Name: High-throughput Titolazione della luciferasi che esprimono ricombinanti virus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Scopri la titolazione virale ad alto rendimento basata su luciferasi per la virologia usando cellule Vero. Questo metodo consente di quantificare rapidamente i titoli virali e valutare la citotossicità in parallelo.

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Vanessa Garcia è finanziata da una borsa di studio per laureati in Scienze e Tecnologie della Regina Elisabetta II dell'Ontario e da Cory Batenchuk da una borsa di studio del Natural Sciences and Engineering Research Council.

Preparazione del campione 1 <ol><li> Ottenere campioni contenenti-luciferasi che esprimono virus (qui VSVΔ51-Fluc come esempio) per la titolazione e il trasferimento in piastre da 96 pozzetti. In alternativa, eseguire infezioni in 96 pozzetti piastre di coltura di tessuti e uso surnatanti direttamente. </li><li> Lascia due colonne non trattati per l&#39;inserimento di curve standard. Per gli esperimenti fatti direttamente in piastre a 96 pozzetti, titolo alla fine dell&#39;esperimento (40 ore post-infezione) o conservare a -80 ° C e titolo in una data successiva. </li></ol> 2 Preparazione di cellule permissive per Virus Titolazione <ol><li> 24 ore prima della titolazione, preparare una sospensione di cellule Vero ad una concentrazione di 2,5 x 10 5 cellule / ml in mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) contenente siero bovino fetale al 10% (FBS), HEPES 30 mM e 1% di penicillina / streptomicina. NOTA: Anche se questo protocollo utilizza cellule Vero, ogni linea cellulare permissiva adatto per l&#39;infezione da VSV potrebbe be utilizzato. </li><li> Seed 2,5 x 10 4 cellule (100 microlitri) in piastre a fondo piatto solido 96 pozzetti bianchi con un dispenser di micropiastre. <ol><li> Preparare 12 ml di sospensione cellulare per piastra più 5 ml per adescamento. </li><li> Pulire micropiastre cassette dispenser dal lavaggio del tubo con 50 ml di acqua sterile. </li><li> Riempire le linee dispenser micropiastra con sospensione cellulare e lasciare 5 ml di sospensione cellulare fluire attraverso. </li><li> Selezionare un programma che dispensare 100 ml in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti bianco-murato. Dispensare, e ripetere se necessario per piastre supplementari. Sementi anche alcuni pozzi in una chiara piatto fondo piatto da 96 pozzetti, se si utilizzano le piastre bianche pareti opache-fondo per la verifica della salute delle cellule e la densità. </li><li> Al termine, le celle a filo nel contenitore originale. Pulire la cassetta eseguendo 50 ml di etanolo al 70% seguita da 50 ml di acqua sterile calda attraverso il tubo. </li><li> Assicurarsi cassette e tubi sono aptamente puliti tra usi. </li></ol></li><li> Incubare le cellule per 24 ore a 37 ° C in un umidificata al 5% di CO 2 incubatore. </li></ol> 3 Preparazione di Viral curva standard <ol><li> Preparare una curva standard di VSVΔ51-Fluc in DMEM senza siero tale che la concentrazione finale delle unità formanti placca (PFU) per ml dopo il trasferimento su cellule Vero è la seguente: 10 8 pfu / ml, 10 7 pfu / ml, 10 6 pfu / ml, 10 5 pfu / ml, 10 4 pfu / ml, 10 3 pfu / ml, 10 2 pfu / ml, e 10 1 pfu / ml. Preparare 50 ml di ciascuna concentrazione per piastra di cellule Vero, più un ulteriore 10%. NOTA: Titer del virus magazzino luciferasi dovrà essere valutata in modo classico 10, al fine di generare una curva standard che permetterà per la quantificazione assoluta. Altrimenti relativa quantificazione può essere raggiunto senza informazioni precise titolo fissando arbitrariamente titolo virale basatasui gradini di diluizione. Ad esempio la prima diluizione della curva standard può essere impostato su 10 8 unità virali e la diluizione 1/10 testo seguente 10 7 e così via. In questo contesto, si dovrebbe esprimere i valori come un fold-variazione rispetto ad un campione predeterminato come quantificazione assoluta non sarà preciso. </li></ol> 4 Trasferimento di surnatante del campione su celle di consenso <ol><li> Controllare cellule Vero placcato nella piastra a 96 pozzetti con fondo trasparente sotto un microscopio ottico per confermare che monostrati sono almeno il 95% confluenti. </li><li> Trasferire 25 ml di campione di surnatante su cellule Vero seminate in piastre bianche pareti. Non trasferire surnatanti nelle 2 colonne designate per le curve standard. NOTA: Questo può essere fatto contemporaneamente per tutti i pozzetti su un unico piatto utilizzando un gestore di liquido a 96 canali. </li><li> Utilizzando una pipetta multicanale a 8 o 12 canali, aggiungere 25 ml di ogni diluizione della curva standard preparata al punto 3 per le cellule Vero inle 2 colonne designate. </li><li> Piastre di centrifugazione per 5 min a 430 xg a temperatura ambiente. </li><li> Incubare per 5 ore a 37 ° C in un umidificata al 5% di CO 2 incubatore. </li></ol> 5 Valutazione della vitalità cellulare <ol><li> NOTA: Quando si avvia da surnatanti ottenuti da esperimenti di infezione fatto in piastre a 96 pozzetti chiari, la redditività del campione può essere valutata prima di quantificazione con un indicatore di vitalità cellulare colorante come resazurina. </li><li> Aggiungere resazurina in quantità pari al 10% del volume in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti di campioni contenenti virus e cellule. Includi cellulare solo controlla e di controllo solo media per determinare rispettivamente i valori per il 100% e 0% vitalità. </li><li> Dopo 2-4 ore (tempo di incubazione varia a seconda del tipo di cellula e sulla concentrazione di disponibili in commercio o in polvere ricostituito del colorante), leggere e registrare il segnale utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza (eccitazione 530-560, 590 emissione). Relazione viabili cellularety per un campione in base alla formula relativa attività metabolica = ((segnale campione di prova - segnale di controllo negativo) / (cellulare segnale di controllo solo - segnale di controllo negativo)) x 100% </li></ol> 6 Preparazione del substrato luciferina <ol><li> 30 minuti prima della fine dell&#39;incubazione 5 ore, preparare la luciferina per ottenere una soluzione / ml 2 mg sterile tampone fosfato salino (PBS). Preparare 2,5 ml per piastra più un extra di 2 ml. Proteggere la soluzione dalla luce. NOTA: La luciferina può anche essere preparato in precedenza in giornata e conservato a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 7 Lettura bioluminescenza <ol><li> Dopo il periodo di incubazione di 5 ore, aggiungere 25 ml di luciferina in ciascun pozzetto di cellule Vero nei piatti solidi bianchi. Aggiungere luciferina manualmente o con un dosatore automatico integrato nel luminometro. NOTA: L&#39;uso di uno strumento con unico punto singolo e end legge può richiedere l&#39;aggiunta di una luciferasi lisi BUF compatibilefer prima di aggiungere il substrato luciferina di migliorare la coerenza. </li><li> Leggere le piastre con i seguenti parametri: <ol><li> Agitare per 5 sec. </li><li> Attendere 30 sec. </li><li> Leggi luminescenza ad un appropriato valore di sensibilità / esposizione fisso. Se l&#39;opzione è disponibile sullo strumento, utilizzare multi-point legge (ad esempio, matrice 3 x 3) per migliorare la precisione. </li></ol></li><li> Registrare e salvare l&#39;intensità bioluminescente quantificato. </li><li> Se un distributore automatico è stato utilizzato per aggiungere luciferina spurgare la luciferina e adescare le linee con acqua sterile tiepida. </li></ol> Analisi dei dati 8. <ol><li> Per ottenere risultati accurati, risolvere la regressione non lineare per generare un&#39;equazione Hill dalle curve standard. Applicare questa equazione per i campioni titolato al fine di calcolare le unità di espressione virale. Alcuni virus o situazioni possono produrre una curva standard con una relazione lineare; in questo caso per risolvere una equazione lineare. </li></ol>

