Name: De alta capacidade de Titulação de luciferase expressando recombinantes Vírus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprenda a titular vírus expressando luciferase em alta capacidade usando linhagens celulares permissivas e leitura de luminescência. Este método permite processar múltiplas amostras rapidamente enquanto avalia a viabilidade celular simultaneamente.

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Vanessa Garcia é financiada por uma bolsa de pós-graduação em ciência e tecnologia da Rainha Elizabeth II Ontário e Cory Batenchuk por uma bolsa do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia.

Preparação 1 Amostra <ol><li> Obtenção de amostras contendo vírus que expressam a luciferase (aqui VSVΔ51-Fluc como exemplo) para a titulação e a transferência para placas de 96 poços. Alternativamente, realizar infecções em placas de 96 poços de cultura de tecidos e os sobrenadantes usar diretamente. </li><li> Deixe duas colunas não tratadas para a inclusão de curvas padrão. Por experiências feitas directamente nas placas de 96 poços, de título no final da experiência (40 horas pós-infecção) ou armazenar a -80 ° C e titulação em data posterior. </li></ol> 2: Preparação de células permissivas para o vírus da Titulação <ol><li> 24 h antes da titulação, preparar uma suspensão de células Vero, a uma concentração de 2,5 x 10 5 células / ml em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS), HEPES 30 mM, e 1% de penicilina / estreptomicina. NOTA: Apesar de este protocolo utiliza células Vero, qualquer linha celular permissiva adequado para uma infecção VSV poderia be usado. </li><li> Semente de 2,5 x 10 4 células (100 ul) em placas de fundo plano de 96 poços sólidos brancos, utilizando um dispensador de microplacas. <ol><li> Preparar 12 ml de suspensão de células por placa de mais 5 ml de preparação. </li><li> Limpo microplaca cassete dispensador, através de lavagem com o tubo de 50 ml de água estéril. </li><li> Encha as linhas de microplacas dispensador com suspensão de células e deixou 5 ml de suspensão de células fluir. </li><li> Selecione um programa que irá dispensar 100 mL em cada poço de uma placa de 96 poços de paredes brancas. Dispensar, e repetir se necessário para placas adicionais. Sementes também alguns poços numa placa de 96 poços de fundo plano transparente se placas de paredes brancas opacas de fundo são usados ​​para verificação da saúde das células e densidade. </li><li> Quando terminar, lave as células de volta para o recipiente original. Limpar o cartucho através da execução de 50 ml de etanol a 70% seguido por 50 ml de água esterilizada quente através do tubo. </li><li> Certifique-cassete e tubos são apdamente limpo entre os usos. </li></ol></li><li> Incubar as células durante 24 horas a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO 2 incubadora. </li></ol> 3 Preparação da curva padrão viral <ol><li> Prepara-se uma curva padrão de VSVΔ51-Fluc em DMEM isento de soro, tal que a concentração final de unidades formadoras de placas (pfu) por ml depois de se transferir para as células Vero, é como se segue: 10 8 pfu / ml, de 10 7 pfu / ml, 10 6 pfu / ml, de 10 5 pfu / mL, 10 4 ufp / mL, 10 3 ufp / mL, 2 10 pfu / ml, e 10 1 ufc / ml. Prepare 50 mL de cada concentração por placa de células Vero, acrescido de um adicional de 10%. NOTA: Titer do estoque de vírus luciferase terá de ser avaliado de uma forma clássica de 10, a fim de gerar uma curva padrão que permita a quantificação absoluta. Caso contrário, a quantificação relativa pode ser obtida sem informação precisa titulação ajustando arbitrariamente título viral baseadoem passos de diluição. Por exemplo, a primeira diluição da curva padrão pode ser definido como 10 8 unidades virais e a diluição 1/10 a 10 seguintes e assim por diante 7. Neste contexto, deve-se expressar valores como um fold-change em comparação com uma amostra pré-determinada como a quantificação absoluta não será preciso. </li></ol> 4. Transferência de sobrenadantes de exemplo para células permissivas <ol><li> Verificar as células Vero plaqueadas no fundo claro-placa de 96 poços sob um microscópio de luz para confirmar que as monocamadas são pelo menos 95% confluentes. </li><li> Transferir 25 mL de amostra de sobrenadante sobre as células Vero semeados em placas de paredes brancas. Não transferir sobrenadantes nas duas colunas designadas por curvas padrão. NOTA: Este pode ser realizado simultaneamente em todos os poços de uma única chapa através de um manipulador de líquidos de 96 canais. </li><li> Usando uma pipeta de multi-canal 8 ou 12 canais, adicionar 25 ul de cada diluição da curva padrão preparada no Passo 3 para as células Veroas duas colunas designadas. </li><li> Centrifugar as placas durante 5 min a 430 xg à temperatura ambiente. </li><li> Incubar durante 5 horas a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO 2 incubadora. </li></ol> 5. avaliação da viabilidade celular <ol><li> NOTA: Ao iniciar a partir de sobrenadantes obtidos a partir de experiências de infecção Realizados em claras placas de 96 poços, a viabilidade da amostra pode ser avaliada antes da quantificação com um corante indicador de viabilidade celular, tais como resazurina. </li><li> Adicionar resazurina em uma quantidade igual a 10% do volume, em cada poço da placa de 96 poços de amostras que contêm vírus e as células. Incluir celular só controla bem como o controle apenas pela mídia para determinar os valores de 100% e 0% de viabilidade, respectivamente. </li><li> Depois de 2-4 horas (tempo de incubação pode variar, dependendo do tipo de célula e da concentração de pó de corante comercialmente disponível ou reconstituído), ler e gravar o sinal utilizando um leitor de fluorescência de placas (530-560 excitação, 590 de emissão). Relatório viabili celularty para uma amostra de acordo com a fórmula de Atividade = ((sinal da amostra de teste - sinal de controle negativo) / (Cell só sinal de controle - sinal de controle negativo)) Relativa Metabólica x 100% </li></ol> 6 Preparação do substrato luciferina <ol><li> 30 minutos antes do final do período de incubação de 5 horas, a luciferina preparar para se obter uma solução / ml 2 mg em tampão fosfato salino estéril (PBS). Prepare 2,5 ml por placa, mais um extra de 2 ml. Proteger a solução da luz. NOTA: A luciferina pode também ser preparado no início do dia e armazenadas a 4 ° C até à sua utilização. </li></ol> 7 Leitura Bioluminescência <ol><li> Após o período de incubação de 5 h, adicionar 25 ul de luciferina para cada poço de células Vero em placas de sólidos brancos. Adicionar luciferina manualmente ou com um distribuidor automático integrados no luminómetro. NOTA: O uso de um instrumento com apenas um único ponto e no final lê pode exigir a adição de um buf lise compatível luciferasefer antes da adição do substrato luciferina para melhorar a consistência. </li><li> Ler as placas com os seguintes parâmetros: <ol><li> Agitar durante 5 seg. </li><li> Espere 30 segundos. </li><li> Leia luminescência em um valor de sensibilidade / exposição fixa apropriado. Se a opção estiver disponível no instrumento, use multi-ponto lê (por exemplo, 3 x 3 matriz) para melhorar a precisão. </li></ol></li><li> Gravar e salvar a intensidade bioluminescente quantificado. </li><li> Se um distribuidor automático foi usado para adicionar luciferina purgar a luciferina e injetar as linhas com água esterilizada morna. </li></ol> Análise de Dados 8. <ol><li> Para resultados precisos, resolver a regressão não-linear para gerar uma equação de Hill a partir das curvas padrão. Aplicar esta equação para as amostras tituladas para calcular unidades de expressão virais. Alguns vírus ou situações podem produzir uma curva padrão com uma relação linear; neste caso, para resolver uma equação linear. </li></ol>

