Name: Expressão de proteínas recombinantes de Biologia Estrutural em HEK 293F Suspensão Cells: Uma abordagem inovadora e acessível (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Aprenda a expressar proteínas recombinantes em células HEK 293F em suspensão para estudos de biologia estrutural. Este método acessível permite obter altos rendimentos de complexos proteicos difíceis de produzir em bactérias.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Xiaowen Yang (serviço de clonagem PROTEX) para preparar as construções de expressão utilizadas para este trabalho e da Universidade de Leicester Núcleo de Biotecnologia Services. Este trabalho foi financiado por uma bolsa de estudo BBSRC, o Programa Wellcome Trust e subsídios pesquisador sênior WT085408 &amp; WT100237 e BBSRC conceder RM31G0224.

NOTA: O protocolo é adequado para qualquer escala de expressão, por conseguinte, os volumes e as quantidades dos reagentes deve ser dimensionado proporcionalmente. Um vector de expressão adequado de mamífero podem ser utilizados para este protocolo. Aqui utilizou-se uma modificação de pcDNA 3,1 vector de expressão que permite convenientemente a inclusão ou exclusão de um marcador de afinidade de acordo com a escolha das enzimas de restrição utilizados na clonagem (Figura 1). O protocolo seguinte descreve um transfecção grande escala. 1 Large Scale Cultura / transfecção em 1 L frascos cilíndricos Crescer e manter as células adaptaram-HEK293F suspensão de acordo com protocolos padrão. Tipicamente, as culturas de arranque, entre 30 e 100 ml são cultivadas em balões de 250 ml de cultura de células cónicas. <ol><li> Células de sementeira em 0.5 x 10 6 células / ml para um volume final de 300 ml em cada frasco rolante 1 L. NOTA: frascos rolantes acomodar um mínimo de 150 ml até um máximo de300 ml de cultura em suspensão. Para transfections maior escala usar várias garrafas. </li><li> Incubar durante 24 horas num incubador agitador orbital a 37 ° C, 120 rpm, e 5% de CO2, até atingir uma densidade de células de 1,0 x 10 6 células / ml (células devem dividir aproximadamente a cada 24 h). </li><li> Pipetar um total de 300 ug de ADN, esterilizada por filtração (ver método suplementar) em 30 ml de PBS e vortex vigorosamente durante 3 seg. NOTA: É um total de 1 ug de DNA por milh de culas transfectadas. Se dois ou mais plasmídeos são para ser co-transfectadas reduzir a quantidade de cada um de modo a que a proporção de ADN para células permanece constante. </li><li> Adicionar 1,2 ml de 0,5 mg / ml filtrar esterilizado PEI para a solução de PBS / ADN e vortex vigorosamente durante 3 seg. </li><li> Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Adicionar o ADN / PEI misturar com as células - que devem estar a uma densidade de 1 x 10 6 células / ml (passo 1.3). </li><li> Após a co-transfecção, as células incubarnum incubador agitador orbital durante mais 48 horas a 37 ° C, 120 rpm, e 5% de CO 2. </li><li> Proteínas intracelulares da colheita por centrifugação as células a 3000 xg durante 5 min e armazenar o sedimento a -80 ° C. NOTA: Como alternativa, usar um padrão (não-CO 2) agitação da incubadora, quando a atmosfera acima da cultura é substituído com 5% de CO 2 e a tampa do frasco é selado. A atmosfera terá de ser substituída, em cada passagem (normalmente a cada 2 dias). </li></ol> 2.-Protein complexo purificação do extrato de células inteiras Este protocolo é otimizado para a purificação de complexos nucleares que utilizam proteínas marcadas no pavilhão. <ol><li> Descongelar sedimento celular em ~ 40 ml de tampão de lise de pré-gelada (100 mM de acetato de potássio, 50 mM Tris pH 7,5, 5% de glicerol, 0,3% Triton X-100, os inibidores de protease) por l de cultura. </li><li> Re-suspender o pellet pipetando para cima e para baixo várias vezes (para evitar a formação de espuma, não vórtice). </lEu&gt; <li> Exaustivamente re-suspender as células utilizando um homogeneizador de vidro. Sonicar por 3 ciclos (15 seg, 15 seg em off). Centrifugar a 30.000 xg por 25 min a 4 ° C e manter sobrenadante. </li><li> Equilibrar 1,25 ml de anti-bandeira embalado resina de agarose por litro de cultura por lavagem três vezes com tampão de equilibração de resina (de acetato de potássio 100 mM, Tris 50 mM, pH 7,5). </li><li> Incubar o extracto de células inteiras a partir do passo 2.3 com a resina de afinidade, em um ou mais tubos de centrífuga de 50 ml e cuidadosamente girar a amostra durante 30-120 min a 4 ° C. </li><li> Centrifugar a 3.000 xg durante 1 min a 4 ° C, o sobrenadante de descarte. </li><li> Lava-se a resina com 45 ml de tampão de pré-refrigerada 1 (100 mM de acetato de potássio, 50 mM Tris pH 7,5, 5% de glicerol, 0,3% Triton X-100). Centrifugar a 3000 xg por 1 min e elimine o sobrenadante. </li><li> Repetir o passo 2.7, utilizando tampão de alto teor salino (300 mM de acetato de potássio, 50 mM Tris pH 7,5, glicerol a 5%), seguido de tampão de baixa salinidade (50 mM de acetato de potássio, 50 mM Tris pH 70,5, glicerol a 5%) e Tampão de Clivagem TEV (50 mM de acetato de potássio, 50 mM Tris pH 7,5, TCEP 0,5 mM). NOTA: Certifique-se de cada lavagem é breve ou seja, suficiente para totalmente re-suspender a resina, e não mais. </li><li> Coletar uma amostra de 10 mL de resina e diluir em um volume de tampão de carga de proteína 2x para análise (controle de proteínas). Não utilizar agentes redutores, para evitar a libertação de anticorpo a partir da resina. </li><li> Re-suspender a resina em 8-10 ml de tampão de clivagem de TEV pré-refrigerado e transferência para um tubo de centrífuga de 15 ml. </li><li> Adicionar ~ 40 ug de protease TEV (a partir de estoque de 1 mg / ml) por l de cultura original e misturar bem por pipetagem para cima e para baixo várias vezes. </li><li> Substituir tubo atmosfera com 100% de gás N2 para evitar a oxidação da proteína. </li><li> Delicadamente gire O / N a 4oC. </li><li> Centrifugar a 3000 xg durante 10 min. Transferir o sobrenadante para um filtro de ultra-centrifugação com um peso molecular de corte adequado e concentraraté 500 ul. </li><li> Recolher uma amostra de 10 ul da proteína concentrada e diluída em 1 volume de tampão de carga de proteína 2x para análise. (TEV controle eluato). </li><li> Recolher uma amostra de 10 ul da resina e dilua em 1 volume de tampão de carga de proteína 2x para análise. Não utilizar agentes de redução, a fim de evitar a libertação de grandes quantidades de anticorpos a partir da resina. (Controle de resina pós-TEV). </li><li> Equilibrar a coluna de cromatografia de exclusão de tamanho com tampão de filtração em gel (acetato de potássio 50 mM, 50 mM Tris pH 7,5, TCEP 0,5 mM). </li><li> Filtra-se a proteína através de um filtro de 0,22 um </li><li> Coloque a amostra na coluna e recolher as frações. </li><li> Amostras executado a partir de passos 2.9, 2.15 e 2.16 e as fracções de filtração gel de passo 2,19 em um SDS-PAGE e Coomassie mancha para análise. NOTA: É aconselhável correr um gel de SDS-PAGE de amostras de passos de 2,9, 2,15 e 2,16 antes da filtração em gel para confirmar a expressão da proteína alvo.</li>
</ol>

