De alta capacidade de Titulação de luciferase expressando recombinantes Vírus

O objetivo geral do experimento a seguir é estimar os títulos virais de um vírus marcado com luciferase usando um método de quantificação de alto rendimento. Isso é conseguido transferindo o sobrenadante das amostras a serem tituladas, bem como uma curva padrão viral para uma linha celular permissiva para permitir a expressão da luciferase. Como segundo passo, a zurina RESA pode ser adicionada às amostras originais, que serão usadas para avaliar a viabilidade celular.

Em seguida, após um tempo de incubação apropriado, o luciferiano é adicionado às células para quantificar por luminescência. Os resultados mostram a quantidade de vírus na amostra com base na expressão da luciferase. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como titulação de placas, é que um grande número de amostras pode ser processado de forma rápida e simultânea.

Este método também pode ser estendido para vírus que não expressam luciferase. Como não depende da formação de placas, uma leitura da citotoxicidade celular pode ser facilmente incorporada ao fluxo de trabalho e pode ser útil no contexto de uma triagem de drogas. Demonstrando o procedimento estarão Vanessa Ramia e Colin, três alunos de pós-graduação do meu laboratório: Primeiro realizar infecções usando VSP Delta 51 expressando Firefly Luciferase em 96.

Bem, os sobrenadantes das placas de cultura de tecidos dessas placas serão titulados após um tempo de incubação apropriado 24 horas antes do título. Prepare uma suspensão de células Vero a uma concentração de 2,5 vezes 10 elevado a quinta células por mililitro em DMEM contendo 10% de FBS 30 pilhas milimolares e 1% de penicilina estreptomicina C, 2,5 vezes 10 elevado a quarta célula em 96. Placas de fundo plano bem brancas e sólidas usando um dispensador de microplacas para preparar a suspensão da célula, limpe um dispensador de microplacas lavando a tubulação com 50 mililitros de água estéril.

Em seguida, encha as linhas de dispensadores de microplacas com suspensão de células, permitindo que cinco mililitros da suspensão de células fluam. Selecione um programa que dispensará 100 microlitros em cada poço de uma dispensação de placa de 96 poços de parede branca e repita conforme necessário para placas adicionais. Semeie também alguns poços em uma placa inferior branca transparente de 96 poços para verificação da saúde e densidade celular.

Quando terminar, lave as células de volta no recipiente original. Limpe o passando 50 mililitros de etanol a 70%, seguidos por 50 mililitros de água quente estéril através da tubulação. Em seguida, incube as células por 24 horas a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada de 5% de dióxido de carbono.

Preparar uma curva padrão de VSV Delta 51 no DMEM livre sérico de modo a que a concentração final de unidades de plataforma por mililitro após a transferência para as células Vero seja a seguinte. Prepare 50 microlitros de cada concentração por placa de células Vero, mais 10% extrasA curva padrão pode ser transferida para uma placa de 96 poços profundos. Em seguida, verifique as células Vero semeadas na placa de fundo transparente de 96 poços sob um microscópio óptico para confirmar se as monocamadas são pelo menos 95% de transferência trans confluente.

25 microlitros de sobrenadante de amostra nas células Vero assentadas nas placas de paredes brancas usando uma pipetadora multicanal de 12 canais a 25 microlitros de cada diluição da curva padrão para as células Vero nas duas colunas designadas. Centrifugue as placas durante cinco minutos a 430 Gs à temperatura ambiente. Em seguida, incube as placas por cinco horas a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada de 5% de dióxido de carbono.

Neste ponto, adicione zurina em uma quantidade igual a 10% do volume em cada poço da placa de 96 poços de amostras contendo vírus e células. Após duas a quatro horas, leia e registre o sinal com um leitor de placa de fluorescência usando 530 a 560 para excitação e 590 para relatório de emissão. Viabilidade celular para a amostra de acordo com a seguinte fórmula.

30 minutos antes do final da incubação de cinco horas, prepare o Lúcifer para obter uma solução de dois miligramas por mililitro em solução salina tamponada com fosfato estéril. Proteja a solução da luz após o período de incubação de cinco horas a 25 microlitros de Lúcifer para cada poço de células Vero nas placas sólidas brancas com um dispensador automatizado integrado no luminômetro. Leia as placas com os seguintes parâmetros.

Agite por cinco segundos e aguarde 30 segundos. Ler luminescência a um valor de exposição de corte de sensibilidade fixa adequado, registar e guardar a intensidade bioluminescente quantificada. Se um dispensador automatizado foi usado para adicionar luciferiano, empoleirar o luciferiano e preparar as linhas com água estéril ou resultados precisos, resolva a regressão não linear para gerar uma equação de colina a partir das curvas padrão.

Aplique esta equação às amostras tituladas para calcular as unidades de expressão viral. Os resultados de uma curva padrão típica do VSV Delta 51 são mostrados aqui, ou a análise de regressão não linear de parâmetro gerou um gráfico de granizo a partir do qual unidades formadoras de entrada desconhecidas podem ser interpoladas. Os títulos virais obtidos pelo ensaio de placa padrão em células Vero foram comparados com os títulos virais calculados das mesmas amostras.

Titulado usando as amostras de ensaio de luciferase de alto rendimento originadas de um experimento em que vários produtos químicos foram usados para aumentar a replicação e disseminação de células VSV Delta 51 e 7 8 6 0. A correlação linear entre títulos e unidades de expressão viral com um R ao quadrado de 0,8083 e pontuação R de Pearson de 0,899 é mostrada aqui. Os dados típicos de citotoxicidade celular obtidos de um ensaio metabólico são mostrados aqui para 7, 8 6 0 células tratadas com produtos químicos antes da infecção.

Com o VSV Delta 51, curvas padrão típicas obtidas com o vírus herpes simplex, vírus vaccinia e vírus adeno-associado, todos expressando luciferase de vaga-lume, são exibidos aqui. Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para realizar triagens de alto rendimento de bibliotecas de compostos em combinação com o vírus de seu interesse para gerar títulos e dados de citotoxicidade. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de diluir adequadamente a curva padrão, pois isso é crítico para interpolar unidades de expressão viral.

Não se esqueça de que trabalhar com vírus vivos pode ser extremamente perigoso e precauções como trabalhar em um gabinete de segurança biológica e usar o equipamento de proteção individual adequado devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estimar títulos virais usando um método de quantificação de alto rendimento baseado na expressão de uma medição de transgene de luciferase de bioluminescência na interpolação de unidades de expressão viral desconhecidas. A partir de uma amostra de curva padrão, a citotoxicidade pode ser determinada simultaneamente por um ensaio de viabilidade apropriado.