<ol><li>Grigorov, B., Rabilloud, J., Lawrence, P., Gerlier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+titration+of+measles+and+other+viruses%3A+optimization+with+determination+of+replication+cycle+length%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid titration of measles and other viruses: optimization with determination of replication cycle length.</a> PLoS One. 6 (e24135), (2011).</li>
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<li>Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Ebola+virus+expressing+luciferase+allows+for+rapid+and+quantitative+testing+of+antivirals%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals.</a> Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).</li>
<li>Diallo, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+pharmacoviral+approach+identifies+novel+oncolytic+virus+sensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A high-throughput pharmacoviral approach identifies novel oncolytic virus sensitizers.</a> Mol Ther. 18, 1123-1129 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A abordagem aqui descrita luciferase oferece um número de vantagens sobre os outros métodos existentes, incluindo a sua facilidade, rapidez, um equipamento mínimo necessário, e de custo relativamente baixo. Um contribuidor chave para isso é a prevenção de uma etapa de diluição serial. No entanto, os derivados à base de diluição em série deste protocolo são certamente viável e recentemente foram utilizados para avaliar expressando luciferase títulos de Ebola em uma tela antiviral de alto rendimento 11. Enquanto inerentemente mais demorado e mais caro, essas adaptações podem proporcionar uma maior gama dinâmica para quantificação viral quando necessário. Além de ser particularmente adequado para avaliar os títulos virais no contexto de telas de alto rendimento, o nosso método de quantificação viral a partir de uma etapa de luciferase gera estimativas precisas dos viriões infecciosos, no caso de se replicar os vírus. Além disso, as leituras de luminescência ao longo de citotoxicidade com dados a partir do mesmo experimento dar um maisimagem completa do efeito das condições experimentais em células alvo, o que é especialmente útil no contexto de vírus oncolí ticos e telas de drogas. O exemplo mostrado aqui utiliza um vírus RNA fita única replicando negativo; No entanto, este protocolo pode ser adaptado a um número de replicação e não replicação de vírus com alguns ajustamentos menores do protocolo. Isto inclui os vírus de ADN tais como Vaccinia, o HSV, e de AAV (ver Figura 5). As amostras infectadas com os vírus intracelulares, tais como vírus vaccinia, por exemplo, requerem um passo de libertação antes da quantificação do vírus (por exemplo, pelo menos um ciclo de congelação-descongelação). Quando se aplica esta técnica para outros vírus, o que é necessário para optimizar o tempo de incubação da transferência do sobrenadante viral ou lisado para a leitura das placas pelo luminómetro. Este parâmetro depende principalmente no ciclo de replicação do vírus na linha celular permissiva e a força do promoter dirigir a expressão da luciferase. Este é o melhor feito usando a curva padrão completo na etapa de otimização. Para fazer isso, é necessário infectar a linha celular permissiva apropriado com várias repetições da curva padrão preparada e ler cada replicar num momento diferente de pontos de pós-transferência. Idealmente, um ponto de tempo de incubação é escolhido de que conduz a uma relação linear entre LOG (RLU) e LOG (título) que abrange o intervalo de amostra título esperado. Para VSVΔ51-Fluc, este é tipicamente a partir de 10 4 pfu / ml -10 7 pfu / ml para um tempo de incubação de 5 h. Se os títulos mais baixos ou mais elevados são esperados a partir de amostras, pode-se simplesmente aumentar ou reduzir o tempo de incubação, respectivamente. Como alternativa, as amostras podem ser diluídas para cair dentro da gama muito como é feito tipicamente por ELISA. Como mencionado acima, este método é também adequado para realizar telas de alto rendimento de drogas usando bibliotecas de drogas como a maior parte dos passos pode ser automatizado. As células podem ser plaqueadas efficiently utilizando um dispensador automático de microplacas, a biblioteca de fármacos pode ser adicionado utilizando um manipulador de líquidos de 96 canais, o vírus pode ser adicionado utilizando um dispensador de microplacas e placas lida utilizando um luminómetro automatizado. Em teoria, este também pode ser adaptado para 384 poços ou formatos mais pequenos; no entanto, a limitação para este fim é o número de células que podem ser banhados, dadas menos células leva a uma faixa mais estreita na linearidade do LOG (RLU) a relação log (Titer). Finalmente, avaliação da viabilidade celular utilizando resazurina ou outros corantes metabólicos podem ser facilmente incorporados no fluxo de trabalho, permitindo a discriminação de compostos citotóxicos em telas antivirais ou identificação de compostos que levam à morte sinérgica em combinação com o vírus 12. No entanto, as limitações deste método incluem a necessidade de um vírus que expressa transgene da luciferase, o que nem sempre é possível, e a disponibilidade de uma linha celular suficientemente permissiva. No entanto, é provável possível adaptaro método para ser utilizado com outros genes repórter (por exemplo, GFP), desde que o método de quantificação repórter tem uma linearidade adequada e a relação sinal-ruído. No geral, o método de alto rendimento descrito pode ser modificado para atender muitos vírus diferentes e adaptadas às diversas aplicações.

