Name: Um In Vitro Modelo para o Estudo da Cellular Fisiopatologia em Globóides Leucodistrofia celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Aprenda a transformação de microglia em células globoides usando culturas primárias de glia e cicloheximida. Este modelo in vitro demonstra a fisiopatologia celular na leucodistrofia de Krabbe para estudos terapêuticos.

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Este trabalho foi apoiado em parte por doações da National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 para SJC), dos Institutos Nacionais de Saúde (NS065808 para ER NS078392 para SJC), fundos iniciais do UConn Health Center (para SJC) e do Kim Family Fund (UCHC em apoio ao CHIC).

Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com a Política de Atenção Humanizada e Uso de Animais de Laboratório estabelecido pelo Office of Laboratory Animal Welfare (NIH) e somente com a aprovação do Comitê de Cuidados e Uso Animal Institucional (IACUC) da Universidade de Centro de Saúde de Connecticut. 1 Preparação de culturas mista glial <ol><li> Esterilizar todos os instrumentos antes de usar. Adicione 3 mL de solução gelada estéril salina equilibrada de Hank (HBSS) contendo catiões não (Mg2 + ou Ca2 +) para 60 milímetros estéreis três placas de Petri mantidos em gelo para manter frio. </li><li> Isolar os córtices de pós-natais P0-P2 rato filhotes, como descrito anteriormente 17,18. NOTA: As estruturas subcorticais, como o hipocampo, não estão incluídos nestas culturas. </li><li> Retire cuidadosamente as meninges e, em seguida, transferir os córtices isoladas de HBSS e dissociar os tecidos enzimática, utilizando um nekit dissecção dos tecidos ural de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Placa as células em estéreis frascos T-175 e incubar durante a noite em meio [meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) contendo 1x penicilina / estreptomicina]. </li><li> Substituir todos os meios de comunicação social no dia seguinte com meio fresco. Continue-se a incubar as culturas, com mudanças de meio regulares, durante cerca de 3 semanas ou até que uma monocamada celular é estabelecida. NOTA: Este monocamada será compreendido de astrócitos e microglia com cerca de 10: 1 19. </li></ol> 2. Globóides Indução celular em culturas mista glial <ol><li> Prepare as lamelas revestidos de ECM. <ol><li> Soak lamelas circulares com ácido clorídrico 1 N estéril (HCl) em uma placa de Petri esterilizada, durante 30 minutos. Lavar 3x lamelas com água esterilizada e depois imersão em 95% de EtOH, durante pelo menos 20 min. e deixe secar ao ar. </li><li> Coloque gotas de matr extracelular diluídomateriais ix (ECM) de revestimento de proteína sobre uma folha de Parafilm (por exemplo, 150-250 mL / gotícula da laminina de 10 ug / ml dissolvido em solução tampão de fosfato estéril [PBS]). Distribua as gotas para que lamelas não vai tocar quando colocada sobre essas gotículas. Delicadamente, coloque cada lamela seca em uma gota com a pinça. </li><li> Deixe as lamelas sobre as gotas de aprox. 4-6 horas dentro da capa de cultura com a faixa fechada. </li><li> Coloque as lamelas revestidas com MEC (revestido de ECM secundários acima) em cada um dos poços de uma placa de 24 poços. Lavar cada poço com 3 x PBS estéril e manter a 4 ° C até ser necessário. </li></ol></li><li> Preparação da glia As células para plaqueamento em Lamelas. <ol><li> Aspirar a mídia das culturas gliais e lavar cuidadosamente as 3x monocamada gliais com 10 ml de PBS estéril. Em seguida, adicionar 8-10 ml de solução de tripsina-EDTA para o T-175, e incubar durante 5-10 min a 37 ° C. </li><li> Quando a maioria da monocamada foi individual, adicionar 20 ml de meio completoao frasco para parar a tripsinização. Recolher os meios contendo as células isoladas