Name: Geração de Transgênicos Hydra Por microinjeção de embriões (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprenda a gerar linhagens transgênicas de Hydra por microinjeção de DNA plasmidial em embriões. Este método permite estudar função gênica, dinâmica celular e expressão de genes em biologia do desenvolvimento.

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Este trabalho foi apoiado por uma G. Harold &amp; Leila Y. Mathers Award para HL e uma subvenção NIH (R24 GM080527) para RESCEJ foi um NRSA Pós-Doutorado (NIH F32GM9037222) e está apoiada por uma Scientist Award Desenvolvimento Mentored Pesquisa da National Instituto do Envelhecimento (K01AG04435). Gostaríamos de agradecer aos revisores pelos comentários úteis.

1 Preparação de plasmídeo de DNA, agulhas e injeção Pratos <ol><li> Prepare o DNA de plasmídeo utilizando um kit de alta velocidade ou Maxi Midi e concentra-se o ADN para 2,5 mg / ml usando a precipitação com etanol. O sedimento de DNA deve ser dissolvido em água livre de nuclease desionizada. Armazenar o ADN em 10-20 mL alíquotas a -20 ° C. (Ver Quadro Suplementar 1 para uma lista de vetores disponíveis) </li><li> Faça um prato de injeção utilizando agarose para construir uma calha para a realização de embriões em uma placa de Petri de 100 x 15 mm. <ol><li> Coloque uma lâmina de microscópio de vidro de 75 x 50 em um 100 x 15 mm numa caixa de Petri com um ângulo. Despeje a cerca de 50 ml de 2% de agarose em forma derretida Hidra 24 para a placa de Petri. Alternativamente, despeje a agarose para o prato primeiro e flutuar um &quot;molde microinjeção Fish&quot; no topo. </li><li> Após o ágar ter solidificado, remover a lâmina de vidro, ou o molde. Se foi usada uma lâmina de vidro, corte o excesso de agarose com um bla navalhade formar uma parede. Despeje meio Hydra no prato e usá-lo imediatamente ou armazená-lo a 4 ° C até ser necessário. Nota: pratos de injecção pode ser reutilizado se for armazenado a 4 ° C entre as utilizações. </li></ol></li><li> Puxar agulhas capilares de vidro de borossilicato com um filamento no puxador de micropipeta usando as seguintes condições: 525 aquecer, puxar 75, a velocidade de 100, o tempo da loja 50. as agulhas, pressionando-os para uma estreita faixa de argila, em uma placa de Petri de tal modo que eles são mantida paralelamente ao fundo do prato. </li><li> Para preparar a solução para injecção, combinar 3 uL de solução de ADN de plasmídeo de 2,5 mg / mL com 2 mL de 10% de vermelho de fenol. Vortex a solução brevemente e em seguida girar durante 10 minutos à velocidade máxima numa microcentrífuga para remover quaisquer partículas que podem entupir a agulha. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, o clipe de agulha alguns milímetros da ponta com uma pinça para criar uma pequena abertura. Nota: Existe uma certa flexibilidade no tamanho adequado do abertoing porque a pressão pode ser ajustada na etapa 3.3 para acomodar esta variação. </li><li> Colocar a placa de Petri de modo a que é segura a agulha na posição vertical, com a ponta para baixo. Coloque a agulha com cerca de 0,5 ml de solução de injecção por pipetagem do líquido para dentro da extremidade posterior da agulha. Permitir uma acção capilar para puxar a solução para dentro da ponta da agulha. </li></ol> 2 Preparação de embriões para Injeção <ol><li> Em uma base diária digitalizar a cultura tensão Hydra AEP para pólipos produtoras de ovos. Colete estes pólipos e retirá-las em um prato de cultura independente. Observe estes pólipos cada poucas horas durante o dia para monitorar o progresso de formação do ovo. Quando os ovos quebram através do ectoderma e sentar-se em um anel de células ectodérmicas retraídos eles estão prontos para a injeção 25. Colocar estes pólipos em um prato com vários hidra que têm testículos durante pelo menos 1 hora antes da injecção para permitir a fertilização. Hidra &lt;/ Em&gt; machos vai liberar esperma sem qualquer manipulação especial. </li><li> Se as fêmeas são encontrados na colónia AEP com ovos completamente formados, que são aproximadamente de 400 um de diâmetro de 25, ou de 1 a 8, embriões nos estágios de células, também recolher estes injectável. Injetar imediatamente