<ol><li>Baneyx, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Escherichia coli.</a> Current opinion in biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).</li>
<li>Aricescu, A. R., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+recombinant+glycoproteins+in+mammalian+cells%3A+towards+an+integrative+approach+to+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology.</a> Current opinion in structural biology. 23 (3), 345-356 (2013).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+bioanalytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Boussif, O., Zanta, M. A., Behr, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+galenics+improve+in+vitro+gene+transfer+with+cationic+molecules+up+to+1000-fold%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Optimized galenics improve in vitro gene transfer with cationic molecules up to 1000-fold.</a> Gene therapy. 3 (12), 1074-1080 (1996).</li>
<li>Godbey, W. T., Wu, K. K., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly+%28ethylenimine%29+and+its+role+in+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Poly (ethylenimine) and its role in gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 60 ((2-3)), 149-160 (1999).</li>
<li>Beljelarskaya, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+expression+systems+for+production+of+recombinant+proteins+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Baculovirus expression systems for production of recombinant proteins in insect and mammalian cells.</a> Molecular Biology. 45 (1), 123-138 (2011).</li>
<li>Cregg, J. M., Vedvick, T. S., Raschke, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+expression+of+foreign+genes+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris.</a> Nature Biotechnology. 11 (8), 905-910 (1993).</li>
<li>Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+HDAC3+bound+to+co-repressor+and+inositol+tetraphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate.</a> Nature. 481 (7381), 335-340 (2013).</li>
<li>Millard, C. J., Watson, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+I+HDACs+Share+a+Common+Mechanism+of+Regulation+by+Inositol+Phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Class I HDACs Share a Common Mechanism of Regulation by Inositol Phosphates.</a> Molecular Cell. 51 (1), 57-67 (2013).</li>
<li>Tom, R., Bisson, L., Durocher, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+HEK293-EBNA1+Cells+in+Suspension+with+Linear+PEI+for+Production+of+Recombinant+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Transfection of HEK293-EBNA1 Cells in Suspension with Linear PEI for Production of Recombinant Proteins.</a> CSH protocols. , pdb.prot4977(2008).</li>
<li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic Acids Research. 30 (2), (2002).</li>
<li>Baldi, L., Muller, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+Gene+Expression+in+Suspension+HEK%E2%80%90293+Cells%3A+Application+to+Large%E2%80%90Scale+Protein+Production%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Transient Gene Expression in Suspension HEK‐293 Cells: Application to Large‐Scale Protein Production.</a> Biotechnology Progress. 21 (1), 148-153 (2005).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Desenvolvemos um método eficaz e simples de custo (PEI custa muito menos do que os reagentes de transfecção disponíveis comercialmente lipófilos) para a expressão e purificação de grandes quantidades de proteínas recombinantes e os complexos de múltiplas subunidades a partir de células de mamíferos. Transfecção óptima e a eficiência de expressão pode ser alcançada se o DNA de plasmídeo muito puro (260/280 entre 1,8 e 2,0), é usado em combinação com PEI como descrito na secção de protocolo. As células devem ser cultivadas em meios sérica e sem antibiótico, por conseguinte, uma técnica estéril é estritamente necessária para a passagem em células de transfecção e para evitar infecções dispendiosas e demoradas. A viabilidade das células deve ser de 90% ou superior, e as culturas não devem ser cultivadas a densidades superiores a 2,5 x 10 6 células / ml, imediatamente antes de uma transfecção, pois isso irá reduzir o rendimento de proteína. Para a transfecção de sucesso, culturas deve conter apenas uma única célula ou divisão. Clusters podem ser quebrados pelo vigorous vórtex de 20 a 30 segundos (Figura 5). A proporção de cada um plasmídeo utilizado na co-transfecção pode ser variado pelo utilizador de acordo com a estequiometria do complexo ser estudado. A eficiência de expressão pode ser optimizado para a proteína de interesse, de modo que um tempo de expressão adequado pode ser estabelecida. A purificação devem ser realizadas mantendo a amostra fria proteína em todos os momentos para reduzir o risco de degradação proteolítica não desejado. A escolha de marcas e memórias intermédias de purificação é crítica, uma vez que podem interferir com os elementos estruturais ou locais activos de determinadas proteínas, resultando muitas vezes na solubilidade e / ou a perda de actividade enzimática reduzida. Transfecções pequena escala são particularmente úteis para testar diferentes construções para a purificação de grandes complexos de proteínas. Hoje em dia, uma grande variedade de metodologias alternativas estão disponíveis para a expressão de proteínas eucarióticas recombinantes (Quadro 2). Por exemplo, Baculovirus de expressão em células de insecto é amplamente utilizado devido à sua elevada eficiência de transdução e a sua falta de toxicidade em comparação com outras espécies virais 6. No entanto, o processo de fabrico do vírus é demorado e sua instabilidade não permite que o vírus a ser armazenado por longos períodos. Por outro lado, os sistemas de expressão de levedura oferece a possibilidade de as células a densidades muito elevadas de crescimento em culturas de fermentação, resultando em rendimentos elevados de proteína 7. Mas ainda não têm toda a variedade de modificações pós-tradução necessárias para proteínas eucarióticas para dobrar correctamente e interagem com os seus parceiros de proteína. HDAC3, por exemplo, é expresso, mas não se dobra em E. coli. No entanto, quando expressa em células 293F, que foram capazes de purificar uma enzima activa num complexo com o seu co-repressor (SMRT) e uma molécula de inositol tetrafosfato (IP4) 8, o qual não se encontra em células procarióticas. Este método também permitiu-nos a purificar e resolver o cristal Structure de HDAC1 interagindo com MTA1 no complexo NURD, a qual é igualmente activado pelo IP4 9. Idealmente, nós sempre gostaria de expressar proteínas eucarióticas em seu ambiente natural, fisiológico. Os sistemas de expressão de mamífero empregando células HEK 293-EBNA1 em biorreatores 10-12 foram descritas e produzir níveis muito elevados de proteína, mas estas podem ser complexas. O nosso método é uma alternativa simples e acessíveis a expressão em sistemas de bactérias, leveduras e biorreatores. O método de expressão é rápido e não requer o uso de equipamento caro, especialmente se o ambiente em frascos rotativos ou frasco é substituída com 5% de CO 2 e agitam as incubadoras convencionais são utilizados. Usámos estes protocolos de co-transfectar vários plasmídeos e purificar complexos com até cinco proteínas com rendimentos de&gt; 1 mg / L de cultura. Curiosamente, o sistema ajuda a identificação de complexos estáveis ​​bem comportados. Por exemplo, expressão do complexo binário de HDAC1 e deram rendimentos limitados Sin3A de proteína, mas a adição de SDS3 resultou em 5 vezes quantidades mais elevadas e, portanto, guia a biologia estrutural na escolha de construções adequadas e complexos estáveis ​​para cristalização.