num tubo de 50 ml e girar durante 10 min a 300 xg à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento, e, em seguida, re-suspender as células em 2 ml de meio completo fresco pipetando suavemente a solução usando uma pipeta P1000. </li><li> Determinar o número de células utilizando um hemocitómetro e, em seguida, re-suspender as células em meio completo com uma densidade desejada (por exemplo 10 5 células / ml). Placa as células nas lamelas de cobertura revestidas com ECM (por exemplo, 500 ul em cada poço da placa de 24 poços). Adicionar meio completo fresco adicionais a cada poço para 3-5 dias de incubação a 37 ° C, ou até que as células crescer até à confluência desejado visual. </li></ol></li><li> O tratamento com Psicosina. <ol><li> Reconstituir o psicosina a uma concentração de estoque (108,3 mM) em dimetil sulfóxido (DMSO). Diluir esse estoque em 100% EtOH para fazer um estoque de trabalho que pode on ser adicionado em cada poço da placa de 24 poços para atingir uma concentração final de 10 uM. </li><li> No momento da adição do psicosina, agite suavemente a placa de cultura para misturar o psicosina em meios de cultura. Suplementar o psicosina adicionando o equivalente a 10 uM em dias alternados durante uma semana. </li></ol></li><li> Após 7 dias de tratamento psicosina, recolher os meios de comunicação e de pipeta 500 mL de frio paraformaldeído 4% (PFA) em cada poço. Incubar à temperatura ambiente durante 20 minutos para fixar as células. Em seguida, lavar cada poço 3 vezes com PBS e, em seguida, manter as placas a 4 ° C até serem processadas para imunocitoquímica (ver abaixo). NOTA: meios de cultura de células podem ser recolhidas para enzimática ou ensaio ELISA, neste ponto, se desejado. </li></ol> 3. Imunocitoquímica (ICC) para visualizar Globóides Células <ol><li> Substituir PBS com tampão [PBS + 0,3% de Tween-20 + 5% de soro normal de cabra (NGS)] de bloqueio, e incuba-se as células durante 1 h à temperatura ambiente. </li><li> EmCubate as células fixadas em anti-soros contra o primário Iba-1 [(1: 1000), diluído em PBS + 0,3% de Tween-20 + 2% de NGS] durante pelo menos 1 hora à temperatura ambiente, em seguida lavar cada poço com PBS 3 x 5 min / lavar. </li><li> Adicionar o anticorpo secundário conjugado de fluorescência adequado para identificar a marcação de anticorpos e anti-mancha principal com 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, 1: 1000) para identificar os núcleos. Incubar em solução de anticorpo secundário durante 1 h à temperatura ambiente e lava-se com PBS, 3x 5 minutos. </li><li> Monte cada lamela a lâminas de microscópio utilizando um meio de montagem. Exibir slides em um microscópio de fluorescência para análise visual e quantitativa. </li></ol> 4 Análise e caracterização de células Globóides em cultura primária <ol><li> Use as três seguintes critérios morfológicos para identificar uma célula Globóides na cultura: <ol><li> Identificar células Globóides usando microscopia de fluorescência através da marcação imunoistoquímica para o marcador de microglia, Iba-1 +. </li><li> IdentificarGlobóides como células polinucleadas (isto é, contendo dois ou mais núcleos positivos DAPI). </li><li> Identificar células Globóides por uma morfologia arredondada distinta da aparência muito ramificado de descansar micróglias. NOTA: As células também podem ser recolhidos para análise de marcadores de superfície das células e quantificação por citometria de fluxo a partir de destas culturas. </li></ol></li><li> Medir a ativação fagocitária de microglia e células Globóides <ol><li> Para avaliar a atividade fagocítica de microglia tratados com psicosina, adicione esferas de látex FITC identificados nos poços, de acordo com as instruções do fabricante. Adicionar pérolas de látex fluorescentes conjugados 