<ol><li>Grigorov, B., Rabilloud, J., Lawrence, P., Gerlier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+titration+of+measles+and+other+viruses%3A+optimization+with+determination+of+replication+cycle+length%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid titration of measles and other viruses: optimization with determination of replication cycle length.</a> PLoS One. 6 (e24135), (2011).</li>
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<li>Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Ebola+virus+expressing+luciferase+allows+for+rapid+and+quantitative+testing+of+antivirals%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals.</a> Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).</li>
<li>Diallo, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+pharmacoviral+approach+identifies+novel+oncolytic+virus+sensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A high-throughput pharmacoviral approach identifies novel oncolytic virus sensitizers.</a> Mol Ther. 18, 1123-1129 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;approccio basato luciferasi-qui descritta fornisce una serie di vantaggi rispetto ad altri metodi esistenti, compresa la sua facilità, rapidità, minima necessità di attrezzature, e relativamente a basso costo. Un contributo fondamentale a questo è quello di evitare una fase di diluizione seriale. Tuttavia, i derivati ​​di serie a base di diluizione, di questo protocollo sono certamente fattibile e sono stati recentemente utilizzati per valutare-luciferasi che esprimono Ebola titoli in uno schermo antivirale high-throughput 11. Mentre intrinsecamente più tempo e più costoso, tali adattamenti possono fornire una maggiore gamma dinamica per la quantificazione virale quando necessario. Oltre ad essere particolarmente adatto per la valutazione titoli virali nel contesto degli schermi high-throughput, il nostro metodo di quantificazione virale base di uno stadio luciferasi genera stime accurate di virioni infettivi nel caso di replicare virus. Inoltre, letture di luminescenza insieme ai dati di citotossicità dello stesso esperimento danno una piùquadro completo l&#39;effetto delle condizioni sperimentali su cellule bersaglio, che è particolarmente utile nel contesto di virus oncolitici e schermi di droga. L&#39;esempio qui illustrato utilizza un replicante virus RNA a singolo filamento negativo; Tuttavia, questo protocollo può essere adattato ad un numero di replicare e non replicanti virus con pochi adattamenti protocollo minori. Questo include virus a DNA come vaccinico, HSV, e AAV (vedi Figura 5). I campioni infettati da virus intracellulari, come il virus vaccinico, ad esempio, richiedono un passo virus-release prima di quantificazione (ad esempio, almeno un ciclo gelo-disgelo). Quando si applica questa tecnica ad altri virus, è necessario ottimizzare il tempo di incubazione dal trasferimento del surnatante virale o lisato alla lettura delle piastre dal luminometro. Questo parametro dipende principalmente dal ciclo di replicazione del virus nella linea cellulare permissiva e la forza del promoter guida espressione luciferasi. Questo è fatto meglio usando la curva standard completa nella fase di ottimizzazione. Per fare questo, si deve infettare la linea cellulare permissiva appropriata con varie repliche della curva standard preparata e leggere ogni replica in un momento diverso punti post-trasferimento. Idealmente, un punto di tempo di incubazione è scelto che conduce ad una relazione lineare tra LOG (RLU) e LOG (titolo) che attraversa il campionario titolo atteso. Per VSVΔ51-Fluc, questo è in genere da 10 a 4 pfu / ml -10 7 pfu / ml per un tempo di incubazione 5 ore. Se titoli inferiori o superiori sono attesi da campioni, si può semplicemente aumentare o ridurre il tempo di incubazione, rispettivamente. In alternativa, i campioni possono essere diluiti per rientrare nel campo di quanto avviene tipicamente per ELISA. Come accennato in precedenza, questo metodo è adatto per eseguire droga schermi high-throughput utilizzando librerie di droga, come la maggior parte delle operazioni possono essere automatizzate. Le cellule possono essere placcati efficiently utilizzando un dispensatore di micropiastre automatico, la biblioteca farmaco può essere aggiunto utilizzando un gestore di liquido a 96 canali, virus può essere aggiunto utilizzando un dispenser di micropiastre e piastre leggere utilizzando un luminometro automatico. In teoria, questo può anche essere adattato a 384 pozzetti o formati più piccoli; tuttavia, la limitazione a tal fine è il numero di cellule che possono essere placcato, dato minor numero di cellule porta ad una gamma più ristretta nella linearità del LOG (RLU) a LOG (Titer) rapporto. Infine, la valutazione della vitalità cellulare mediante resazurina o altri coloranti metabolici può essere facilmente integrato nel flusso di lavoro, consentendo la discriminazione di composti citotossici in schermi antivirali o identificazione di composti che portano alla uccisione sinergica in combinazione con virus 12. Tuttavia, le limitazioni di questo metodo includono il requisito di un virus transgene che esprime la luciferasi, che non è sempre possibile, e la disponibilità di una linea cellulare permissiva sufficientemente. Tuttavia, è probabile possibile adattareil metodo usato con altri geni reporter (per esempio, GFP), se il metodo di quantificazione giornalista ha una linearità adatto e rapporto segnale rumore. In generale, il metodo high-throughput descritto può essere modificato per soddisfare molti virus diversi e su misura per diverse applicazioni.