Os ensaios clássicos de placas virais continuam a ser um dos pilares da pesquisa de vírus, embora possam ser notoriamente demorados e constituam um gargalo significativo para a obtenção de resultados de experimentos. Métodos de quantificação indireta de vírus mais rápidos surgiram, incluindo reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), ELISA e citometriade fluxo 1-4. Inovações recentes, como o contador de vírus Virocyt, podem contar diretamente os vírus usando tecnologia avançada de classificação de fluxo e por meio de uma combinação de proteínas e corantes de DNA / RNA5. Embora todos esses métodos tenham, sem dúvida, acelerado o ritmo da pesquisa de vírus, cada método tem suas vantagens e desvantagens. Por exemplo, a qPCR pode permitir a quantificação da sequência específica do genoma viral, mas não pode discriminar efetivamente os vírions infecciosos dos defeituosos6. Os ELISAs podem ser muito específicos, no entanto, requerem um anticorpo adequado contra a proteína viral alvo desejada e podem ser muito caros. Embora a tecnologia de citometria de fluxo ofereça muitas vantagens e tenha melhorado significativamente, o rendimento e a acessibilidade a equipamentos altamente especializados continuam sendo um obstáculo. É importante ressaltar que todas essas técnicas não são ideais para triagem de alto rendimento, para a qual a facilidade e o tempo necessários da etapa de quantificação do vírus são de importância crítica.
Aqui descrevemos uma técnica de alto rendimento e facilmente automatizável para titular vírus que expressam um transgene de luciferase Firefly (Fluc). Este método gera títulos virais aproximados em uma amostra de teste com base em leituras de sinal de luminescência através do uso paralelo de uma curva padrão de quantidades conhecidas de vírus. Amostras contendo quantidades desconhecidas de vírus que expressam luciferase são transferidas para uma linha celular permissiva de "plaquing" em paralelo com a curva de diluição padrão do vírus e a luminescência associada ao vírus é lida após algumas horas de incubação. Isso permite a geração de resultados rápida, quantitativa e geralmente no mesmo dia, ao contrário dos protocolos clássicos de ensaio de placa, que normalmente requerem vários dias de incubação para contar manualmente as placas visíveis7-9. 
O protocolo descreve as etapas do nosso método de titulação usando o vírus da estomatite vesicular oncolítica que codifica um transgene Fluc (VSV∆51-Fluc) como exemplo e fornece uma visão geral de 1. Preparação da amostra 2. O plaqueamento de uma linhagem celular permissiva para titulação de vírus usando um dispensador automatizado 3. A preparação da curva padrão viral 4. A transferência dos sobrenadantes da amostra para a linha celular permissiva usando um pipetador manual de 96 poços 5. A avaliação da citotoxicidade da amostra usando um reagente de viabilidade celular 6. A preparação do substrato de luciferina 7. Leitura de bioluminescência e 8. Análise de dados.