48 horas antes da fixação com PFA. Corrigir as células tratadas com pérolas (como mencionado na seção 2.4), e processo para imunocitoquímica (como descrito na seção 3). </li><li> Seleccionar anticorpos secundários fluoróforos de modo que eles não se sobreponham os espectros de emissão de fluorescência do fluoróforo às contas de rotulado. </li><li> Analyze os perfis de fagocï¿½ica Iba-1 + microglia por identificação das células que co-localizados com os grânulos fluorescentemente marcado. NOTA: Psicosina ativará microglia. Grânulos fagocitados serão identificados dentro Iba-1 células mononucleares e multinucleadas + neste cenário cultura. </li></ol></li></ol> 5. indução de células Globóides de culturas puras Microglial Observação: Uma abordagem alternativa para decifrar a sinalização intercelular entre astrócito e microglia é outra vantagem deste modelo in vitro de células globoso. A purificação de células microgliais primárias para replating ou de co-cultura pode ser obtida pela sua propriedade de aderência inferior em cultura, tal como descrito nos passos seguintes (ver Secção 5.2). <ol><li> Recolha a mídia das culturas gliais mistas confluentes em tubo de 50 ml e mantê-la a 37 ° C na incubadora. </li><li> Isolamento da microglia de culturas mista glial primários.<ol><li> Depois de remover a mídia de uma garrafa mista confluente T175 cultura glial, adicionar mídia agitação quentes [consistindo de mídia completo + 25 mM 4 (2-hidroxietil) -1-piperazina (HEPES) de bicarbonato de sódio + 25 mM (Sigma)]. Agitar os frascos durante 3-4 horas num agitador orbital a 100 rpm (37 ° C). Recolha os media destes frascos agitados em 50 ml tubos cônicos. NOTA: Este suporte vai incluir a microglia menos aderente dos frascos. </li><li> Girar os meios de comunicação a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e voltar a suspender as células em 2 ml do meio condicionado de astrócitos (coletados na etapa 5.1). </li><li> Estabelecer o número de células obtidas utilizando um hemocitômetro e depois a chapa micróglias em lamelas revestido de substrato (ver secção 2.1) para imunocitoquímica ou placa na ULTRALOW placas aderência bem para o futuro conjunto de células Globóides para co-cultura com outros tipos de células, tais como oligodendrócitos (como described na seção seguinte). NOTA: Uma vez banhado a microglia pode ser tratada com psicosina (10 mM), como descrito acima (ver secção 2.3). </li></ol></li><li> Co-cultura com Primários Oligodendrócitos para Análise de citotoxicidade. NOTA: Recolha de microglia tratado psicosina das baixas para as placas de aderência subsequente co-cultura em culturas primárias de oligodendrócitos, ou células progenitoras de oligodendrócito, pode ser utilizado para examinar o potencial citotóxico função destas células-globoso, como in vitro. <ol><li> Desenvolver culturas de oligodendrócitos primário utilizando métodos estabelecidos 18,20. Para recolher a microglia tratado psicosina, pipetar suavemente para separar as células fracamente aderentes a partir do fundo dos poços. Recolher as células, centrifugar a 300 xg durante 10 min, e em seguida ressuspender cuidadosamente em meios de diferenciação de oligodendrócitos [composto de meios Neurobasal, L-glutamina (1x), B-27, suplemento (1x) e triiodotironina (T3, 10 ng / mL )]. </li><li> Conte o número de células utilizando um hemocitómetro e as sementes, em seguida, para a cultura de microglia oligodendrócitos a 1 x 10 5 células / ml, resultando num aproximada proporção de 1: 2 a microglia / oligodendrócito. Incubar como uma co-cultura durante 3 dias. </li><li> Fixar as células para imunocitoquímica (ver secção 2.4). Recolhe meios de cultura de células para o ELISA ou análises químicas, conforme necessário. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