I classici saggi di placca virale continuano ad essere un pilastro nella ricerca sui virus, anche se possono richiedere notoriamente molto tempo e costituiscono un collo di bottiglia significativo per ottenere risultati dagli esperimenti. Sono emersi metodi di quantificazione indiretta del virus più rapidi, tra cui la reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR), l'ELISA e la citometria a flusso1-4. Recenti innovazioni, come il contatore di virus Virocyt, sono in grado di contare direttamente i virus utilizzando una tecnologia avanzata di smistamento a flusso e attraverso una combinazione di coloranti proteici e DNA/RNA5. Sebbene tutti questi metodi abbiano indubbiamente accelerato il ritmo della ricerca sui virus, ogni metodo ha i suoi vantaggi e svantaggi. Ad esempio, la qPCR può consentire la quantificazione di una specifica sequenza del genoma virale, ma non può discriminare efficacemente i virioni infettivi da quelli difettosi6. I test ELISA possono essere molto specifici, ma richiedono un anticorpo adatto contro la proteina virale bersaglio desiderata e possono essere molto costosi. Sebbene la tecnologia della citometria a flusso offra molti vantaggi e sia migliorata in modo significativo, la produttività e l'accessibilità ad apparecchiature altamente specializzate rimangono comunque un ostacolo. È importante sottolineare che tutte queste tecniche non sono ideali per lo screening ad alto rendimento, per il quale la facilità e il tempo necessari per la fase di quantificazione del virus sono di fondamentale importanza.
Qui descriviamo una tecnica ad alto rendimento e facilmente automatizzabile per titolare i virus che esprimono un transgene della luciferasi Firefly (Fluc). Questo metodo genera titoli virali approssimativi in un campione di prova basato sulla lettura del segnale di luminescenza attraverso l'uso parallelo di una curva standard di quantità note di virus. I campioni contenenti quantità sconosciute di virus che esprimono la luciferasi vengono trasferiti su una linea cellulare permissiva "plaquing" in parallelo con la curva di diluizione standard del virus e la luminescenza associata al virus viene letta dopo alcune ore di incubazione. Ciò consente una generazione di risultati rapida e quantitativa, spesso nello stesso giorno, a differenza dei classici protocolli di analisi delle placche che in genere richiedono diversi giorni di incubazione per contare manualmente le placche visibili7-9. 
Il protocollo delinea i passaggi del nostro metodo di titolazione utilizzando il virus della stomatite vescicolare oncolitica che codifica un transgene Fluc (VSV∆51-Fluc) come esempio e fornisce una panoramica di 1. Preparazione del campione 2. La piastrina di una linea cellulare permissiva per la titolazione del virus utilizzando un dosatore automatico 3. La preparazione della curva standard virale 4. Il trasferimento dei surnatanti del campione sulla linea cellulare permissiva utilizzando un pipettatore manuale a 96 pozzetti 5. La valutazione della citotossicità del campione utilizzando un reagente di vitalità cellulare 6. La preparazione del substrato di luciferina 7. Lettura della bioluminescenza e 8. Analisi dei dati.