O rápido progresso da biologia celular e molecular a necessidade constante de drogas melhorou em medicina criou uma necessidade para os biólogos estruturais de olhar para estruturas de proteínas cada vez mais complexos. Estas muitas vezes podem exigir determinadas modificações pós-traducionais, chaperones moleculares e co-fatores para apoiar a sua dobradura elaborado e atividade enzimática. Embora a grande maioria das estruturas presentes no Protein Data Bank foram obtidos usando os sistemas de expressão bacterianos, procariotas são incapazes de realizar um grande número de modificações e estas não têm muitos co-factores essenciais eucarióticas. Isto pode ser um problema para o estudo de grandes complexos de multi-subunidades que são activados por pequenas moléculas de sinalização, bem como para nuclear, da superfície da célula e as proteínas segregadas que requerem mecanismos de dobragem elaborados. Um número de E. coli foram projetados para superar algumas destas limitações 1. Nos últimos anos, no entanto, a utilização de msistemas de expressão ammalian tem vindo a aumentar, porque eles produzem de forma confiável proteínas eucarióticas que são de outra problemática para expressar em outros sistemas 2. Hoje em dia, é possível obter linhas celulares estáveis ​​de mamífero e expressão transitória por meio de uma variedade de técnicas que vão desde a transdução virai da transfecção mediada por produto químico, o gene de transferência física, tais como electroporação e injecção directa 3. Apesar de todos esses métodos têm o seu próprio conjunto de vantagens e desvantagens, apenas alguns deles são adequados para estudos estruturais serem muito caros e / ou demorado. Aqui nós descrevemos um método muito simples, rápido, de baixo custo, mas altamente eficiente para expressar complexos de proteínas para a biologia estrutural na suspensão crescido células de mamíferos. A abordagem utiliza transientes de co-transfecção de uma linha de rim embrionário humano (HEK) célula (por exemplo, células HEK 293F Livres). Estas células foram derivadas da ce HEK 293linha ll, estão adaptadas a crescer em culturas de suspensão, atingindo altas densidades utilizando meio isento de soro (por exemplo, 293 Freestyle Expressão Médio). As células são então transfectadas transitoriamente utilizando uma versão ramificada de polietilenimina (PEI), um reagente polimérico de baixo custo que tem sido relatado para funcionar para uma grande variedade de células de mamíferos 4, formando complexos ADN / PEI que entram na célula hospedeira por endocitose 5. Este método é adequado tanto para pequena escala (30 ml) e em larga escala (até 300 ml) e as experiências podem produzir níveis elevados de complexos de proteínas purificadas. É particularmente útil para o estudo de proteínas que requerem mecanismos de dobragem complexo, co-factores ou particulares de modificações pós-tradução que não pode ser realizada por bactérias, leveduras e células de insectos. Neste protocolo, apresentam a expressão e purificação do andaime central de três proteínas do complexo de repressão transcricional Sin3A. Este consiste de histonaDeacetylase 1 (HDAC1), supressor defeituoso de silenciamento 3 (SDS3) e Switch-independente 3 (Sin3A). O complexo purificado é utilizado para ensaios de cristalização de alto rendimento.