<table><tbody><tr><td>Meio de Eagle Modificado de Dulbeccos (DMEM)</td><td>Corning</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>NorthBio Inc.</td><td>NBSF-701</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato tampolado com solução salina</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td>Prepare uma solução de 1 mM, pH 7.3</td></tr><tr><td>alamarBlue&nbsp;</td><td>AbD Serotec</td><td>BUF012B</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferina sal de potássio</td><td>Biotium</td><td>10101-2</td><td></td></tr><tr><td>96 poços de poliestireno branco sólido de fundo plano TC microplacas tratadas com TC</td><td>As placas Corning</td><td>3917</td><td>de 384 poços também podem ser usadas para maior rendimento</td></tr><tr><td>Synergy Mx</td><td>BioTek</td><td>SMTBL</td><td>Monocromador leitor de microplacas</td></tr><tr><td>Liquidator96</td><td>Mettler Toledo</td><td>LIQ-96-200</td><td>Sistema de pipetagem manual de 96 pontas</td></tr><tr><td>Liquidator96 LTS Pontas esterilizadas com filtros</td><td>Mettler Toledo</td><td>LQR-200F</td><td>Qualquer ponta filtrada estéril compatível com pipetadores de escolha é apropriada</td></tr><tr><td>Microflo</td><td>BioTek</td><td>111-206-21</td><td>Usado para plaquear células em uma placa de 96 poços</td></tr><tr><td>Fluoroskan Ascent FL</td><td>Thermo Scientific</td><td>5210450</td><td>Fluorômetro de microplaca</td></tr></tbody></table>

de alta capacidade de titulação de luciferase expressando recombinantes vírus

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Os ensaios de placa padrão para determinar os títulos de vírus infecciosos podem ser demorados, não são passíveis de um grande volume de amostras e não podem ser feitos com vírus que não formam placas. Como alternativa aos ensaios de placa, desenvolvemos um método de titulação de alto rendimento que permite a titulação simultânea de um grande volume de amostras em um único dia. Essa abordagem envolve a infecção das amostras com um vírus marcado com luciferase Firefly, transferência das amostras infectadas para uma linha celular permissiva apropriada, adição subsequente de luciferina, leitura de placas para obter leituras de luminescência e, finalmente, a conversão de títulos de luminescência em virais. A avaliação da citotoxicidade usando um corante de viabilidade metabólica pode ser facilmente incorporada ao fluxo de trabalho em paralelo e fornecer informações valiosas no contexto de uma triagem de drogas. Essa técnica fornece um método confiável e de alto rendimento para determinar os títulos virais como uma alternativa a um ensaio de placa padrão.

