Um In Vitro Modelo para o Estudo da Cellular Fisiopatologia em Globóides Leucodistrofia celular

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a transformação única da microglia em células GLO na presença da toxina ciclina. Isso é feito primeiro revestindo lamínulas com proteínas da matriz extracelular. Na segunda etapa, as células gliais são colocadas nas lamínulas e, em seguida, as esferas de ciclina e látex são administradas às culturas.

Na etapa final, as células são coradas por imunoquímica. Em última análise, os efeitos da ciclina na nucleação e capacidade fagocítica das células microgliais podem ser avaliados por microscopia imunofluorescente. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como o uso de linhagens celulares microgliais, é que o uso de culturas gliais primárias imita as interações hipotéticas entre astrócitos I e micróglia em cérebros de indivíduos com leucodistrofia de células vazias GLO ou GLD demonstrando o procedimento será KO Claycomb, um estudante de pós-graduação do meu laboratório.

Para preparar a matriz extracelular ou lamínulas revestidas com ECM, primeiro mergulhe as lamínulas circulares com ácido clorídrico estéril em uma placa de Petri estéril. Após 30 minutos, lave as lamínulas três vezes com água estéril e mergulhe-as em etanol a 95% por pelo menos 20 minutos. Depois de deixar as lamínulas secarem ao ar, adicione gotículas de 150 a 250 microlitros de materiais de revestimento de proteína ECM diluídos em uma folha de paraforma distribuindo as gotículas para que as lamínulas não se sobreponham após a colocação.

Em seguida, use uma pinça para colocar suavemente uma lamínula em cada gota e, em seguida, coloque a paraforma dentro de uma capa de cultura de células com a faixa fechada após quatro a seis horas, coloque as lamínulas com o lado revestido com ECM para cima em poços individuais de uma placa de 24 poços. Em seguida, lave cada poço com PB S3 estéril vezes e guarde as lamínulas a quatro graus Celsius. Para preparar as células gliais para o revestimento nas lamínulas, aspire o meio das culturas de células gliais e, em seguida, lave suavemente as monocamadas três vezes com 10 mililitros de PBS estéril.

Separar as células com oito a 10 mililitros de tripsina EDTA após cinco a 10 minutos. A 37 graus Celsius, adicione 20 mililitros de meio completo ao frasco para interromper a reação. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros e gire as células por 10 minutos.

A 300 Gs e temperatura ambiente, use um P 1000 para ressuspender suavemente o palato em dois mililitros de meio fresco e completo. Após a contagem, dilua as células para aproximadamente uma vez 10 elevado a quinta células por mililitro. Agora coloque 500 microlitros das células em cada uma das lamínulas revestidas com ECM.

Adicione mais meio completo fresco a cada poço e, em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius por três a cinco dias. Assim que as células atingirem a confluência desejada, adicione ciclina recém-preparada a cada poço e gire suavemente a placa de cultura para misturar. Após uma semana de tratamento com ciclina, colete o meio e fixe as células em 500 microlitros de frio, 4% para formaldeído por poço à temperatura ambiente.

Em seguida, lave cada poço três vezes com PBS e armazene as placas a quatro graus Celsius. Para visualizar as células GLO por imunocitoquímica, primeiro substitua o PBS por tampão de bloqueio e incube as células à temperatura ambiente. Após uma hora, incube as células em anti-soros primários contra o marcador de microglia IO por pelo menos uma hora em temperatura ambiente e, em seguida, lave cada poço três vezes em PBS por cinco minutos.

Depois de incubar as células com o anticorpo secundário conjugado com fluorescência apropriado, contracorar as células com DAPI para identificar os núcleos. Em seguida, depois de lavar as células conforme demonstrado, use o meio de montagem para montar cada lamínula em lâminas de microscópio individuais e visualize as lâminas em um microscópio fluorescente para análise visual e quantitativa. Para avaliar a atividade fagocítica da microglia tratada com ciclina após o tratamento com ciclina, mas antes da fixação, adicione esferas de látex marcadas com FITC a cada cultura de células G OID de acordo com o fabricante e as instruções.

Após 48 horas, fixe as células em PFA como acabamos de demonstrar e, em seguida, processe as células para imunoquímica, conforme mostrado. Finalmente, avalie o número de IBO uma microglia positiva que colocalizam com os grânulos marcados com fluorescência por microscopia imunoquímica de fluorescência. A coloração da microglia usando IO one em conjunto com uma contracoloração nuclear permite a identificação de grandes células multinucleadas arredondadas.

Observe que, em muitos casos, o aumento bruto do tamanho do núcleo reflete o status multinucleado dessas células, conforme observado nesta imagem, o tratamento com ciclina também evoca uma ativação generalizada da microglia que é mensurável por um aumento na atividade ácida PHA da microglia mononucleada, bem como as células GLO multinucleadas. Conforme observado nesta imagem representativa, os perfis PHA acidamente ativos de IBO uma microglia positiva podem ser prontamente identificados durante a co-cultura com células progenitoras de oligodendrócitos. As implicações desta técnica se estendem para a terapia de GLD, pois a formação dessas células multinucleadas em resposta ao tratamento com ciclina é uma característica definidora da neuropatologia de GLD e a contribuição dessas células para essa patologia não foi explorada dessa maneira anteriormente.