Expressão de proteínas recombinantes de Biologia Estrutural em HEK 293F Suspensão Cells: Uma abordagem inovadora e acessível

O objetivo geral do vídeo a seguir é demonstrar uma técnica simples e acessível para produzir um bom rendimento de proteínas ou complexos de proteínas usando um sistema de expressão de mamíferos. Isso é conseguido cultivando células HEC 2 93 F em suspensão em uma incubadora agitada umidificada com uma atmosfera mantida a 5% de dióxido de carbono. Como segunda etapa, as células são transfectadas transitoriamente com um ou mais plasmídeos de expressão de alto número de cópias.

Usando o agente de transfecção polietileno EIN ou PEI, as células foram deixadas crescer por 48 horas antes da colheita. Em seguida, a purificação da proteína é realizada usando resina de afinidade, seguida de filtração em gel para purificar o complexo proteico de interesse, a fim de realizar estudos estruturais e funcionais. Em última análise, este sistema de expressão de mamíferos acessível e simples permite a expressão e purificação de proteínas e complexos proteicos que são difíceis de expressar em células bacterianas.

A principal vantagem desta abordagem é sua conveniência e versatilidade para a expressão de complexos proteicos. É quase tão fácil quanto fazer proteínas em bactérias, especialmente porque você pode misturar e combinar vetores de expressão de proteínas. O método pode ser usado inicialmente em pequena escala para testar a expressão de compressas de proteína, mas é facilmente escalável para produzir um bom rendimento de compressas de proteína Para estudos estruturais e funcionais, a chave para o sucesso é manter as células em um estado saudável, livre de bactérias ou infecções fúngicas.

Como os antibióticos na mídia reduzem muito o rendimento da proteína. Para começar, remova um frasco criogênico contendo um mililitro de células HEC 2 9 3 F a uma densidade de 20 milhões de células por mililitro do nitrogênio líquido e descongele rapidamente em um banho-maria a 37 graus Celsius. Quebrar os grumos pipetando algumas vezes para cima e para baixo e pipetar todo o conteúdo para um balão cónico de cultura de células de 250 mililitros contendo 34 mililitros de meios pré-aquecidos.

Coloque a cultura em uma incubadora de agitação orbital umidificada a 37 graus Celsius, 120 RPM e 5% de dióxido de carbono após 48 horas. Verifique a viabilidade celular por trian blue. A viabilidade celular normal de coloração nesta fase é de aproximadamente 70%quando as células atingirem uma contagem de aproximadamente 1 milhão de células por mililitro.

Massageie-os até uma contagem final de 0,35 milhão de células por mililitro em um frasco de cultura de células cônicas de 250 mililitros contendo 60 mililitros de meio pré-aquecido, continue a massagear as células a cada 48 horas ou quando atingirem a conta de aproximadamente 2 milhões de células por mililitro. Aqui é mostrada uma amostra de células HEC 2 9 3 F da coloração azul de Trian a 2,3 milhões de células por mililitro de um estoque pronto para ser semeado para transfecção de células que devem estar presentes apenas como células únicas ou em divisão. Se as células crescerem demais, elas formarão grandes aglomerados e terão uma viabilidade muito baixa, como mostrado nesta imagem.

Se as células estão formando aglomerados, eles podem ser quebrados por vórtices vigorosos por 25 segundos. Para começar as culturas em grande escala, semeiam as células em meio milhão de células por mililitro em um volume final de 300 mililitros em cada garrafa de rolo de um litro. Incubar por 24 horas em um agitador orbital umidificado a 37 graus Celsius, 135 RPM e 5% de dióxido de carbono até que as células atinjam uma densidade de 1 milhão de células por mililitro.

Em seguida, pipeta um total de 300 microgramas de DNA esterilizado por filtro em 30 mililitros de solução salina tamponada com fosfato ou PBS e vórtice vigorosamente por três segundos. Em seguida, adicione 1,2 mililitros de 0,5 miligramas por mililitro. Filtre a PEI esterilizada para a solução PB SDNA e vortex vigorosamente por mais três segundos.

Incube a mistura em temperatura ambiente por 20 minutos antes de adicionar a mistura às células após o berço. A transfecção incuba as células em uma incubadora de agitação orbital umidificada por mais 48 horas a 37 graus Celsius, 135 RPM e 5% de dióxido de carbono após 48 horas. Colha proteínas intracelulares centrifugando células a 3000 vezes G por cinco minutos.