Um resumo do fluxo que descreve o método de alto rendimento é ilustrada na Figura 1. Figura 2 mostra os resultados de uma curva padrão típica ofVSVΔ51-Fluc. Quatro parâmetros de análise de regressão não-linear gerada uma trama monte a partir do qual desconhecido pfu de entrada (estimativa do título viral) podem ser interpolados. Estes títulos são estimados denominado unidades de expressão viral (VEU). Figura 3A mostra Veus e os títulos obtidos através da realização de um ensaio de placas padrão com as mesmas amostras 10. As amostras provenientes de um experimento em que foram utilizados vários produtos químicos para aumentar a replicação e disseminação de VSVΔ51-Fluc em 786-0 células. Veus interpolado a partir da curva padrão tem de ser multiplicado por um factor que é baseado na diluição de sobrenadantes das amostras serem transferidos para células Vero (no presente caso, o factor de diluição é 5). A correlação linear entre os títulos de VEU e é mostrado na Figura 3B </strong&gt; Com um R 2 de 0,8083 e pontuação r de Pearson de 0,899 (p &lt;0,0001). Na Figura 4, os dados típicos de citotoxicidade de células obtidas a partir de um ensaio metabólico é mostrado para 786-0 células tratadas com produtos químicos antes da infecção com VSVΔ51-Fluc. Finalmente, a Figura 5 mostra curvas típicas padrão obtidas com vários vírus (vírus herpes simplex (HSV), vírus vaccinia e vírus adeno-associado (AAV), todos expressando a luciferase do pirilampo) e descreve os tempos de incubação e dos ciclos de congelamento e descongelamento, tal como requerido. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 Fluxo de trabalho de titulação de vírus de alto rendimento e ensaio de citotoxicidade utilizando VSV Δ 51 Fluc. (A) 2,5 x 10 Semente 4 células Vero por poço (100 ul) e incubar a 37 ° C. (B) 24hr depois de transferência 25 ul de curva padrão sobre a células Vero (2 colunas por placa). (C) Transferir 25 uL de amostras para ser titulado em células Vero às restantes. Centrifugar as placas e incuba-se a 37 ° C. (D) numa quantidade igual a 10% do volume da cavidade, adicionar o reagente de resazurina a placa contendo as amostras originais. Incubar as placas a 37 ° C (E). Depois de 3 horas, ler e registar a fluorescência e avaliar a citotoxicidade. (F) Depois de 5 h, adicionar 25 ul de uma solução 2 mg / ml de luciferina para cada poço de células Vero. Leia luminescência e calcular unidades de expressão virais. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. esperado curva padrão de VSV Δ 51-Fluc. Expressão da luciferase era measured 5 hr transferência pós sobrenadante em cinco pontos diferentes dentro de um poço usando uma luminometer e bioluminescência foi expresso em médias unidades relativas de luz (RLU). A média de RLU foi representada graficamente contra a entrada conhecida pfu / ml para resolver a regressão não-linear e gerar uma equação de Hill. A média de duas réplicas de curvas e as barras de erro padrão são apresentados (r2 = 0,9993). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 Comparação de títulos de ensaio de placa padrão com os obtidos pelo método de alto rendimento. (A) Os títulos virais em pfu / ml obtido por ensaio de placas em células Vero padrão foram comparados com os títulos virais calculadas (VEU / ml) a partir das mesmas amostras tituladas utilizando o ensaio de elevado débito da luciferase. (B) a relação linear entre VEU / ml e através de titulação padrão de pensaio laque. Curva de regressão linear e coeficiente de determinação (R 2) são mostrados. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4 Amostra viabilidade. Viabilidade amostra antes da transferência de sobrenadante de células Vero foi determinada avaliando a actividade metabólica celular, utilizando uma solução resazurina disponível comercialmente. Os valores de fluorescência em bruto foram normalizados para a de não tratadas não infectadas, poços. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5 Esperado curvas padrão com HSV, vaccinia e vírus AAV. Expressão da luciferase foi medida em cinco pontos diferentes dentro de um poço, utilizando um luminómetro e bioluminescência foi expressa em rela médiosunidades de luz tiva (RLU). (A) HSV curva padrão foi adicionado em células Vero plaqueadas 24 horas antes a uma densidade de 2,5 x 10 4 culas por po (100 ul) e medição da luciferase foi feita 17 horas pós transferência sobrenadante (R2 = 0,9489, n = 1). Uma equação de Hill foi gerada pela solução da regressão não-linear. (B) Vaccinia curva padrão foi adicionado em células Vero chapeado 24 h antes de uma densidade de 2,5 x 10 4 culas por po (100 ul) e incubou-se durante 2,5 horas a 37 ° C, após o que foram tomadas medidas de luciferase (R2 = 0,9892). Uma equação linear foi gerado por resolver para a regressão linear. (C) de AAV curva padrão foi adicionado em células de carcinoma de pulmão humano (A549) chapeado 24 horas antes a uma densidade de 2,5 x 10 4 culas por po (100 ul) e medição da luciferase foi feito 24 horas após a infecção. Uma equação de Hill foi gerada pela solução da regressão não-linear. A médiade cinco curvas em duplicado eo barras de erro padrão são mostrados (R 2 = 0,9926).