O protocolo aqui descrito fornece um novo sistema modelo para estudar o desenvolvimento e caracterização funcional de microglia ativados e células Globóides. Trabalhos anteriores por Im et al. utilizando uma linha celular HEK293 fornecido um modelo para o desenvolvimento do presente protocolo para o estudo da formação de células globoso 21. É também importante salientar que as células derivadas Globóides no modelo diferem das células nativas Globóides identificáveis ​​em GLD. Por exemplo, temos obser...

Leucodistrofia celular Globóides (GLD), também conhecida como doença de Krabbe, é uma doença desmielinizante fatal, resultante da perda de mutações de função no galatocerebrosidase (GalC) do gene 1. A forma mais prevalente de GLD é a variante infantil que se caracteriza por início na infância e caracteriza-se por um curso clínico agressivo do motor e do declínio cognitivo, levando à morte prematura, muitas vezes antes dos cinco anos de idade 2,3. O teste genético é utilizado para verificar o diagnóstico de GLD 4. Neuropatologia da GLD revela desmielinização generalizada, atrofia neuronal, astrogliosis e presença de microglia multi-nucleadas ingurgitadas chamadas células Globóides 5-7. A identificação de células Globóides, muitas vezes contendo inclusões tubulosas no seu citoplasma, tem sido uma característica de definição de GLD para os últimos 97 anos, embora a função específica destas células visíveis tem permanecido elusiva. A participação das organizações não-myelinating glia (microglia e astrócitos) na patogênese da GLD tem sido considerada uma resposta secundária à profunda desmielinização nesta doença 8. Curiosamente, a primeira descrição da doença, feita por Knud Krabbe em 1916 5, formação relatado dos fagócitos multinucleadas contendo detritos lipídica que foram nomeados &#39;Globóides células &quot;e são uma característica desta doença. Células Globóides são a característica marca de GLD patologia, apesar de seu papel na GLD tem sido ignorado. Curiosamente, estas células estão entre as primeiras alterações características no tecido do SNC de GLD. Esta falta de conhecimento pode ter sido devido à suposição de que a formação de fagócitos multinucleadas, chamadas de células gigantes em outras doenças, são normalmente considerados como uma consequência de uma patologia, em vez de uma força motriz patogénico inicial 9. Portanto, há poucos estudos sobre os mecanismos pelos whicélulas Globóides ch são formados a partir de fagócitos, em particular no sistema nervoso central de GLD. O procedimento descrito no presente relatório centra-se na importância da formação de células Globóides no SNC e nossa manifestação anterior que multinucleações induzida por psicosina de microglia in vitro e essas células apresentaram níveis mais altos de atividade fagocitária. Consistente com essas observações, as células Globóides em cérebros Twitcher contêm freqüentemente detritos PAS-positivo, sugerindo níveis elevados de atividade fagocitária. Células Globóides também são encontrados para ser imunopositivas para ferritina (um marcador de microglia) 10, KP-1 / CD68 (um marcador de monócitos), e alguns também são positivas para vimentina (uma proteína intermediária filamento e marcador de astrócitos e microglia ativada) 11, HLA-RDa (um receptor da superfície MHCII), e TNF-α 7, e Iba-1 (uma proteína de ligação de cálcio utilizado para identificar microglia) 12. Com base neste conjunto de marcadores, células Globóides originam de microglia que desenvolvemum fenótipo original. Apesar de sua singularidade, a função ea contribuição dos GCs para GLD patogênese específica tem sido largamente ignorado. Células Globóides ter sido pensado para ser uma consequência secundária de desmielinização crônica. No entanto, estudos anteriores examinaram a relação temporal de células Globóides para a patologia da substância branca de GLD identificaram a presença de células no final do Globóides embrionário para períodos de pós-natais; tempos que precederam a apoptose de oligodendrócitos e desmielinização evidente 13. Assim, a sequência temporal do desenvolvimento da neuropatologia no GLD sugere que as células Globóides são formadas antes da desmielinização nesta doença 14. Isto levou a nossa hipótese de que o início da formação de células Globóides em GLD pode representar um evento patogénico definindo, em vez de, uma resposta secundária a danos reactivo oligodendrócitos 15. Além disso, a desregulação da atividade da microglia em GLD tem sido considerado um factor limitando a sua eficácia a longo prazo da terapia de células estaminais hematopeotic para tratar esta doença 16. Assim, investigando as funções celulares e regulação da microglia e células Globóides, em resposta a psicosina deverá fornecer novos insights na patogênese da GLD. Até recentemente, a falta de um modelo adequado para estudar a formação de células globoso limitou a compreensão da função e contribuição exacta destas células para a patologia de GLD. Em estudos recentes, foi determinado que as células-Globóides como pode ser formado em resposta directa a Psicosina, uma toxina lípido patogénico que se acumula em GLD. Descobrimos que a microglia, mas não macrófagos, são activadas e transformado em células Globóides em culturas gliais primários, em resposta a Psicosina 15. Esta transformação em células Globóides foi encontrado para ser mediada pela protease extracelular, as metaloproteinases de matriz (MMP) -3 15. Mais recentemente,estenderam estas conclusões e determinou que microglia e Globóides células ativadas por psicosina desenvolvidos neste sistema in vitro modelo são potencialmente tóxicos para os oligodendrócitos e as células progenitoras de oligodendrócitos. Assim, quando considerado no contexto de GLD, a acumulação inicial de psicosina e formação de células Globóides anteriores à desmielinização apoiam um papel patogénico primário e eventualmente em microglias emergente para esta doença. Propomos que o estudo da formação de células Globóides irá revelar novas informações sobre a patogenia da GLD que irá contribuir para a nossa compreensão da doença. Além disso, esse novo modelo de celular da GLD pode fornecer um novo formato a partir do qual novas abordagens terapêuticas para lidar com alterações patológicas esta doença poderia ser testada. Assim, neste relatório nós fornecemos um protocolo detalhado para o desenvolvimento in vitro de células Globóides induzida por psicosina de culturas primárias de células da glia não myelinating.