<table><tbody><tr><td>Células HEK 293F FreeStyle&nbsp;</td><td>LifeTechnologies</td><td>R790-07</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle 293 Expression Medium</td><td>LifeTechnologies</td><td>12338-018</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>SIGMA</td><td>A220</td><td></td></tr><tr><td>Balão Erlenmeyer de 250 ml com tampa ventilada</td><td>Frascos Corning</td><td>431144</td><td></td></tr><tr><td>Roller com tampas ventiladas</td><td>Corning</td><td>01836-02</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenomina, 25 kDa, ramificado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>Faça estoques de 0,5 mg / ml em H2O, ajuste o pH para 7,0 com HCl diluído e armazene a -20 - 4&�rdm; C</td></tr><tr>Vetor <td></td><td></td><td></td><td>de expressão de mamíferos</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (DPBS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &micro; m Unidades de Filtro Centrífugo</td><td>Amicon</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Filtros ultracentrífugos (corte de 10 kDa)</td><td>Amicon</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Superdex&nbsp; 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5175-01</td><td></td></tr></tbody></table>

expressão de proteínas recombinantes de biologia estrutural em hek 293f suspensão cells: uma abordagem inovadora e acessível

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

A expressão e purificação de grandes quantidades de complexos proteicos recombinantes é um requisito essencial para estudos de biologia estrutural. Por mais de duas décadas, os sistemas de expressão procariótica, como E. coli, dominaram a literatura científica por causa de linhagens celulares eucarióticas caras e menos eficientes. Apesar da clara vantagem em termos de rendimentos e custos de expressar proteínas recombinantes em bactérias, a ausência de cofatores específicos, chaperonas e modificações pós-traducionais pode causar perda de função, dobramento incorreto e pode interromper as interações proteína-proteína de certos complexos eucarióticos de múltiplas subunidades, receptores de superfície e proteínas secretadas. O uso de sistemas de expressão celular de mamíferos pode resolver essas desvantagens, uma vez que fornecem um ambiente de expressão eucariótica. No entanto, os baixos rendimentos de proteína e os altos custos de tais métodos limitaram até recentemente seu uso para biologia estrutural. Aqui descrevemos um método simples e acessível para expressar e purificar quantidades de miligramas de proteína, realizando transfecções transitórias de células HEK (Rim Embrionário Humano) 293F cultivadas em suspensão.