<table><tbody><tr><td>Dulbeccos' Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>NorthBio Inc.</td><td>NBSF-701</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td>Preparare una soluzione da 1 mM, pH 7,3</td></tr><tr><td>alamarBlue&nbsp;</td><td>AbD Serotec</td><td>BUF012B</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin sale di potassio</td><td>Biotium</td><td>10101-2</td><td></td></tr><tr><td>96-well solid white flat bottom polystyrene trattato TC micropiastre</td><td>Corning</td><td>3917</td> a <td>384 pozzetti possono essere utilizzate anche per una maggiore produttività</td></tr><tr><td>Synergy Mx</td><td>BioTek</td><td>SMTBL</td><td>Monocromatore lettore di micropiastre</td></tr><tr><td>Liquidator96</td><td>Mettler Toledo</td><td>LIQ-96-200</td><td>Sistema di pipettaggio manuale a 96 puntali</td></tr><tr><td>Liquidator96 LTS Puntali sterilizzati con filtri</td><td>Mettler Toledo</td><td>LQR-200F</td><td>Tutti i puntali filtrati sterili compatibili con i pipettatori di scelta sono appropriati</td></tr><tr><td>Microflo</td><td>BioTek</td><td>111-206-21</td><td>Utilizzato per la piastra di cellule in una piastra a 96 pozzetti</td></tr><tr><td>Fluorimetro per micropiastre</td> <td>Fluoroskan Ascent FL</td><td>Thermo Scientific</td><td>5210450</td></tr></tbody></table>

high-throughput titolazione della luciferasi che esprimono ricombinanti virus

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

I test standard per determinare i titoli virali infettivi possono richiedere molto tempo, non sono suscettibili di un volume elevato di campioni e non possono essere eseguiti con virus che non formano placche. In alternativa ai saggi di placca, abbiamo sviluppato un metodo di titolazione ad alto rendimento che consente la titolazione simultanea di un volume elevato di campioni in un solo giorno. Questo approccio prevede l'infezione dei campioni con un virus marcato con luciferasi Firefly, il trasferimento dei campioni infetti su una linea cellulare permissiva appropriata, la successiva aggiunta di luciferina, la lettura delle piastre per ottenere letture di luminescenza e infine la conversione da luminescenza a titoli virali. La valutazione della citotossicità utilizzando un colorante per la vitalità metabolica può essere facilmente incorporata nel flusso di lavoro in parallelo e fornire informazioni preziose nel contesto di uno screening farmacologico. Questa tecnica fornisce un metodo affidabile e ad alto rendimento per determinare i titoli virali in alternativa a un test standard su placca.