embriões que começaram clivagem. Nota: Não é possível dizer a diferença entre os ovos totalmente formadas e zigotos unicelulares, portanto, estes devem ser incubadas com os homens antes da injeção. </li><li> Antes da injecção, remover a maior parte do tecido parental acima e abaixo do embrião utilizando um bisturi, com uma lâmina de # 15. Deixar apenas o embrião com um pequeno pedaço de coluna corpo ligado, para ser utilizada para manipular o embrião com uma pinça, se necessário. Nota: O tecido que é dissecado a partir do embrião irá regenerar e deve ser guardada para assegurar que permanecem fêmeas na colónia Hidra. </li><li> Utilizando uma pipeta de Pasteur, mover os embriões para o prato de injecção, dispondo-os em paralelo à parede docalha de agarose. </li></ol> 3. microinjecção de ADN do plasmídeo <ol><li> Monte o microinjetor em um suporte magnético que fica em uma chapa de ferro. Montar o suporte da injecção, que é a parte da microinjector que prende a agulha, em um micromanipulador joystick. Monte o manipulador joystick para a chapa de ferro, com um suporte magnético. Coloque esta todo o conjunto para cima no lado direito de um microscópio de dissecção e posiciona o porta-injecção de modo que seja visível no campo de observação. </li><li> Coloque o prato de injecção com embriões sob o microscópio de dissecação, orientada de tal modo que a parede vertical da calha de agarose é para a esquerda. Inserir a agulha no suporte de injecção e diminuir a ponta da agulha para o meio de Hidra no prato. </li><li> Lentamente, rodar o botão da seringa na direcção dos ponteiros do relógio até que o óleo mineral preenche a parte superior da agulha e um fluxo constante de solução de injecção é observado sai da agulha no hidrum meio. Se o fluxo é muito forte, diminuir a pressão, girando o botão para a esquerda. Praticar este passo para obter rotineiramente uma pressão adequada, o que depende do tamanho da abertura da agulha (ou seja, a forma como a agulha foi cortado no passo 1.5). Nota: Se a corrente é muito forte, o embrião não irá sobreviver a injeção. </li><li> Durante a visualização através de um microscópio de dissecação, movimentar o prato de injecção de modo a que o primeiro embrião está no centro do campo. Mover a agulha de modo que ela está a tocar que embrião. Usar o micromanipulador para perfurar o embrião com a agulha. Nota: A parede vertical da calha agarose vai manter o embrião do que está sendo deixado de lado pela agulha. </li><li> Permitir que a solução de injeção a fluir para o embrião 1 ou 2 segundos e, em seguida, remover a agulha rapidamente. Se o embrião tem mais de uma célula, injectar cada célula individual. Use uma pinça para reorientar o embrião para alinhar a célula seguinte, com a ponta da agulha. </li><li> Após o primeiro embryo é injectado, movimentar o prato de modo a que o lado do embrião está na posição de injecção e repetir o procedimento; continuar até que todos os embriões foram injectados. </li></ol> 4 A cultura ea eclosão dos embriões <ol><li> Mover todos os embriões injectados em um prato com algumas hidra que têm testículos (isto é para assegurar que todos os embriões são fertilizados). Incubar os embriões em um 18 ° C incubadora, enquanto eles continuam a embriogênese. </li><li> Uma vez que a fase de cutícula é atingido, mover cada embrião injectado para um poço individual de uma placa de 24 poços cheios com meio de hidra. </li><li> Incubar os embriões injectados durante 2 semanas no escuro a 18 ° C. </li><li> Após o período de incubação duas semanas, verifique cada embrião injetado sob o microscópio de dissecação. Observe quaisquer casos em que o embrião cutícula estágio se soltou do pequeno pedaço de tecido parental eo tecido dos pais tenha regenerado. Remover este pólipo regenerado imediatamente para que ele não é mistaken de um novo filhote. </li><li> Mova o prato de embriões injetados sob a luz do aquário à temperatura ambiente. Verifique as placas de cada dia e recolher filhotes. Novos filhotes será branco porque a cor-de-rosa típico de pólipos Hydra vem da Artemia eles comem. </li><li> Observe os filhotes debaixo de um microscópio de fluorescência para detectar a expressão do transgene. </li></ol>