Este artigo apresenta um método baseado na expressão de luciferase de alto rendimento para titular vários vírus de RNA e DNA usando manipuladores de líquidos automatizados e manuais.

De alta capacidade de Titulação de luciferase expressando recombinantes Vírus

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

O objetivo geral do experimento a seguir é estimar os títulos virais de um vírus marcado com luciferase utilizando um método de quantificação de alto rendimento. Isso é realizado transferindo o sobrenadante das amostras a serem tituladas, bem como uma curva padrão viral, para uma linhagem celular permissiva, permitindo assim a expressão da luciferase. Como segundo passo, pode-se adicionar resazurina às amostras originais, que será utilizada para avaliar a viabilidade celular.Em seguida, após um tempo apropriado de incubação, a luciferina é adicionada às células para quantificar a bioluminescência. Os resultados mostram a quantidade de vírus na amostra com base na expressão da luciferase.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a titulação por placas, é que um grande número de amostras pode ser processado rapidamente e simultaneamente. Este método também pode ser estendido a vírus que expressam luciferase não formadores de placas, já que não depende da formação de placas. Uma leitura da citotoxicidade celular pode ser facilmente incorporada ao fluxo de trabalho e pode ser útil no contexto de uma triagem de fármacos. A demonstração do procedimento será feita por Vanessa, Ramya e Colin, três estudantes de pós-graduação do meu laboratório. Primeiro, realize infecções utilizando o VSV-Delta 51 que expressa Firefly Luciferase em placas de cultura de tecidos de 96 poços. Os sobrenadantes dessas placas serão titulados após um tempo apropriado de incubação. 24 horas antes da titulação, prepare uma suspensão de células Vero numa concentração de 2,5 vezes 10 à quinta células por mililitro em DMEM contendo 10% de FBS, 30 milimolar de HEPES e 1% de penicilina-estreptomicina. Semeie 2,5 vezes 10 à quarta células em placas brancas de fundo plano e sólido de 96 poços, utilizando um dispensador de microplacas. Para preparar a suspensão celular, limpe uma cassete do dispensador de microplacas lavando a tubulação com 50 mililitros de água estéril.Em seguida, preencha as linhas do dispensador de microplacas com a suspensão celular, permitindo que cinco mililitros da suspensão celular passem por elas. Selecione um programa que irá dispensar 100 microlitros em cada poço de uma placa de 96 poços com paredes brancas. Realize a dispensação e repita conforme necessário para placas adicionais. Além disso, semeie alguns poços em uma placa de 96 poços com fundo branco transparente para verificação da saúde e densidade celular.Quando terminar, recolha as células de volta para o recipiente original. Limpe a cassete passando 50 mililitros de etanol a 70%, seguidos por 50 mililitros de água estéril morna, através da tubulação. Em seguida, incube as células por 24 horas a 37 °C em uma estufa umidificada com 5% de dióxido de carbono.Prepare uma curva padrão de VSV-Delta-51 em DMEM sem soro de forma que a concentração final de unidades formadoras de placa por mililitro após a transferência para células Vero seja a seguinte. Prepare 50 microlitros de cada concentração por placa de células Vero, mais 10% extras. A curva padrão pode ser transferida para uma placa de 96 poços profundos. Em seguida, verifique as células Vero semeadas na placa de 96 poços com fundo transparente sob microscópio óptico para confirmar que as monocamadas estão com pelo menos 95% de confluência. Transfira 25 microlitros do sobrenadante da amostra para as células Vero semeadas nas placas com paredes brancas, utilizando um pipetador multicanal de 12 canais, aplicando 25 microlitros de cada diluição da curva padrão nas células Vero nas duas colunas designadas. Centrifugue as placas por cinco minutos a 430 g em temperatura ambiente. Em seguida, incube as placas por cinco horas a 37 graus Celsius em um incubador umidificado com 5% de dióxido de carbono.Neste ponto, adicione resazurina em uma quantidade equivalente a 10% do volume em cada poço da placa de 96 poços contendo amostras com vírus e células. Após duas a quatro horas, leia e registre o sinal com um leitor de placas de fluorescência utilizando 530 a 560 para excitação e 590 para emissão. Relate a viabilidade celular