Una sintesi del flusso che descrive il metodo ad alta produttività è illustrato in Figura 1. Figura 2 mostra i risultati di una tipica curva standard ofVSVΔ51-Fluc. Quattro parametro analisi di regressione non lineare generato una trama collina da cui ingresso sconosciuto pfu (stima del titolo virale) possono essere interpolati. Questi titoli stimati sono denominate unità di espressione virali (VEU). Figura 3A mostra VEUS e titoli ottenuti eseguendo un saggio di targa di serie con gli stessi campioni 10. I campioni provenivano da un esperimento in cui sono stati utilizzati vari prodotti chimici per migliorare la replicazione e la diffusione di VSVΔ51-Fluc in 786-0 cellule. VEUS interpolato dalla curva standard deve essere moltiplicato per un fattore che è basato sulla diluizione del campione surnatanti stati trasferiti a cellule Vero (in questo caso, il fattore di diluizione è 5). La correlazione lineare tra titoli e VEU è mostrato in Figura 3B </strong&gt; Con un R 2 di 0,8083 e r punteggio di un Pearson di 0,899 (p &lt;0,0001). Nella Figura 4, i dati tipici citotossicità cellulo ottenuti da un test metabolico è indicata per 786-0 cellule trattate con sostanze chimiche prima di infezione da VSVΔ51-Fluc. Infine, la Figura 5 mostra le curve tipiche standard ottenute con vari virus (Herpes Simplex Virus (HSV), il virus vaccinico, e virus adeno-associato (AAV), tutti esprimono luciferasi Firefly) e descrive i tempi di incubazione e cicli di gelo e disgelo, come richiesto. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 Flusso di lavoro di high-throughput titolazione virus e test di citotossicità utilizzando VSV Δ 51-Fluc. (A) Seed 2,5 x 10 4 cellule Vero per pozzetto (100 ml) e incubare a 37 ° C. (B) 24hr trasferimento successivamente 25 ml di curva standard su cellule Vero (2 colonne per piastra). (C) Trasferire 25 ml di campioni per essere titolati a rimanenti cellule Vero. Piastre di centrifuga e incubare a 37 ° C. (D) per un importo pari al 10% del volume del bene, aggiungere il reagente resazurina alla piastra contenente i campioni originali. Incubare le piastre a 37 ° C. (E) Dopo 3 ore, leggere e registrare la fluorescenza e valutare la citotossicità. (F) Dopo 5 ore, aggiungere 25 ml di soluzione di 2 mg / ml di luciferina in ogni pozzetto di cellule Vero. Leggi luminescenza e calcolare Unità Espressione virali. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 Previsto curva standard di VSV Δ 51-Fluc. Espressione luciferasi me eraasured 5 hr trasferimento, dopo il surnatante in cinque punti diversi all&#39;interno di un pozzo con un luminometro e bioluminescenza è stato espresso in media unità di luce relativa (RLU). RLU media è stata rilevata in entrata noto pfu / ml per risolvere la regressione non lineare e generare una equazione di Hill. La media delle due curve ripetute e barre di errore standard sono riportati (R 2 = 0,9993). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 Confronto di titoli test placca standard con quelli ottenuti con il metodo alto throughput. (A) titoli virali in pfu / ml ottenuti dal saggio di placca standard su cellule Vero sono stati confrontati con titoli virali calcolati (VEU / ml) dagli stessi campioni titolati utilizzando il saggio high-throughput luciferasi. (B) relazione lineare tra VEU / ml e titolo ottenuto tramite p di serietest Laque. Sono mostrati curva di regressione lineare e coefficiente di determinazione (R 2). <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4 Esempio di vitalità. Redditività del campione prima del trasferimento surnatante su cellule Vero è stata determinata valutando l&#39;attività metabolica cellulare usando una soluzione resazurina disponibile in commercio. Valori di fluorescenza Raw sono stati normalizzati a quella di non trattati, pozzi non infetti. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5 Previsto curve standard con HSV, Vaccinia, e virus AAV. Espressione luciferasi è stata misurata in cinque punti diversi all&#39;interno di un pozzo con un luminometro e bioluminescenza è stato espresso in rela medigruppi ottici tivi (RLU). (A) curva standard HSV è stato aggiunto su cellule Vero placcato 24 ore prima ad una densità di 2,5 x 10 4 cellule per pozzetto (100 ml) e la misurazione della luciferasi è stata fatta 17 ore dopo il trasferimento surnatante (R 2 = 0,9489, n = 1). Un&#39;equazione Hill è stata generata risolvendo la regressione non lineare. Curva standard (B) vaccinico stato aggiunto su cellule Vero placcato 24 h prima una densità di 2,5 x 10 4 cellule per pozzetto (100 microlitri) e incubate per 2,5 ore a 37 ° C, dopo di che sono state prese le misure luciferasi (R 2 = 0,9892). Un&#39;equazione lineare è stata generata risolvendo per la regressione lineare. (C) AAV curva standard è stato aggiunto su cellule di carcinoma polmonare umano (A549) placcato 24 ore prima ad una densità di 2,5 x 10 4 cellule per pozzetto (100 microlitri) e la misurazione luciferasi è stata fatta 24 ore dopo l&#39;infezione. Un&#39;equazione Hill è stata generata risolvendo la regressione non lineare. La mediadi sono mostrati cinque curve ripetute e barre di errore standard (R 2 = 0,9926).