<ol><li>Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Hydra+allow+in+vivo+tracking+of+individual+stem+cells+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).</li>
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<li>Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+epithelial+cell+cycling+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern of epithelial cell cycling in hydra.</a> Dev Biol. 148, 602-611 (1991).</li>
<li>Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+pathways+of+ectodermal+epithelial+cells+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra.</a> Differentiation. 35, 181-189 (1987).</li>
<li>Khalturin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+stem+cells+in+Hydra+reveal+an+early+evolutionary+origin+for+key+elements+controlling+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation.</a> Dev Biol. 309, 32-44 (2007).</li>
<li>Bosch, T., David, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+of+Hydra+magnipapillata+can+differentiate+into+somatic+cells+and+germ+line+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells.</a> Dev Biol. 121, 182-191 (1987).</li>
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<li>Glauber, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+molecule+screen+identifies+a+novel+compound+that+induces+a+homeotic+transformation+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A small molecule screen identifies a novel compound that induces a homeotic transformation in Hydra.</a> Development. 140, 4788-4796 (2013).</li>
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<li>Juliano, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIWI+proteins+and+PIWI-interacting+RNAs+function+in+Hydra+somatic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).</li>
<li>Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cells+and+sex+determination+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline stem cells and sex determination in Hydra.</a> Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).</li>
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<li>Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulatory+and+repressive+inputs+localize+Hydra+Wnt3+to+the+head+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).</li>
<li>Gee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-catenin+plays+a+central+role+in+setting+up+the+head+organizer+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra.</a> Dev Biol. 340, 116-124 (2010).</li>
<li>Fraune, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+an+early+branching+metazoan%2C+bacterial+colonization+of+the+embryo+is+controlled+by+maternal+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).</li>
<li>Bridge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+and+stress+responses+in+the+cnidarian+Hydra+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris.</a> PLoS One. 5, e11686(2010).</li>
<li>Boehm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+is+a+critical+regulator+of+stem+cell+maintenance+in+immortal+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).</li>
<li>Franzenburg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyD88-deficient+Hydra+reveal+an+ancient+function+of+TLR+signaling+in+sensing+bacterial+colonizers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).</li>
<li>Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+a+horizontally+transferred+gene+into+an+operon+during+cnidarian+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution.</a> PLoS One. 7, e31643(2012).</li>
<li>Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLenhoff%2C+HM+%22Hydra%3A+Research+Methods%22">Hydra: Research Methods</a>. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 4 29-34 (1983).</li>
<li>Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+development+in+Hydra+involves+selection+from+competent+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells.</a> Dev Biol. 224, 326-338 (2000).</li>
<li>Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLenhoff%2C+HM+%22Hydra%3A+Research+Methods%22">Hydra: Research Methods</a>. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 8 53-62 (1983).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar

Hydra rotineiramente reproduz de forma assexuada, mas requer estímulos ambientais para começar gametas produtores. Esses estímulos não são bem definidos para a maioria das espécies de Hydra e podem variar de estirpe para estirpe. Um obstáculo significativo para a produção de Hidra transgénico é a obtenção de embriões numa base regular porque pode ser difícil num ambiente laboratorial para induzir a tornar-se Hydra sexual. A estirpe AEP 25, no entanto, produz gâmetas prontam...