para a amostra de acordo com a seguinte fórmula.Trinta minutos antes do final da incubação de cinco horas, prepare a luciferina para obter uma solução de dois miligramas por mililitro em solução salina tamponada com fosfato estéril. Proteja a solução da luz. Após o período de incubação de cinco horas, adicione 25 microlitros de luciferina a cada poço de células Vero nas placas brancas sólidas com um dispensador automatizado integrado ao luminômetro. Leia as placas com os seguintes parâmetros.Agite por cinco segundos e espere 30 segundos. Leia a luminiscência em um valor apropriado e fixo de sensibilidade ou exposição, então registre e salve a intensidade bioluminescente quantificada. Se um dispensador automatizado foi usado para adicionar luciferina, remova a luciferina e prepare as linhas com água estéril. Para resultados precisos, resolva a regressão não linear para gerar uma equação de Hill a partir das curvas padrão.Aplicar esta equação às amostras tituladas para calcular as unidades de expressão viral. Os resultados de uma curva padrão típica do VSV-Delta 51 são mostrados aqui. Uma análise de regressão não linear de quatro parâmetros gerou um gráfico de Hill a partir do qual unidades formadoras de placas de entrada desconhecidas podem ser interpoladas. Os títulos virais obtidos por ensaio padrão de placa em células Vero foram comparados com os títulos virais calculados das mesmas amostras tituladas utilizando o ensaio de luciferase de alto rendimento. As amostras originaram-se de um experimento no qual diversos produtos químicos foram usados para potencializar a replicação e disseminação do VSV-Delta-51 em células 786-0. A correlação linear entre títulos e unidades de expressão viral, com um R quadrado de 0,8083 e um coeficiente R de Pearson de 0,899, é apresentada aqui. Dados típicos de citotoxicidade celular obtidos a partir de um ensaio metabólico são mostrados aqui para células 786-0 tratadas com produtos químicos antes da infecção com o VSV-Delta-51. Curvas padrão típicas obtidas com o vírus do herpes simples, o vírus vaccínia e o vírus adeno-associado, todos expressando luciferase de vaga-lume, são exibidas aqui. Uma vez dominada, esta técnica pode ser utilizada para realizar telas de alto rendimento de bibliotecas de compostos em combinação com o seu vírus de interesse, a fim de gerar dados de título e citotoxicidade. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de diluir corretamente a curva padrão, pois isso é essencial para a interpolação de unidades de expressão viral.Não se esqueça de que trabalhar com vírus vivos pode ser extremamente perigoso, e precauções como atuar em uma cabine de segurança biológica e usar os equipamentos de proteção individual apropriados devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estimar concentrações virais utilizando um método de quantificação de alto rendimento baseado na expressão de um transgene luciferase e na medição da bioluminescência para interpolação de unidades virais desconhecidas a partir de uma curva padrão. A citotoxicidade da amostra pode ser simultaneamente determinada por um ensaio de viabilidade apropriado.

high-throughput-titration-of-luciferase-expressing-recombinant-viruses

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Para fazer lentivírus, vetores de DNA são transfectadas em células humanas 293. Após a colheita e concentrando-se o sobrenadante, título de vírus é determinado pela expressão de fluorescência com um citômetro de fluxo.

Produção lentivírus

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates a luciferase-based pseudovirus titration assay to determine the optimal target cell density for maximum infection. By comparing luminescence across cell densities, the method ensures high assay sensitivity and reproducibility for downstream applications.

Determining Optimal Target Cell Density Using a Luciferase-Based Pseudovirus Infection Assay

Fonte: Lucas-Hourani, M. et.al., Triagem em Alta Escala para Inibidores Químicos de Amplo Espectro de Vírus de RNA. J. Vis. Exp. (2014)Este vídeo mostra um ensaio antiviral baseado em luciferase em células de rim embrionário humano infectadas com vírus da sarampo recombinante. Ele demonstra que compostos-teste diluídos em série inibem a replicação viral, resultando em menor luminiscência de maneira dependente da dose, ao mesmo tempo que mantêm a viabilidade das células hospedeiras.