Questo articolo presenta un metodo basato sull'espressione della luciferasi ad alto rendimento per titolare vari virus a RNA e DNA utilizzando gestori di liquidi automatizzati e manuali.

High-throughput Titolazione della luciferasi che esprimono ricombinanti virus

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è stimare i titoli virali di un virus marcato con luciferasi utilizzando un metodo di quantificazione ad alto rendimento. Questo viene ottenuto trasferendo il sopranatante dei campioni da titolare, insieme a una curva standard virale, su una linea cellulare permissiva per consentire l'espressione della luciferasi. Come secondo passaggio, può essere aggiunto Resazurin ai campioni originali, che verrà utilizzato per valutare la vitalità cellulare.Successivamente, dopo un tempo di incubazione appropriato, la luciferina viene aggiunta alle cellule al fine di quantificare la bioluminescenza. I risultati mostrano la quantità di virus nel campione in base all'espressione della luciferasi.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il conteggio delle placche, è che un elevato numero di campioni può essere processato rapidamente e simultaneamente. Questo metodo può inoltre essere esteso a virus esprimenti luciferasi non formatori di placche, poiché non dipende dalla formazione di placche. Un rilevamento della citotossicità cellulare può essere facilmente integrato nel flusso di lavoro ed essere utile nel contesto di uno schermo farmacologico. A illustrare la procedura saranno Vanessa, Ramya e Colin, tre studenti laureati del mio laboratorio. Eseguire innanzitutto le infezioni utilizzando VSV-Delta 51 che esprime la luciferasi di Firefly in piastre per colture cellulari a 96 pozzetti. I soprannatanti di queste piastre verranno titolati dopo un tempo di incubazione appropriato. 24 ore prima della titolazione, preparare una sospensione di cellule Vero a una concentrazione di 2,5 × 10⁵ cellule per millilitro in DMEM contenente 10% di FBS, 30 millimoli di HEPES e 1% di penicillina-streptomicina. Seminare 2,5 × 10⁴ cellule in piastre bianche a 96 pozzetti, con fondo piatto e solido, utilizzando un distributore per micropiastre. Per preparare la sospensione cellulare, pulire la cassetta del distributore per micropiastre lavando i tubi con 50 millilitri di acqua sterile.Quindi riempire i tubi del dispensatore per micropiastre con la sospensione cellulare, facendo scorrere cinque millilitri di sospensione cellulare. Selezionare un programma che eroghi 100 microlitri in ogni pozzetto di una piastra da 96 pozzetti con pareti bianche. Eseguire l'erogazione e ripetere se necessario per piastre aggiuntive. Seminare anche alcuni pozzetti in una piastra trasparente da 96 pozzetti con fondo bianco per verificare lo stato di salute e la densità delle cellule.Al termine, rimandare le cellule nel contenitore originale. Pulire la cassetta facendo passare 50 millilitri di etanolo al 70%, seguiti da 50 millilitri di acqua sterile tiepida, attraverso il tubo. Successivamente, incubare le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius in un'incubatrice umidificata con anidride carbonica al 5%.Preparare una curva standard di VSV-Delta-51 in DMEM privo di siero in modo che la concentrazione finale di unità formanti placche per millilitro, dopo il trasferimento su cellule Vero, sia la seguente. Preparare 50 microlitri di ogni concentrazione per piastra di cellule Vero, più un 10% aggiuntivo. La curva standard può essere trasferita in una piastra 96 pozzetti profonda. Successivamente, osservare al microscopio ottico le cellule Vero seminate nella piastra 96 pozzetti con fondo trasparente per verificare che i monociti siano confluenti almeno al 95%. Trasferire 25 microlitri di surnatante campione sulle cellule Vero seminate nelle piastre con pareti bianche utilizzando una pipetta multicanale a 12 canali, aggiungendo 25 microlitri di ciascuna diluizione della curva standard alle cellule Vero nelle due colonne designate. Centrifugare le piastre per cinque minuti a 430 g a temperatura ambiente. Quindi incubare le piastre per cinque ore a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5%.A questo punto, aggiungere resazurina in una quantità pari al 10% del volume in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti contenente virus e cellule. Dopo due o quattro ore, leggere e registrare il segnale con un lettore di piastre a fluorescenza utilizzando un intervallo di eccitazione tra 530 e 560 e un'emissione a 590. Riportare la vitalità cellulare per il campione secondo