Hydra foi usado para estudar a regeneração, formação de padrões, e as células-tronco para cerca de 250 anos 2 Hydra tem um plano corporal simples, que consiste de três linhagens de células:. Epitelial ectodérmica, endodérmica epitelial e intersticial. O corpo tubular é formado por o ectodérmico e linhagens epiteliais da endoderme, cada um dos quais é uma camada única de células. Todas as células epiteliais no corpo da coluna são mitótico. Quando as células epiteliais são deslocados para as extremidades 3, a cabeça (boca e tentáculos) na extremidade bucal ou do pé (disco basal) na extremidade aboral, eles prendem na fase G2 do ciclo celular e alterar o destino da célula 4. As células da linhagem intersticial residem dentro dos interstícios entre as células epiteliais. Esta linhagem é apoiada por células-tronco multipotentes que estão localizados na camada epitelial ectodérmica da coluna corpo 5. As células estaminais intersticiais dar origem a três cel somáticatipos l (nervos, células glandulares, e nematocytes) e as células germinativas 6,7. Como um membro do filo Cnidaria, o grupo irmão de todos os bilaterians, Hydra pode lançar luz sobre os processos biológicos fundamentais compartilhados entre os animais multicelulares. Até recentemente, esses esforços foram impedidos pela falta de métodos confiáveis ​​para a perturbação da função dos genes. No entanto, com o desenvolvimento de metodologia transgênico 1, somos agora capazes de tirar o máximo proveito de Hydra para obter uma melhor compreensão dos mecanismos básicos comuns a animais multicelulares, como a função de células-tronco, regeneração e padronização. Linhas Transgénicas Hydra são estabelecidos por injecção de plasmídeo de ADN em embriões, o que resulta na integração aleatória e expressão quimérico com uma frequência significativa de filhotes. Uma linha com expressão uniforme numa linhagem particular pode ser estabelecida por propagação vegetativa. A capacidade de propagar clonalmente transgenic Hidra linhas é uma vantagem sobre a maioria dos modelos de animais, que pode ser propagado somente por reprodução sexuada. Além disso, as células transgénicas podem ser facilmente rastreados in vivo, devido à transparência do animal e a ausência de proteínas fluorescentes endógenos 8. Nos sete anos desde as primeiras linhas Hydra transgênicas foram feitas 1, essas linhas foram usados ​​para uma variedade de aplicações. Expressão de proteínas fluorescentes em diferentes tipos de células tornou possível controlar o movimento celular, observar as alterações na forma da célula, e rastrear destinos celulares, tanto em condições de tipo selvagem e depois perturbação química 1,5,9-12. Além disso, a expressão de proteínas fluorescentes diferentes nas diversas linhagens de FACS permite o isolamento de populações de células específicas. Esta técnica tem sido utilizada para o seqüenciamento de mRNAs específicos de células-tronco e de linhagem específica pequenos RNAs 13,14. Enquanto o promotor deum dos dois genes da actina Hidra tem sido mais amplamente utilizado, a poucos tipos de células-promotores específicos foram identificados e utilizados para dirigir a expressão da GFP em Hydra 9,11,15,16 transgénico. No futuro, os promotores específicos do tipo de célula irá permitir a observação e recolha de qualquer tipo de célula específico. Além disso, uma abordagem transgénica foi utilizado com sucesso para definir os elementos reguladores que actuam em cis do promotor Wnt3 17. O desenvolvimento de métodos transgênicos em Hydra oferece uma abordagem robusta para testar a função dos genes pela expressão ectópica, superexpressão e knockdown. Os animais transgénicos que foram feitos expressar as proteínas marcadas com fluorescência, de modo a examinar tanto a função e localização celular de 18-20. Além disso, a expressão de ARN de gancho de cabelo na 3&#39;UTR de um transgene GFP leva a knockdown de genes alvo 21,22. Nessas abordagens GFP é necessário para identificare rastrear o tecido transgénico durante a criação da linha transgénica. No entanto, é provável que, em alguns casos, a molécula GFP iria interferir com a função da proteína etiquetada. Um estudo recente demonstra que os genes Hydra podem ser dispostas numa configuração operão, por exemplo, transcrições policistrónico são feitos, os quais são então separados por adição líder trans-splicing e traduzidos em separado 23. Ao colocar um gene que codifica uma proteína ou um gancho de cabelo de ARN na posição a montante de um operão e um gene de proteína fluorescente na posição de jusante, pode-se controlar o tecido transgénico sem ter que marcar o gene que codifica a proteína ou RNA hairpin. Este método tem sido utilizado para expressar um gancho de cabelo de ARN de um operão com DsRed2 configuração, a fim de alcançar gene knockdown 14.