Aqui mostramos de 2 L (8 x 250 ml culturas) transiente de co-transfecção e a purificação da HDAC1, SDS3, complexo ternário Sin3A. HDAC1 e SDS3 interagir com Sin3A através do domínio HDAC-interação (HID) de Sin3A. Um rendimento típico de purificação superior a 1 mg de complexo por litro de cultura. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig1highres.jpg" width="500"> Figura 1 Representação esquemática do vector de expressão pcDNA 3.1 modificado. O plasmídeo foi digerido com EcoRV e EcoRI de modo a incluir o marcador de afinidade e o local de clivagem de TEV no terminal amino de Sin3A. Para clonar as versões não marcados de HDAC1 e SDS3, o vector foi digerido com Kpnl e EcoRI. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig2highres.jpg" width="500"> Figura 2. SDS-PAGE mostra a primeira fase de purificação. A pista "proteína ligada" mostra o complexo ligado à resina de afinidade. Após a digestão de TEV, o marcador presente na Sin3A-HID é clivada e o complexo é eluída a partir da resina, como mostrado no segundo e terceiro pistas do gel. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig3highres.jpg" width="500"> Figura 3: Cromatograma de cromatografia de exclusão de tamanho utilizando proteína purificada do complexo. Note-se que o complexo puro eluído no volume vazio porque forma um dímero em solução. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig4highres.jpg" width="500"> Figura 4 mostra SDS-PAGE das fracções da filtração em gel mostrado na Figura 3. Figura 5 tripano células HEK 293F coradas de azul em 2.3x10 6 células / mL prontas para serem transfectados. Células só devem estar presentes na forma de células individuais ou divididas, enquanto grandes aglomerados pode ser cindida por vórtice vigoroso durante aproximadamente 25 seg. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Problema </td><td> Possíveis causas </td><td> Ação </td></tr><tr><td rowspan="4"> Rendimento de proteína baixa. </td><td> Baixo número de células transfectadas. </td><td> Certifique-se a densidade das células é de aproximadamente 1,0 x 10 6 antes da adição da mistura de reacção para a transfecção da cultura. </td></tr><tr><td> As células podem ter sido subcultivadas demasiadas vezes. </td><td> Use células-mãe fresca após aproximadamente 90 passeas idades. </td></tr><tr><td> O ADN pode ser degradado ou ter uma grande quantidade de impurezas. </td><td> Certifique-se o ADN de plasmídeo a ser usado tem uma proporção de 260/280 entre 1,8 e 2,0. Executando o ADN num gel de agarose é aconselhável para avaliar a sua qualidade. </td></tr><tr><td> Proteína (s) a ser expresso não são estáveis ​​ou solúveis suficiente. </td><td> Teste diferentes construções em pequena escala antes de up-scaling as transfections. Certificar-se que as etiquetas não interfiram com a estrutura da proteína (s) de interesse. </td></tr><tr><td> Células olhar turvo e ter uma cor e / ou cheiro estranho. </td><td> As células são infectadas com bactérias ou leveduras. </td><td> Boa técnica de esterilização deve ser utilizado em todos os momentos. Fumigating as capelas de fluxo laminar e UV-desinfecção sala de cultura celular em caso de infecção ajuda contendo o problema. </td></tr><tr><td rowspan="2"> As células têm baixa viabilidade. </td><td> PH errado na mídia. </td><td> Certifique-se que as culturas são cultivadas em 5-8% de CO 2em todos os momentos. </td></tr><tr><td> As células foram cultivadas até uma densidade de mais de 3,0x10 6 células / ml. </td><td> As células não devem ser cultivadas até densidades acima de 2,5 x 10 6 células / ml, imediatamente antes de uma transfecção e nunca acima de 3,0 x 10 6 células / ml. </td></tr><tr><td rowspan="2"> A purificação por afinidade não funcionou </td><td> Proteína (s) não está a ser expressa. </td><td> Veja acima. </td></tr><tr><td> Condições de purificação pode estar errado. </td><td> Ajustar as condições de tampão (por exemplo, sal elevado, de baixa concentração salina, pH). </td></tr></tbody></table> Tabela 1 Solução de problemas. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Sistema </td><td> Vantagens </td><td> Desvantagens </td></tr><tr><td> E. coli </td><td><ul><li> Rápidosistema de expressão </li><li> Elevados rendimentos proteicos </li><li> Barato </li><li> Indicado para a produção acessível de proteínas marcadas isotopicamente </li></ul></td><td><ul><li> Falta de chaperonas importantes que podem ser necessários para o dobramento das proteínas </li><li> Falta de muitas modificações pós translacionais </li><li> Podem não ter co-fatores que são importantes para a função da proteína e / ou montagem complexa. </li></ul></td></tr><tr><td> P. pastoris </td><td><ul><li> Pode executar a maioria das modificações pós-tradução </li><li> Barato </li></ul></td><td><ul><li> Falta algumas modificações pós-traducionais </li><li> Podem não ter co-fatores que são importantes para a função da proteína e / ou montagem complexa. </li></ul></td></tr><tr><td> De expressão de baculovírus em células de insecto </td><td><ul><li> Pode efectuar todas as modificações pós traducionais &lt;/ Li&gt; </li><li> Baculovirus é menos citotóxica do que outras estirpes virais </li></ul></td><td><ul><li> Preparação do vírus para a transdução é demorado </li><li> O vírus não é estável e não pode ser armazenada por longos períodos de tempo </li><li> Células de inseto pode faltar co-fatores que são importantes para a função da proteína e / ou montagem complexa. </li></ul></td></tr><tr><td> Biorreactores com sistemas de mamífero </td><td><ul><li> Pode efectuar todas as modificações pós translacionais </li><li> Pode fornecer todos os co-fatores necessários para a função da proteína e montagem complexa </li><li> Can células de cultura em altas densidades </li><li> Pode expressar todas as proteínas de mamíferos que exigem máquinas de dobrar complexos </li><li> Rendimentos muito elevados de proteína </li></ul></td><td><ul><li> Requer pessoal especializado para usar o biorreator. </li><li> Equipamento caro é necessária. </li><li> Otimizando condição expressãos pode ser demorado. </li></ul></td></tr><tr><td> As células em suspensão HEK 293F </td><td><ul><li> Pode efectuar todas as modificações pós translacionais </li><li> Pode fornecer todos os co-fatores necessários para a função da proteína e montagem complexa </li><li> Pode expressar todas as proteínas de mamíferos que exigem complexa maquinaria dobrável </li><li> Protocolo rápido e intuitivo transfecção </li><li> Relativamente barata em comparação com biorreactores e / ou outros reagentes de transfecção disponíveis comercialmente. </li></ul></td><td><ul><li> Embora acessível, não tão barato como a expressão em bactérias </li></ul></td></tr></tbody></table> Tabela 2. vantagens e desvantagens dos sistemas de expressão principais.