Ensaio Baseado em Luciferase para Avaliar Compostos Antivirais em Células de Rim Embrionário Humano

Fonte: Garcia, V., et al. Titulação em Alta Vazão de Vírus Recombinantes que Expressam Luciferase. J. Vis. Exp. (91), e51890, doi:10.3791/51890 (2014).Este vídeo demonstra a preparação de amostras de cultura celular para avaliar a carga viral utilizando um ensaio baseado em luciferase. Ele descreve o processo de infecção de células epiteliais com um vírus geneticamente modificado, transferência de sobrenadantes virais e padrões para poços do ensaio, e promoção da entrada viral por meio de...

Preparação de Amostras para Quantificação Viral Baseada em Luciferase

O vídeo demonstra o ensaio de luciferase usado para quantificar proteínas marcadas com luciferase. O ensaio usa uma enzima luciferase projetada composta por um grande fragmento que se liga ao pequeno fragmento, que é conjugado com uma proteína de interesse. As subunidades ligadas formam uma enzima ativa que, na presença do substrato, libera um sinal luminescente. Este sinal é então quantificado usando um luminômetro.

O ensaio de luciferase: um ensaio de alto rendimento para medir sinais luminescentes usando biorepórteres baseados em sistema de nanoluciferase projetados

Este vídeo demonstra uma técnica in vitro para detectar a infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) por meio de um sistema repórter de HBV recombinante. Ao infectar as células hospedeiras, o genoma viral recombinante expressa a enzima repórter da luciferase, que produz bioluminescência ao oxidar seu substrato - ajudando a detectar a infecção viral.

Um sistema repórter de vírus recombinante in vitro para a detecção de infecção viral

Apresentamos um método de triagem rápida e de baixo custo para a identificação de reguladores de transcrição usando de alto rendimento transfections robóticos e um ensaio de luciferase dual-brilho caseiro. Este protocolo gera rapidamente dados funcionais diretos side-by-side para milhares de genes e é facilmente modificável para atingir qualquer gene de interesse.

De alta capacidade de Triagem funcional usando um caseiro Dual-brilho ensaio de luciferase

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar pseudotyped partículas em um cenário de BSL-2 incorporando a proteína de aumento da síndrome respiratória do vírus de alta patogenicidade Oriente e coronavírus síndrome respiratória aguda grave. Estas partículas pseudotyped contêm um gene do repórter do luciferase permitindo a quantificação de entrada de vírus em células de host de destino.

Produção de partículas Pseudotyped para estudar a alta patogenicidade coronavírus em uma configuração de nível 2 de biossegurança

Nós apresentamos um protocolo para estudar o Regulamento da tradução de mRNA em pilhas poxvirus-contaminadas usando in vitro o ensaio do repórter da luciferase do RNA-baseado transcrito. O ensaio pode ser usado para estudar a regulação da tradução por cis-elementos de um mRNA, incluindo 5 '-região não traduzida (UTR) e 3 '-UTR. Diferentes modos de iniciação de tradução também podem ser examinados usando este método.

Ensaio de repórter luciferase à base de RNA transcrito in vitro para estudar a regulação da tradução em células infectadas pelo poxvirus

Os vírus da influenza A (IAVs) são patógenos respiratórios contagiosos que causam epidemias anuais e pandemias ocasionais. Aqui, nós descrevemos um protocolo para rastrear infecções virais in vivo usando uma novela recombinante luciferase e fluorescência-expressando o bi-repórter IAV (BIRFLU). Esta abordagem fornece aos pesquisadores uma excelente ferramenta para estudar IAV in vivo.

Um luciferase-vírus da gripe do repórter fluorescente para A imagem latente viva e a quantificação da infecção viral

Para identificar novos reguladores de fatores de transcrição, desenvolvemos uma abordagem para tela de bibliotecas RNAi lentivirais ou retrovirais usando um ensaio de repórter transcricional baseado em dupla luciferase. Esta abordagem oferece uma maneira rápida e relativamente barata de selecionar centenas de candidatos em um único experimento.

Identificação de reguladores de fatores de transcrição usando triagem de média-duração de bibliotecas arrayed e um repórter baseado em dupla-luciferase

Aprenda a titular vírus expressando luciferase em alta capacidade usando linhagens celulares permissivas e leitura de luminescência. Este método permite processar múltiplas amostras rapidamente enquanto avalia a viabilidade celular simultaneamente.

De alta capacidade de Titulação de luciferase expressando recombinantes Vírus

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