<table><tbody><tr><td>AEP Hydra Strain</td><td></td><td></td><td>E-mail: Celina Juliano na celina.juliano@yale.edu ou Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp</td></tr><tr><td>Kit Maxi de Alta Velocidade</td><td>Qiagen</td><td>12662</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm Placas de Petri</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>75 x 50 mm Microscópio de Vidro Slide</td><td>Sigma</td><td>CLS294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Microinjeção Molde de Peixe</td><td>IBI Scientific</td><td>FM-600</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de Borosilicato com Filamento</td><td>Sutter Instrumento</td><td>BF100-50-10</td><td>O.D.: 1,0 mm, I.D.: 0,50 mm, 10 cm de comprimento</td></tr><tr><td>Extrator de Micropipeta Flamejante/Marrom</td><td>Sutter Instrumento</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Fenol Vermelho</td><td>Sigma</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de Joalheiro, Durmont #</td>5 <td>Sigma</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de Bisturi #15</td><td>Fisher</td><td>50-822-421</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma</td><td>M8410-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Microinjetor</td><td>Narishige</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td>Suporte magnético</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Placa de ferro</td><td>Narishige</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>Joystick Micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de transgênicos hydra por microinjeção de embriões

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Como membro do filo Cnidaria, o grupo irmão de todos os bilaterianos, Hydra pode lançar luz sobre os processos biológicos fundamentais compartilhados entre animais multicelulares. Hydra é usado como modelo para o estudo da regeneração, formação de padrões e células-tronco. No entanto, os esforços de pesquisa foram prejudicados pela falta de um método confiável para perturbações genéticas para estudar a função molecular. O desenvolvimento de métodos transgênicos revitalizou o estudo da biologia da Hidra 1. A Hydra transgênica permite o rastreamento de células vivas, classificação para produzir populações de células puras para análise bioquímica, manipulação da função gênica por knockdown e superexpressão e análise da função promotora. O DNA do plasmídeo injetado em embriões em estágio inicial se integra aleatoriamente ao genoma no início do desenvolvimento. Isso resulta em filhotes que expressam transgenes em manchas de tecido em uma ou mais das três linhagens (epitelial ectodérmico, epitelial endodérmico ou intersticial). A taxa de sucesso na obtenção de um filhote com tecido transgênico está entre 10% e 20%. A propagação assexuada do filhote transgênico é usada para estabelecer uma linhagem uniformemente transgênica em uma linhagem particular. A geração de Hydra transgênica é surpreendentemente simples e robusta, e aqui descrevemos um protocolo que pode ser facilmente implementado a baixo custo.

Estabelecer linhas de Hydra transgênicos Alimentar filhotes transgênicas a cada 2-3 dias com náuplios de Artemia. Os filhotes, por vezes, não comer por um ou dois dias após a eclosão. Alguns novos filhotes nunca vai comer, e, portanto, não vai sobreviver. Se o filhote é transgénicos quer na ectodérmica (Figura 1A) ou o tecido epitelial endodérmica, permitir que o animal a germinar e recolher as gemas que têm a maioria dos tecidos transgénicos (Figura 1...

Hydra transgênica estável são feitas por microinjeção de DNA de plasmídeo em embriões, seguida de integração genômica aleatória e propagação assexuada para estabelecer uma linha uniforme. Transgenic Hydra é usado para rastrear movimentos celulares, superexpressar genes, estudar a função do promotor ou derrubar a expressão gênica usando RNAi.