Se o pellet celular não for para uso imediato, ele pode ser armazenado a 80 graus Celsius negativos. Este protocolo é otimizado para a purificação de complexos proteicos do núcleo em que uma das proteínas possui uma etiqueta bandeira. Para iniciar a purificação resus, suspenda a paleta de células em aproximadamente 40 mililitros de lise pré-resfriada, tampão por litro de cultura, usando uma combinação de pipetagem para cima e para baixo várias vezes e um sonicado homogeneizador de vidro por três ciclos de 15 segundos em 15 segundos desligados.

Em seguida, centrifugue seu G 108.000 vezes por 25 minutos a quatro graus Celsius e retenha o nadante supino. Em seguida, equilibre 1,2 mililitros de resina aros embalada Anti-Flag por litro de cultura, lavando três vezes com tampão de equilíbrio de resina, incube o supinato, que representa o extrato celular inteiro com a resina de afinidade em um ou mais tubos de centrífuga de 50 mililitros, girando suavemente por 30 a 120 minutos de quatro graus Celsius após a centrífuga de incubação a 3000 vezes G por um minuto a quatro graus Celsius. Depois de descartar o supinato, transfira a resina para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e lave com um total de 45 mililitros de tampão pré-resfriado, centrifuga-se antes e depois descarte o supinato e repita a lavagem e centrifugação usando tampão com alto teor de sal, seguido de tampão com baixo teor de sal e tampão de clivagem TEV.

Certifique-se de que cada lavagem seja suficiente para ressuspender totalmente a resina, mas não mais. Em seguida, colete uma amostra de 10 microlitros de resina e dilua em um volume de duas vezes o tampão de carga de proteína para análise para representar a amostra de proteína ligada. Não use agentes redutores, pois eles liberarão o anticorpo da resina.

Em seguida, ressuspenda a resina em 10 mililitros de tampão de clivagem TEV pré-resfriado a aproximadamente 40 microgramas de protease TEV por litro de cultura original e misturado invertendo o tubo várias vezes. Os níveis de protease TEV podem ser otimizados de acordo com a quantidade de proteína expressa. Substitua a atmosfera do tubo por gás nitrogênio 100% para evitar a oxidação da proteína antes de girar suavemente durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte.

Centrifugue a amostra a 3000 vezes G durante 10 minutos, depois transfira o supinato para um filtro ultracentrífugo com um limite de peso molecular adequado e concentre até 500 microlitros. Colete uma amostra de 10 microlitros da proteína concentrada e dilua em um volume de duas vezes o tampão de carga de proteína para análise. Esta amostra representa a amostra de eluato TEV.

Em seguida, colete uma amostra de 10 microlitros da resina e dilua em um volume de duas vezes o tampão de carga de proteína. Esta amostra representa a amostra de resina pós-TEV. O próximo passo é passar a proteína por uma coluna de exclusão de tamanho e a matriz de filtração de gel apropriada deve ser usada de acordo com o tamanho do complexo de interesse.

Neste caso, usamos uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho S 200 de 10 por 300 milímetros A para igualar a coluna de cromatografia de exclusão de tamanho com tampão de filtração em gel. Filtre a proteína através de um filtro de 0,22 mícron e carregue a amostra na coluna. Prossiga para coletar as frações à medida que saem da coluna.

Como etapa final, execute a eletroférese em gel de poliacrilamida SDS ou a página SDS nas amostras coletadas, bem como as frações de filtração do gel, histona DS SLA um ou HD um supressor de silenciamento defeituoso três ou SDS três e syn três, um domínio de interação HDAC ou syn três, A HID forma um complexo turny estável. A purificação de afinidade do complexo turny pode ser observada através da página SDS. Aqui é mostrado o complexo purificado produzido pelo cot, seccionando dois litros de células.

A faixa de proteína ligada mostra o complexo ligado à resina de afinidade. Após a digestão do TEV, a etiqueta presente no pecado três A HID é clivada e o complexo é aludido. A resina aqui apresentada é um cromatograma do complexo proteico purificado com uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho S 200 de 10 por 300 milímetros.

Observe que o complexo puro escapa perto do volume vazio porque forma um dímero em solução. Finalmente, a análise da página SDS revela a proteína purificada nas frações de filtração do gel. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar, manter e cultivar HEC duas e três células de aplicativo, bem como como afinidade, purificar e concentrar sua proteína.

Células saudáveis complexas serão essenciais para o sucesso dos experimentos, portanto, certifique-se de que elas sejam cultivadas e mantidas em suas condições e passagem regularmente. Não se deixe levar pela cultura de tecidos. É fácil para os biólogos estruturais expressar e purificar grandes quantidades de proteínas e complexos proteicos de células de mamíferos.