<table><tbody><tr><td>Hank' s solução salina balanceada (HBSS) sem cátions (Mg2+ e Ca2+).</td><td>Life technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Dissociação de Tecido Neural</td><td>Miltenyi</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>40 &#956; m filtro de células</td><td>Fisherbrand</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s solução salina balanceada (HBSS) contendo cátions (Mg2+ e Ca2+).</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Soro fetal bovino Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>(FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Life technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Solução de tripsina-EDTA</td><td>Life technologies</td><td>25299-056</td><td></td></tr><tr><td>Psicossina</td><td>Sigma</td><td>P9256</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)Ciência da</td> <td>Microscopia Eletrônica</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Cabra Normal (NGS)</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>Iba-1</td><td>WAKO</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor conjugado Antisera</td><td>Life Technologies</td><td>Vários</td><td></td></tr> meios <tr><td>de montagem</td><td>Southern Biotech</td><td>OB100-01</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio fagocítico</td><td>Cayman Chemicals</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>BP310-500</td><td></td></tr></tbody></table>

um in vitro modelo para o estudo da cellular fisiopatologia em globóides leucodistrofia celular

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

A função precisa da microglia multi-nucleadas, chamados de células Globóides, que são excepcionalmente abundantes no sistema nervoso central de leucodistrofia celular globoso (GLD) é incerto. Esta lacuna no conhecimento tem sido dificultada pela falta de um adequado modelo in vitro para o estudo. Relata-se um sistema de cultura glial murino primário em que o tratamento com resultados psicosina em multinucleações de microglia semelhantes às células Globóides características encontradas em GLD. Usando este novo sistema, que definiu as condições e modos de análise para o estudo de células Globóides. O potencial de uso deste sistema modelo foi validado em nosso estudo anterior, que identificou um papel potencial para metaloproteinases da matriz (MMP) -3 em GLD. Este novo sistema in vitro pode ser um modelo útil para estudar a formação e função, mas também a manipulação terapêutica potencial, destas células únicas.

Este protocolo, como está escrito, deverá ter cerca de 36 dias para ser concluído do início ao fim (veja a Figura 1: Esquema de Fluxo de Trabalho Experimental). Tem sido nossa experiência que o desenvolvimento de células "Globóides-like 'neste sistema de cultura primária é confiável e reprodutível: a formação de células multinucleadas em resposta a psicosina é observado de forma consistente com 7 dias de tratamento. Coloração imunocitoquímica de microglia usando Iba-1 em con...

As células globóides são uma característica patológica definidora da doença de Krabbe, uma leucodistrofia que atualmente carece de uma terapia eficaz a longo prazo. Desenvolvemos um modelo de cultura de células para estudar a biologia inata e o potencial patogênico da microglia ativada e sua transformação em células globóides.

Um In Vitro Modelo para o Estudo da Cellular Fisiopatologia em Globóides Leucodistrofia celular