Geração de Transgênicos Hydra Por microinjeção de embriões

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

O objetivo geral deste procedimento é microinjetar DNA plasmático em embriões de hidra para produzir linhas transgênicas. Isso é feito primeiro preparando uma solução de DNA de plasma e carregando-a em uma agulha de injeção. Em seguida, a solução de DNA plasmático é injetada em embriões de hidra entre os estágios de uma e oito células.Em seguida, os embriões de hidra podem se desenvolver e eclodir e os juvenis com tecido transgênico são selecionados. A etapa final é produzir uma linhagem transgênica uniforme por brotamento assexuado do animal transgênico original. Em última análise, a microscopia de fluorescência é usada para visualizar a expressão transgênica na hidra.Este método foi projetado para pesquisadores que desejam fazer linhas hidrelétricas transgênicas a baixo custo, permitindo assim uma aplicação mais ampla dessa tecnologia útil, tanto para os pesquisadores hídricos atuais, mas também para aqueles que desejam apenas começar a usar este modelo. As hidras transgênicas são usadas para estudar a dinâmica dos tecidos, a função gênica de localização de proteínas por knockdown e superexpressão e também a função promotora. Depois de preparar o DNA plasmático de acordo com o protocolo de texto, prepare um prato de injeção colocando primeiro um microscópio de vidro 75 por 50.Deslize em uma placa de Petri de 100 por 15 milímetros em um ângulo para dissolver 2% agros em 50 mililitros de meio hidra. Deixe esfriar. Em seguida, despeje na placa de Petri Depois que o agros solidificar, remova a lâmina de vidro e, com a lâmina de barbear, corte o excesso de agros para formar uma parede.Em seguida, despeje imediatamente o meio hidra no prato e use-o imediatamente ou guarde-o a quatro graus Celsius até que seja necessário. Para preparar a solução de injeção, combine três microlitros de 2,5 miligramas por mililitro de solução de DNA plasmático com dois microlitros de solução de vermelho de fenol a 10%. Vortex a solução brevemente e depois gire-a por 10 minutos na velocidade máxima em uma microcentrífuga para remover quaisquer partículas que possam entupir a agulha sob um microscópio de dissecação.Use uma pinça para prender a agulha a alguns milímetros da ponta para criar uma pequena abertura. Oriente a placa de Petri que contém a agulha de modo que a agulha fique na posição vertical com a ponta para baixo. Em seguida, pipeta aproximadamente 0,5 microlitros de solução injetável na extremidade posterior da agulha.Para preparar embriões para injeção, comece escaneando uma hidra, uma cultura de cepa EP em busca de pólipos produtores de óvulos. Colete esses pólipos e transfira-os para um prato de cultura separado. Observe esses pólipos a cada poucas horas durante o dia para monitorar o progresso da formação do ovo.Quando os óvulos rompem o ectoderma e ficam em um anel de células dérmicas retraídas, eles estão prontos para a injeção colocam pólipos que têm óvulos prontos para injeção em um prato com várias hidras que têm testículos por pelo menos uma hora antes da injeção para permitir a fertilização se as fêmeas forem encontradas em uma colônia EP com óvulos totalmente formados ou embriões de um a oito em estágio celular. Recolha-os também para injeção antes da injeção. Use um bisturi com uma lâmina número 15 para remover a maior parte do tecido parental acima e abaixo dos embriões que começaram a se separar, deixando-os com apenas um pequeno pedaço da coluna corporal dos pais presa.Salve o tecido dissecado em meio Hydra, pois ele se regenerará e garantirá que as fêmeas permaneçam na colônia de hidra. Use uma pipeta de pastagem para transferir os embriões clivados para uma placa de injeção, dispondo-os paralelamente à parede do cocho agros. Para preparar o micro injetor montado em um suporte magnético que fica em uma placa de ferro.Monte o suporte de injeção, que faz parte do microinjetor que segura a agulha em um manipulador microm de joystick. Usando um suporte magnético, monte o manipulador de joystick na placa de ferro. Em seguida, coloque toda a configuração no lado direito de um microscópio de