A expressão de proteínas recombinantes por sistemas de mamíferos está se tornando um método atraente para a produção de complexos proteicos para biologia estrutural. Aqui apresentamos um sistema de expressão simples, mas altamente eficiente, usando células de mamíferos cultivadas em suspensão para purificar complexos de proteínas para estudos estruturais.

Expressão de proteínas recombinantes de Biologia Estrutural em HEK 293F Suspensão Cells: Uma abordagem inovadora e acessível

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

O objetivo geral do vídeo a seguir é demonstrar uma técnica simples e acessível para produzir um bom rendimento de proteínas ou complexos de proteínas usando um sistema de expressão de mamíferos. Isso é conseguido cultivando células HEC 2 93 F em suspensão em uma incubadora agitada umidificada com uma atmosfera mantida a 5% de dióxido de carbono. Como segunda etapa, as células são transfectadas transitoriamente com um ou mais plasmídeos de expressão de alto número de cópias.Usando o agente de transfecção polietileno EIN ou PEI, as células foram deixadas crescer por 48 horas antes da colheita. Em seguida, a purificação da proteína é realizada usando resina de afinidade, seguida de filtração em gel para purificar o complexo proteico de interesse, a fim de realizar estudos estruturais e funcionais. Em última análise, este sistema de expressão de mamíferos acessível e simples permite a expressão e purificação de proteínas e complexos proteicos que são difíceis de expressar em células bacterianas.A principal vantagem desta abordagem é sua conveniência e versatilidade para a expressão de complexos proteicos. É quase tão fácil quanto fazer proteínas em bactérias, especialmente porque você pode misturar e combinar vetores de expressão de proteínas. O método pode ser usado inicialmente em pequena escala para testar a expressão de compressas de proteína, mas é facilmente escalável para produzir um bom rendimento de compressas de proteína Para estudos estruturais e funcionais, a chave para o sucesso é manter as células em um estado saudável, livre de bactérias ou infecções fúngicas.Como os antibióticos na mídia reduzem muito o rendimento da proteína. Para começar, remova um frasco criogênico contendo um mililitro de células HEC 2 9 3 F a uma densidade de 20 milhões de células por mililitro do nitrogênio líquido e descongele rapidamente em um banho-maria a 37 graus Celsius. Quebrar os grumos pipetando algumas vezes para cima e para baixo e pipetar todo o conteúdo para um balão cónico de cultura de células de 250 mililitros contendo 34 mililitros de meios pré-aquecidos.Coloque a cultura em uma incubadora de agitação orbital umidificada a 37 graus Celsius, 120 RPM e 5% de dióxido de carbono após 48 horas. Verifique a viabilidade celular por trian blue. A viabilidade celular normal de coloração nesta fase é de aproximadamente 70%quando as células atingirem uma contagem de aproximadamente 1 milhão de células por mililitro.Massageie-os até uma contagem final de 0,35 milhão de células por mililitro em um frasco de cultura de células cônicas de 250 mililitros contendo 60 mililitros de meio pré-aquecido, continue a massagear as células a cada 48 horas ou quando atingirem a conta de aproximadamente 2 milhões de células por mililitro. Aqui é mostrada uma amostra de células HEC 2 9 3 F da coloração azul de Trian a 2,3 milhões de células por mililitro de um estoque pronto para ser semeado para transfecção de células que devem estar presentes apenas como células únicas ou em divisão. Se as células crescerem demais, elas formarão grandes aglomerados e terão uma viabilidade muito baixa, como mostrado nesta imagem.Se as células estão formando aglomerados, eles podem ser quebrados por vórtices vigorosos por 25 segundos. Para começar as culturas em grande escala, semeiam as células em meio milhão de células por mililitro em um volume final de 300 mililitros em cada garrafa de rolo de um litro. Incubar por 24 horas em um agitador orbital umidificado a 37 graus Celsius, 135 RPM e 5% de dióxido de carbono até que as células atinjam uma densidade de 1 milhão de células por mililitro.Em seguida, pipeta um total de 300 microgramas de DNA esterilizado por filtro em 30 mililitros de solução salina tamponada com fosfato ou PBS e vórtice vigorosamente por três segundos. Em seguida, adicione 1,2 mililitros de 0,5 miligramas por mililitro. Filtre a PEI esterilizada para a solução PB SDNA e vortex vigorosamente por mais três segundos.Incube a mistura em temperatura ambiente por 20 minutos antes de adicionar a mistura às células após o berço. A transfecção incuba as células em uma incubadora de agitação orbital umidificada por mais 48 horas a 37 graus Celsius, 135 RPM e 5% de dióxido de carbono após 48 horas. Colha proteínas intracelulares centrifugando células a 3000 vezes G por cinco minutos.Se o pellet celular não for para uso