o homogeneizador de vidro no gelo e homogeneize o tecido manualmente até que não haja pedaços maiores de tecido, o que levará aproximadamente oito golpes.

Transfira o homogeneizado para dois ou três tubos de microcentrífuga e centrifugue a 1.300 vezes G por 10 minutos de quatro graus Celsius e a próxima pipeta O sobrenadante S em um tubo de ultracentrífuga de cinco mililitros. Adicione 750 microlitros de tampão de homogeneização ao pellet e ressuspenda suavemente o pellet. Em seguida, centrifugue a suspensão e ressuspenda o pellet.

Mais duas vezes para remover pequenos detritos, puxe todos os sobrenadantes para o mesmo tubo de ultracentrífuga de cinco mililitros e, em seguida, coloque os tubos em um rotor de ultracentrífuga. Equipado com baldes oscilantes, centrifugue os tubos a 17.000 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius. Quando a centrifugação estiver completa, guardar o sobrenadante para processamento posterior, se a fracção citosólica for de interesse.

Em seguida, resus suspende o pellet, que é a fração mitocondrial bruta em quatro mililitros de tampão de homogeneização contendo centrífuga de cloreto de potássio 50 milimolares. O pellet ressuspenso a 17.000 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius em um rotor de balde oscilante, em seguida, descarte o supinato e ressuspenda suavemente o pellet em 800 microlitros de tampão de homogeneização em um novo tubo de ultracentrífuga de cinco mililitros a exatamente 800 microlitros do pellet ressuspenso. Em seguida, pipete 200 microlitros de iod dal para os 800 microlitros do pellet ressuspenso para criar uma concentração final de 12% iod Dal.

Misturar o conteúdo do tubo com uma pipeta P 1000 e centrifugar a 17 000 vezes G durante 15 minutos a quatro graus Celsius num rotor de balde oscilante, aspirar a camada de mielina na parte superior do tubo e rejeitar o supinato cuidadosamente, pois a paleta pode estar solta. Resus suspende o pellet em quatro mililitros de tampão de homogeneização. Em seguida, centrifugue seu ganho a 17.000 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius em um rotor de caçamba oscilante.

Descarte o supinado e resus. Suspenda o pellet em quatro mililitros de tampão de homogeneização. Em seguida, repita a centrifugação novamente e remova o agente supino reus.

Dobre o pellet final em 100 a 200 microlitros de tampão de homogeneização e transfira para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro. Determine a quantidade de proteína em cada amostra usando um ensaio de quantificação de proteína padrão, como ensaio de ácido biônico ou BCA. Ao preparar as amostras para quantificação, diluir as amostras e a curva-padrão em sulfato de sódio a 2% para garantir a solubilização adequada das mitocôndrias.

Para cada mistura de coloração a ser testada, pipetar 25 microgramas das mitocôndrias isoladas para um tubo microcêntrico de 1,7 mililitro. Certifique-se de incluir uma amostra não corada em cada experimento, bem como um controle de isotipo apropriado para cada anticorpo testado, centrifugue cada amostra a 17.000 vezes G por dois minutos a quatro graus Celsius em uma microcentrífuga de bancada. Em seguida, remova o supinado e ressuspenda as mitocôndrias isoladas em 50 microlitros de tampão mitocôndria.

Suplementado com BSA livre de ácidos graxos a 10%, incube a solução por 15 minutos a quatro graus Celsius e, em seguida, adicione 20 microgramas do anticorpo primário por mililitro de solução. Incubar as mitocôndrias isoladas com o anticorpo primário durante 30 minutos a quatro graus Celsius para eliminar o anticorpo não ligado, centrifugar cada amostra e rejeitar o natant supino. Em seguida, ressuspenda suavemente o pellet em 200 microlitros de tampão mitocondrial e, em seguida, repita a etapa de centrifugação, descarte o nadante supino e ressuspenda o pellet em 50 microlitros de tampão mitocondrial.

Adicionar 0,5 microgramas do anticorpo secundário por mililitro de amostra. Em seguida, incubar as amostras por 30 minutos a quatro graus Celsius, protegidas da luz. Quando a incubação estiver completa, centrifugue cada amostra e descarte o supinato que contém o anticorpo secundário não ligado. Reese.

Suspenda o pellet em 200 microlitros de tampão mitocôndria e centrifugue a amostra. Outra vez. Em seguida, remova o supinado e Reese. Suspenda o pellet em 500 microlitros de tampão mitocôndria para garantir que os eventos observados sejam de fato mitocôndrias.

Pinte a amostra com um corante fluorescente específico para mitocôndrias, como o rastreador do MIT verde de In Vitrogen, por 15 minutos no escuro. Se não for necessária mais coloração para investigar outros parâmetros funcionais, transfira a amostra marcada para um tubo adequado para carregamento num citómetro de fluxo. Manter as amostras em gelo e proceder a um citómetro de fluxo para aquisição para verificar se as mitocôndrias isoladas têm um potencial transmembrana intacto, corar as mitocôndrias com éster metílico de 100 nanomolares de tetraetilo bastonete domina durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro, como controlo da coloração com tetraetilo

O éster metílico cora as mitocôndrias isoladas com 100 nanomolares de éster metílico de domina de bastonete tetraetil na presença de 100 micromolares de carbonilcianeto m clorofenol HydroOne. Este produto químico é um desacoplamento mitocondrial e despolarizará as mitocôndrias para verificar se as mitocôndrias isoladas produzem superóxido manchar as mitocôndrias com um indicador de superóxido apropriado, como mitoses meias vermelhas de Vitrogen por 15 minutos à temperatura ambiente no escuro como um controle para a produção de superóxido mitocondrial. Permaneça nas mitocôndrias isoladas com corante na presença de antimicina 10 micromolar.

Uma antimicina A é um inibidor do complexo três da cadeia respiratória e aumentará a produção de superóxido mitocondrial antes do início da aquisição. Configure o instrumento conforme descrito no protocolo de texto que o acompanha. Em seguida, misture as amostras batendo suavemente no tubo, mas não vórtice.

Comece a coletar os eventos iniciais a uma baixa pressão durante o gating. Certifique-se de bloquear a população total. Em seguida, ajuste as tensões dos histogramas de acordo.

O pico da amostra não corada geralmente corresponde à segunda década. Então, uma vez que as portas são estabelecidas e as amostras estão sendo processadas, mude a pressão para citometria de alto fluxo. A análise das preparações da medula espinhal identificou que 94% dos eventos foram positivos para o corante específico da mitocôndria.

Neste experimento, 30% dos eventos positivos das mitocôndrias foram marcados com um anticorpo específico para a fusão dois do MIT, que é uma proteína implicada na fusão da membrana externa das mitocôndrias. A análise do potencial transmembrana mitocondrial usando éster metílico de tetraetila rumina descobriu que 95% das mitocôndrias isoladas têm um potencial transmembrana intacto. Esta coloração mostrou-se específica, pois uma diminuição significativa na coloração foi observada quando realizada na presença de uma mitocôndria não funcional As mitocôndrias produziram uma quantidade basal de óxido de SUP, medida usando um corante permeável à membrana.

Isso se torna uma reação fluorescente de P com óxido de SUP. O tratamento das mitocôndrias com antimicina a resulta em um aumento aproximado de 10% na produção de superóxido Uma vez dominado. Essa técnica pode ser feita em seis a sete horas se for executada corretamente.