dissecação e posicione o suporte de injeção de forma que fique visível no campo de observação.Colocar a cápsula de injecção com os embriões sob o microscópio de dissecação, orientada de modo a que a parede vertical da calha agrícola fique virada para a esquerda. Insira a agulha no suporte para injeção e baixe a ponta da agulha no meio hidra no prato. Em seguida, gire lentamente o botão da seringa no sentido horário até que o óleo mineral encha a parte superior da agulha e um fluxo constante de solução injetável seja observado saindo da agulha para o meio hidra.Se o fluxo for muito forte, abaixe a pressão girando o botão no sentido anti-horário. Centralize um embrião no campo de visão e mova a agulha para que ela toque o embrião. Em seguida, use o manipulador microm para perfurar o embrião com a agulha e permitir que a solução injetável flua para o embrião por um ou dois segundos antes de remover rapidamente a agulha.Se o embrião tiver mais de uma célula, injete cada célula individualmente. Continue até que todos os embriões tenham sido injetados. Depois que todos os embriões forem injetados, transfira-os para um prato com alguns pólipos Hydra, um EP que tem testículos e incuba-os a 18 graus Celsius enquanto continuam a sofrer embriogênese.Quando os embriões atingirem o estágio de cutícula, mova cada embrião para um poço de uma placa de 24 poços cheia de meio hidra e incube por duas semanas no escuro a 18 graus Celsius. Em seguida, sob um microscópio de dissecação, verifique se cada embrião se desprende do pequeno pedaço de tecido parental e a regeneração desse tecido. Se houver, remova-o imediatamente para que não seja confundido com um novo filhote.Depois de verificar cada embrião, mova o prato sob uma luz de aquário em temperatura ambiente. Verifique os pratos todos os dias e colete os filhotes. Os novos filhotes serão de cor branca porque ainda não comeram.Observe-os sob um microscópio fluorescente para expressão de transgenes. Use art napoli para alimentar filhotes transgênicos a cada dois ou três dias. Quando filhotes transgênicos no tecido epitelial eletrodérmico ou endodérmico produzem brotos, eles são avaliados quanto à expressão transgênica.Aqui é mostrado um filhote com expressão quimérica de um vermelho Ds, dois transgenes sob o controle de um promotor de actina e um remendo de células epiteliais ectodérmicas. A brotação contínua do animal pode eventualmente produzir uma linha com expressão uniforme do transgene na linhagem epitelial eletrodérmica ou endodérmica. Como visto aqui, o filhote original agora está produzindo dois novos botões.O botão marcado com um asterisco, não tem tecido transgênico e foi usado como animal fundador de uma linha de controle que é geneticamente idêntica à linha transgênica, exceto pela presença do transgene. Este animal é o primeiro broto com tecido transgênico produzido a partir do filhote original. Por meio desses experimentos usando transgenes que não têm impacto na função biológica, linhagens de células epiteliais uniformes foram estabelecidas a partir de aproximadamente 30% das hidras que eclodem com tecido epitelial transgênico.Uma linha eletrodérmica uniforme, como vista aqui, é estabelecida 33 a 50% menos frequentemente do que uma linha endodérmica. Então, depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer hidrolinhas transgênicas, o que aumentará o repertório de estudos funcionais que você pode fazer com este modelo.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, Nijole Jasinskiene demonstra a metodologia utilizada para gerar transgênicos mosquitos Aedes aegypti, que são vetores da dengue. As técnicas para preparar corretamente agulhas microinjeção, os embriões desidratantes, e realizando microinjeção são demonstradas.

Microinjeção de embriões A. aegypti obter mosquitos transgênicos

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Em Expression in ovo de microRNA em Ventral Pintinho Midbrain

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Microinjeção de Western milho repele, Diabrotica virgifera virgifera, embriões de transformação da linha germinal, ou edição de genoma CRISPR/Cas9

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