imediato, ele pode ser armazenado a 80 graus Celsius negativos. Este protocolo é otimizado para a purificação de complexos proteicos do núcleo em que uma das proteínas possui uma etiqueta bandeira. Para iniciar a purificação resus, suspenda a paleta de células em aproximadamente 40 mililitros de lise pré-resfriada, tampão por litro de cultura, usando uma combinação de pipetagem para cima e para baixo várias vezes e um sonicado homogeneizador de vidro por três ciclos de 15 segundos em 15 segundos desligados.Em seguida, centrifugue seu G 108.000 vezes por 25 minutos a quatro graus Celsius e retenha o nadante supino. Em seguida, equilibre 1,2 mililitros de resina aros embalada Anti-Flag por litro de cultura, lavando três vezes com tampão de equilíbrio de resina, incube o supinato, que representa o extrato celular inteiro com a resina de afinidade em um ou mais tubos de centrífuga de 50 mililitros, girando suavemente por 30 a 120 minutos de quatro graus Celsius após a centrífuga de incubação a 3000 vezes G por um minuto a quatro graus Celsius. Depois de descartar o supinato, transfira a resina para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e lave com um total de 45 mililitros de tampão pré-resfriado, centrifuga-se antes e depois descarte o supinato e repita a lavagem e centrifugação usando tampão com alto teor de sal, seguido de tampão com baixo teor de sal e tampão de clivagem TEV.Certifique-se de que cada lavagem seja suficiente para ressuspender totalmente a resina, mas não mais. Em seguida, colete uma amostra de 10 microlitros de resina e dilua em um volume de duas vezes o tampão de carga de proteína para análise para representar a amostra de proteína ligada. Não use agentes redutores, pois eles liberarão o anticorpo da resina.Em seguida, ressuspenda a resina em 10 mililitros de tampão de clivagem TEV pré-resfriado a aproximadamente 40 microgramas de protease TEV por litro de cultura original e misturado invertendo o tubo várias vezes. Os níveis de protease TEV podem ser otimizados de acordo com a quantidade de proteína expressa. Substitua a atmosfera do tubo por gás nitrogênio 100% para evitar a oxidação da proteína antes de girar suavemente durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte.Centrifugue a amostra a 3000 vezes G durante 10 minutos, depois transfira o supinato para um filtro ultracentrífugo com um limite de peso molecular adequado e concentre até 500 microlitros. Colete uma amostra de 10 microlitros da proteína concentrada e dilua em um volume de duas vezes o tampão de carga de proteína para análise. Esta amostra representa a amostra de eluato TEV.Em seguida, colete uma amostra de 10 microlitros da resina e dilua em um volume de duas vezes o tampão de carga de proteína. Esta amostra representa a amostra de resina pós-TEV. O próximo passo é passar a proteína por uma coluna de exclusão de tamanho e a matriz de filtração de gel apropriada deve ser usada de acordo com o tamanho do complexo de interesse.Neste caso, usamos uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho S 200 de 10 por 300 milímetros A para igualar a coluna de cromatografia de exclusão de tamanho com tampão de filtração em gel. Filtre a proteína através de um filtro de 0,22 mícron e carregue a amostra na coluna. Prossiga para coletar as frações à medida que saem da coluna.Como etapa final, execute a eletroférese em gel de poliacrilamida SDS ou a página SDS nas amostras coletadas, bem como as frações de filtração do gel, histona DS SLA um ou HD um supressor de silenciamento defeituoso três ou SDS três e syn três, um domínio de interação HDAC ou syn três, A HID forma um complexo turny estável. A purificação de afinidade do complexo turny pode ser observada através da página SDS. Aqui é mostrado o complexo purificado produzido pelo cot, seccionando dois litros de células.A faixa de proteína ligada mostra o complexo ligado à resina de afinidade. Após a digestão do TEV, a etiqueta presente no pecado três A HID é clivada e o complexo é aludido. A resina aqui apresentada é um cromatograma do complexo proteico purificado com uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho S 200 de 10 por 300 milímetros.Observe que o complexo puro escapa perto do volume vazio porque forma um dímero em solução. Finalmente, a análise da página SDS revela a proteína purificada nas frações de filtração do gel. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar, manter e cultivar HEC duas e três células de aplicativo, bem como como afinidade, purificar e concentrar sua proteína.Células saudáveis complexas serão essenciais para o sucesso dos experimentos, portanto, certifique-se de que elas sejam cultivadas e mantidas em suas condições e passagem regularmente. Não se deixe levar pela cultura de tecidos. É fácil para os biólogos estruturais expressar e purificar grandes quantidades de proteínas e complexos proteicos de células de mamíferos.