la seguente formula.30 minuti prima della fine dell'incubazione di cinque ore, preparare la luciferina per ottenere una soluzione di due milligrammi per millilitro in soluzione salina fosfato sterile. Proteggere la soluzione dalla luce. Al termine del periodo di incubazione di cinque ore, aggiungere 25 microlitri di luciferina in ogni pozzetto delle cellule Vero presenti nelle piastre bianche solide, utilizzando un distributore automatico integrato nel luminometro. Leggere le piastre con i seguenti parametri.Agitare per cinque secondi e attendere 30 secondi. Leggere la luminiscenza a un valore appropriato e fisso di sensibilità/esposizione, quindi registrare e salvare l'intensità bioluminescente quantificata. Se per aggiungere la luciferina è stato utilizzato un distributore automatico, svuotare la luciferina e preparare le linee con acqua sterile. Per ottenere risultati accurati, risolvere la regressione non lineare per generare un'equazione di Hill a partire dalle curve standard.Applicare questa equazione ai campioni titolati per calcolare le unità di espressione virale. I risultati di una curva standard tipica di VSV-Delta 51 sono mostrati qui. Un'analisi di regressione non lineare a quattro parametri ha generato un grafico di Hill, dal quale è possibile interpolare le unità sconosciute di formazione di placche. I titoli virali ottenuti mediante saggio standard di formazione di placche su cellule Vero sono stati confrontati con i titoli virali calcolati dagli stessi campioni titolati utilizzando il saggio ad alta produttività della luciferasi. I campioni provengono da un esperimento in cui diversi composti chimici sono stati utilizzati per potenziare la replicazione e la diffusione di VSV-Delta-51 in cellule 786-0. La correlazione lineare tra titoli e unità di espressione virale, con un valore di R quadro pari a 0,8083 e un coefficiente R di Pearson di 0,899, è rappresentata qui. Sono mostrati qui i dati tipici di citotossicità cellulare ottenuti da un saggio metabolico su cellule 786-0 trattate con sostanze chimiche prima dell'infezione con VSV-Delta-51. Sono mostrate qui curve standard tipiche ottenute con il virus dell'herpes simplex, il virus della vaccinia e il virus adeno-associato, tutti esprimenti la luciferasi della lucciola. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per eseguire schermate ad alto rendimento di librerie di composti in combinazione con il virus di interesse per generare dati di titolo ed effetti citotossici. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale ricordare di diluire correttamente la curva standard, poiché ciò è essenziale per l'interpolazione delle unità di espressione virale.Non dimenticare che lavorare con virus vivi può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni come operare all'interno di una cappa a sicurezza biologica e indossare l'apposita dotazione di protezione individuale durante l'esecuzione di questa procedura. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stimare i titoli virali utilizzando un metodo di quantificazione ad alto rendimento basato sull'espressione di un transgene luciferasi e sulla misurazione della bioluminescenza per interpolazione di unità virali sconosciute a partire da una curva standard. La citotossicità del campione può essere contemporaneamente determinata mediante un appropriato saggio di vitalità.

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Biologia

Per rendere lentivirus, vettori di DNA sono transfettate in 293 cellule umane. Dopo la raccolta e concentrando il surnatante, titolo del virus è determinata dalla espressione fluorescenza con un citometro a flusso.

Lentivirus Produzione

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates a luciferase-based pseudovirus titration assay to determine the optimal target cell density for maximum infection. By comparing luminescence across cell densities, the method ensures high assay sensitivity and reproducibility for downstream applications.

Determining Optimal Target Cell Density Using a Luciferase-Based Pseudovirus Infection Assay

Il video mostra il dosaggio della luciferasi utilizzato per quantificare le proteine marcate con luciferasi. Il test utilizza un enzima luciferasi ingegnerizzato composto da un frammento di grandi dimensioni che si lega al frammento piccolo, che è coniugato con una proteina di interesse. Le subunità legate formano un enzima attivo che, in presenza del substrato, rilascia un segnale luminescente. Questo segnale viene quindi quantificato utilizzando un luminometro.