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a transformação única da microglia em células GLO na presença da toxina ciclina. Isso é feito primeiro revestindo lamínulas com proteínas da matriz extracelular. Na segunda etapa, as células gliais são colocadas nas lamínulas e, em seguida, as esferas de ciclina e látex são administradas às culturas.Na etapa final, as células são coradas por imunoquímica. Em última análise, os efeitos da ciclina na nucleação e capacidade fagocítica das células microgliais podem ser avaliados por microscopia imunofluorescente. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como o uso de linhagens celulares microgliais, é que o uso de culturas gliais primárias imita as interações hipotéticas entre astrócitos I e micróglia em cérebros de indivíduos com leucodistrofia de células vazias GLO ou GLD demonstrando o procedimento será KO Claycomb, um estudante de pós-graduação do meu laboratório.Para preparar a matriz extracelular ou lamínulas revestidas com ECM, primeiro mergulhe as lamínulas circulares com ácido clorídrico estéril em uma placa de Petri estéril. Após 30 minutos, lave as lamínulas três vezes com água estéril e mergulhe-as em etanol a 95% por pelo menos 20 minutos. Depois de deixar as lamínulas secarem ao ar, adicione gotículas de 150 a 250 microlitros de materiais de revestimento de proteína ECM diluídos em uma folha de paraforma distribuindo as gotículas para que as lamínulas não se sobreponham após a colocação.Em seguida, use uma pinça para colocar suavemente uma lamínula em cada gota e, em seguida, coloque a paraforma dentro de uma capa de cultura de células com a faixa fechada após quatro a seis horas, coloque as lamínulas com o lado revestido com ECM para cima em poços individuais de uma placa de 24 poços. Em seguida, lave cada poço com PB S3 estéril vezes e guarde as lamínulas a quatro graus Celsius. Para preparar as células gliais para o revestimento nas lamínulas, aspire o meio das culturas de células gliais e, em seguida, lave suavemente as monocamadas três vezes com 10 mililitros de PBS estéril.Separar as células com oito a 10 mililitros de tripsina EDTA após cinco a 10 minutos. A 37 graus Celsius, adicione 20 mililitros de meio completo ao frasco para interromper a reação. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros e gire as células por 10 minutos.A 300 Gs e temperatura ambiente, use um P 1000 para ressuspender suavemente o palato em dois mililitros de meio fresco e completo. Após a contagem, dilua as células para aproximadamente uma vez 10 elevado a quinta células por mililitro. Agora coloque 500 microlitros das células em cada uma das lamínulas revestidas com ECM.Adicione mais meio completo fresco a cada poço e, em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius por três a cinco dias. Assim que as células atingirem a confluência desejada, adicione ciclina recém-preparada a cada poço e gire suavemente a placa de cultura para misturar. Após uma semana de tratamento com ciclina, colete o meio e fixe as células em 500 microlitros de frio, 4% para formaldeído por poço à temperatura ambiente.Em seguida, lave cada poço três vezes com PBS e armazene as placas a quatro graus Celsius. Para visualizar as células GLO por imunocitoquímica, primeiro substitua o PBS por tampão de bloqueio e incube as células à temperatura ambiente. Após uma hora, incube as células em anti-soros primários contra o marcador de microglia IO por pelo menos uma hora em temperatura ambiente e, em seguida, lave cada poço três vezes em PBS por cinco minutos.Depois de incubar as células com o anticorpo secundário conjugado com fluorescência apropriado, contracorar as células com DAPI para identificar os núcleos. Em seguida, depois de lavar as células conforme demonstrado, use o meio de montagem para montar cada lamínula em lâminas de microscópio individuais e visualize as lâminas em um microscópio fluorescente para análise visual e quantitativa. Para avaliar a atividade fagocítica da microglia tratada com ciclina após o tratamento com ciclina, mas antes da fixação, adicione esferas de látex marcadas com FITC a cada cultura de células G OID de acordo com o fabricante e as instruções.Após 48 horas, fixe as células em PFA como acabamos de demonstrar e, em seguida, processe as células para imunoquímica, conforme mostrado. Finalmente, avalie o número de IBO uma microglia positiva que colocalizam com os grânulos marcados com fluorescência por microscopia imunoquímica de fluorescência. A coloração da microglia usando IO one em conjunto com uma contracoloração nuclear permite a identificação de grandes células multinucleadas arredondadas.Observe que, em muitos casos, o aumento bruto do tamanho do núcleo reflete o status multinucleado dessas células, conforme observado nesta imagem, o tratamento com ciclina também evoca uma ativação generalizada da microglia que é mensurável por um aumento na atividade ácida PHA da microglia mononucleada, bem como as células GLO multinucleadas. Conforme observado nesta imagem representativa, os perfis PHA acidamente ativos de IBO uma microglia positiva podem ser prontamente identificados durante a co-cultura com células progenitoras de oligodendrócitos. As implicações desta técnica se estendem para a terapia de GLD, pois a formação dessas células multinucleadas em resposta ao tratamento com ciclina é uma característica definidora da neuropatologia de GLD e a contribuição dessas células para essa patologia não foi explorada dessa maneira anteriormente.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este protocolo descreve a derivação de gliais Precursores restritos a partir de medulas espinais fetais e mantido in vitro, quer para transplantação ou para o estudo da linhagem oligodendrocytic.