recombinant-protein-expression-for-structural-biology-hek-293f

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Transdução da proteína permite a entrega direta de proteínas biologicamente ativos nas células. Em contraste com os métodos convencionais, tais como a transfecção de DNA viral ou transdução este paradigma não-invasivo altamente eficiente permite a manipulação celular de uma forma titulável contornar toxicidade celular eo risco de transformação oncogênica por modificação genética permanente.

Engenharia de Proteínas Cell-permeáveis

Estratégia de Transfection otimizado para gravação de Expressão e eletrofisiológicos de Recombinante dos canais de íon em HEK-293T Células

Na era pós-genômica humana, a disponibilidade de proteínas recombinantes em conformações nativas é crucial para a investigação estrutural, funcional e terapêutico e desenvolvimento. Aqui, nós descrevemos um-teste e em grande escala sistema de expressão de proteínas em células humanas embrionárias de rim 293T que podem ser utilizados para produzir uma variedade de proteínas recombinantes.

A Plataforma de expressão adequada e geral para a produção de proteínas secretadas a partir de células humanas

Kindlins são fundamentais para a adesão celular através de integrinas mas os estudos deles foram prejudicados pela dificuldade encontrada em expressá-las de forma recombinante em hospedeiros bacterianos. Descrevemos aqui métodos para a sua produção eficiente em células de insecto infectadas com baculovírus.

Produção eficiente e Purificação de recombinante murino Kindlin-3 a partir de células de insetos de Estudos biofísicos

Desenvolvimento de proteínas de fusão biotinylatable tem muitas aplicações potenciais em diversas áreas de pesquisa. Engenharia de proteínas recombinantes é um procedimento para a frente que é eficaz em termos de custos, rendimentos elevados de proteínas personalizados.

Expressão, isolamento e purificação do solúveis e insolúveis biotinilados Proteínas de Tecido Nervoso Regeneração

Este é um protocolo rápido e econômico para a produção de proteínas de mamíferos glicosiladas secretadas e subsequente purificação em uma única etapa com rendimentos suficientes de proteína homogênea para cristalografia de raios-X e outros estudos biofísicos.

Expressão Mammalian Cell eficiente e de uma etapa de purificação extracelular glicoproteínas para a cristalização

A produção em escala laboratorial de proteínas eucarióticas com modificação pós-traducional apropriada representa uma barreira significativa. Aqui está um protocolo robusto com rápido estabelecimento e retorno para expressão de proteínas usando um sistema de expressão de mamíferos. Este sistema suporta aminoácidos seletivos, marcação seletiva de proteínas e moduladores de moléculas pequenas da composição de glicanos.

High Yield Expressão de proteínas recombinantes humanas com o Transient transfecção de células HEK293 em suspensão

sistemas de expressão em células de insecto Nonlytic são pouco utilizados para a produção, o tráfico celular / localização, e a análise funcional da proteína recombinante. Aqui, nós descrevemos métodos para gerar vectores de express e subsequente expressão da proteína transiente em linhas de células de lepidópteros disponíveis comercialmente. A co-localizao de aquaporinas de Bemisia tabaci com proteínas marcadoras fluorescentes subcelulares também é apresentada.

Expressão transitória e Celular Localização de proteínas recombinantes em células de cultura de insectos

Apresentamos abordagens para a caracterização estrutural e biofísica das glicoproteínas com a dobra de imunoglobulina por cristalografia de raios x, Calorimetria de Titulação Isotérmica e interferometria de biolayer.

Caracterização de Glicoproteínas com Dobra da Imunoglobulina por Cristalografia de Raios-X e Técnicas Biofísicas

Estudos estruturais e bioquímicos de transportadores de membrana humana requerem quantidades de miligramas de proteína estável, intacta e homogênea. Aqui descrevemos métodos escaláveis para selecionar, expressar e purificar transportadores de solutos humanos usando genes otimizados para códons.

Expressão de alto rendimento e purificação de carreadores de solutos humanos para estudos estruturais e bioquímicos

Este protocolo descreve a produção da ribonuclease humana SLFN14 recombinante e sua análise estequiométrica por fotometria de massa.<br...

Produção Rápida de Ribonuclease Humana SLFN14 Recombinante e Análise Estequiométrica por Fotometria de Massa

Aprenda a expressar proteínas recombinantes em células HEK 293F em suspensão para estudos de biologia estrutural. Este método acessível permite obter altos rendimentos de complexos proteicos difíceis de produzir em bactérias.

Expressão de proteínas recombinantes de Biologia Estrutural em HEK 293F Suspensão Cells: Uma abordagem inovadora e acessível

Explorar mais vídeos