Il saggio della luciferasi: un test ad alto rendimento per misurare i segnali luminescenti utilizzando bioreporter ingegnerizzati basati su sistemi di nanoluciferasi

Questo video mostra una tecnica in vitro per rilevare l'infezione da virus dell'epatite B (HBV) tramite un sistema reporter HBV ricombinante. Dopo aver infettato le cellule ospiti, il genoma virale ricombinante esprime l'enzima reporter luciferasi, che produce bioluminescenza dopo l'ossidazione del suo substrato, aiutando a rilevare l'infezione virale.

Un sistema reporter di virus ricombinante in vitro per il rilevamento di infezioni virali

Questo video dimostra un metodo per tracciare le infezioni virali in modelli murini utilizzando una luciferasi ricombinante e un virus dell'influenza A che esprime la proteina ricombinante e la proteina fluorescente. Questo metodo consente studi sia in vivo che ex vivo, consentendo ai ricercatori di ottenere informazioni sulle dinamiche virali e sugli effetti degli interventi.

Un virus dell'influenza reporter fluorescente luciferasi per tracciare le infezioni virali

Questo video mostra un test per studiare la regolazione della traduzione nelle cellule infettate da poxvirus. Le cellule non infette e infettate da virus sono state co-trasfettate con mRNA codificanti per la luciferasi della lucciola (Fluc) e la Renilla luciferasi (Rluc), con l'mRNA di Fluc contenente una sequenza leader 5' Poly(A). Dopo l'aggiunta di substrati bioluminescenti su cellule lisate, misurare il segnale di entrambe le luciferasi per identificare il vantaggio traduzionale dell'mRNA...

Un test reporter sulla luciferasi per studiare la regolazione della traduzione nelle cellule infettate da poxvirus

Vi presentiamo un metodo di screening rapido e poco costoso per identificare regolatori trascrizionali utilizzando high-throughput transfezioni robotici e un dual-bagliore saggio di luciferasi in casa. Questo protocollo genera rapidamente dati scalo side-by-side funzionali per migliaia di geni ed è facilmente modificabile per indirizzare qualsiasi gene di interesse.

High-throughput screening funzionale utilizzando una casalinga Dual-glow Luciferase Assay

Qui, presentiamo un protocollo per generare particelle pseudotipizzate in un ambiente di BSL-2 che incorporano la proteina spike della sindrome respiratoria Medio Oriente di virus ad alta patogenicità e coronavirus della sindrome respiratoria acuta grave. Queste particelle pseudotipizzate contengono un gene del reporter di luciferase che permette la quantificazione dell'entrata del virus in cellule bersaglio.

Produzione di particelle pseudotipizzate per studiare la patogenicità coronavirus in un ambiente di livello 2 di biosicurezza

Presentiamo un protocollo per studiare la regolazione della traduzione di mRNA nelle cellule infettate da Poxvirus usando il saggio reporter di luciferasi basato sull'RNA trascritto in vitro. Il saggio può essere utilizzato per studiare la regolazione della traduzione da parte di CIS-elementi di un mRNA, tra cui 5'-non tradotto regione (UTR) e 3'-UTR. Diverse modalità di avvio della traduzione possono anche essere esaminate utilizzando questo metodo.

Saggio reporter di luciferase basato su RNA trascritto in vitro per il regolamento di traduzione dello studio nelle cellule infettate da Poxvirus

I virus dell'influenza A (IAV) sono patogeni respiratori contagiosi che causano epidemie annuali e pandemie occasionali. Qui, descriviamo un protocollo per monitorare le infezioni virali in vivo utilizzando una nuova luciferasi ricombinante e la fluorescenza-espressione bireporter IAV (BIRFLU). Questo approccio fornisce ai ricercatori un eccellente strumento per studiare IAV in vivo.

Un virus fluorescente di Luciferasi-fluorescente Reporter per l'imaging dal vivo e la quantificazione dell'infezione virale

Per identificare nuovi regolatori dei fattori di trascrizione, abbiamo sviluppato un approccio per lo screening delle librerie di arumani lentivirali o retrovirali con array utilizzando un saggio di reporter trascrizionale basato sulla doppia luciferasi. Questo approccio offre un modo rapido e relativamente poco costoso per vagliare centinaia di candidati in un unico esperimento.

Identificazione dei regolatori dei fattori di trascrizione mediante lo screening a media velocità di lettura di librerie in serie e un reporter basato su Dual-Luciferase

Scopri la titolazione virale ad alto rendimento basata su luciferasi per la virologia usando cellule Vero. Questo metodo consente di quantificare rapidamente i titoli virali e valutare la citotossicità in parallelo.

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