Derivação da glia Precursores restritos de camundongos E13

O vídeo demonstra um protocolo para diferenciar células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) em oligodendrócitos e induzir mielinização em uma co-cultura com neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG). As OPCs são transduzidas com vetores lentivirais que codificam uma proteína sinalizadora que regula a mielinização. Os OPCs transduzidos são co-cultivados com neurônios DRG para avaliar a diferenciação em oligodendrócitos e a mielinização induzida por proteína de sinalização.

Um ensaio de mielinização induzida por transdução in vitro para células precursoras de oligodendrócitos

Aqui, apresentamos uma abordagem sistemática para o desenvolvimento fisiologicamente relevante, sensível e...

In Vivo Modelagem do Morbid Genoma Humano utilizando Danio rerio

Astrócitos fenotipicamente selvagens e células-tronco neurais colhidas de camundongos modificados com alelos oncogênicos condicionais floxed e transformados por meio de recombinação viral mediada por Cre podem ser usados para modelar a patogênese do astrocitoma in vitro e in vivo por injeção ortotópica de células transformadas em cérebros de irmãos de ninhada singênicos e imunocompetentes.

Modelagem astrocitoma Patogênese In Vitro E In Vivo Usando Cortical astrócitos ou células-tronco neurais de condicional, Geneticamente Modificadas Ratos

Aqui apresentamos protocolos que oferecem uma base flexível e estratégica para manipular viralmente células precursoras de oligodendrócitos para superexpressar proteínas de interesse, a fim de interrogar especificamente seu papel em oligodendrócitos por meio do modelo in vitro de mielinização do sistema nervoso central.

Produção e Uso de Lentivírus a seletivamente transduzem Primária Oligodendrocyte células precursoras para In Vitro Os ensaios mielinização

Para abordar mecanismos de desmielinização e apoptose neuronal em lesões corticais de distúrbios inflamatórios desmielinizantes, diferentes modelos animais são usados. Descrevemos aqui uma abordagem ex vivo usando células T CD8+ específicas de oligodendrócitos em fatias cerebrais, resultando em morte oligodendroglial e neuronal. Aplicações potenciais e limitações do modelo são discutidas.

Um Ex vivo Modelo de um Ataque de T-Cell dirigiu-Oligodendrocyte em Agudos fatias de cérebro

Neste protocolo, apresentamos os procedimentos para o estabelecimento de modelos de mioblastos distrofia miotônica 1, incluindo otimizado manutenção C2C12 celular, transfecção gene / transdução e diferenciação dos miócitos.

Modelando Myotonic distrofia 1 em células C2C12 de mioblastos

O objetivo desta técnica é preparar uma cultura altamente enriquecida de motoneurônios primários (MNs) de murino da medula espinhal. Para avaliar as consequências das mutações causadoras de doenças MN, descrevemos aqui o isolamento destes isolados MNs e seu transfeccao por magnetofection.

Doença de Charcot-Marie-Tooth In Vitro de modelagem por Transfecting Mouse motoneurônios primários

Os organoides cerebrais servem como um modelo valioso para estudos de encefalomiopatia mitocondrial, acidose láctica e episódios semelhantes a AVC (MELAS), oferecendo insights sobre sua fisiopatologia subjacente e fornecendo uma plataforma para triagem de drogas. Organoides derivados de linhagens celulares com níveis variados de heteroplasmia de genes causadores de doenças exibem diferenças fenotípicas significativas.

Modelagem de doenças mitocondriais usando organoides cerebrais: um foco na encefalomiopatia mitocondrial, acidose láctica e episódios semelhantes a derrames

As ataxias spinocerebelares de poliglutamina são causadas por expansões CAG que produzem proteínas propensas à agregação. Este protocolo descreve a produção de vetores, entrega estereotáxica e análise de inclusões e perda de marcadores neuronais, fornecendo uma plataforma controlada para investigar mecanismos e avaliar terapias direcionadas para doenças neurodegenerativas.

Patologia Estriatal Induzida por Lentiviral como Modelo Pré-clínico de Ataxias Espinocerebelosas de Poliglutamina

Aprenda a transformação de microglia em células globoides usando culturas primárias de glia e cicloheximida. Este modelo in vitro demonstra a fisiopatologia celular na leucodistrofia de Krabbe para estudos terapêuticos.

Um In Vitro Modelo para o Estudo da Cellular Fisiopatologia em Globóides Leucodistrofia celular

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