Isolamento de proteínas a partir da Embryonic Rato Coração Região Válvula Desenvolvimento
23 de setembro de 2014
A análise da expressão de proteínas em válvulas embrionárias jovens de camundongos foi dificultada pelo tecido limitado disponível. Este manuscrito fornece um protocolo para preparar proteínas a partir de regiões de válvulas embrionárias de camundongos em desenvolvimento para análise de western blot.
O objetivo geral deste procedimento é isolar e extrair proteínas de válvulas cardíacas embrionárias. Isso é feito isolando primeiro um embrião de uma rata grávida. Na segunda etapa, o coração é dissecado do embrião e, em seguida, as válvulas cardíacas são coletadas na etapa final.
O tecido é lisado e a amostra de proteína resultante é preparada para análise subsequente. Em última análise, a análise de BLO ocidental pode ser usada para avaliar os níveis de expressão de proteínas. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de dissecção são difíceis de aprender devido à forma pequena e compacta do coração em desenvolvimento.
No dia embrionário desejado de desenvolvimento, use etanol 70% para esterilizar o abdômen da fêmea grávida. Em seguida, levante a pele e o músculo da parte inferior do abdômen para cima e para longe dos órgãos internos e disseque a cavidade abdominal inferior para permitir o acesso ao corno uterino. Em seguida, segure o colo do útero com uma pinça e corte cuidadosamente o mimo nas pontas.
Em seguida, levante o corno uterino cortando qualquer tecido conjuntivo que mantenha o chifre no lugar e complete a remoção cortando a junção do corno uterino com o uct. Coloque o corno uterino dissecado em uma placa de Petri contendo tampão tris frio de 0,1 molar e enxágue conforme necessário. Em seguida, corte o corno uterino.
Abra longitudinalmente para expor os sacos embrionários. Para expor um embrião, abra um saco embrionário na junção da placenta e do embrião e corte os vasos umbilicais para liberar o embrião. Coloque o embrião dissecado em uma segunda placa de Petri com tampão tris molar frio de 0,1 e retorne a primeira placa de Petri com os embriões não dissecados restantes ao gelo até a próxima dissecção embrionária.
Após a decapitação, coloque o embrião de costas e corte a parede torácica verticalmente ao longo do lado da caixa torácica perto de um para mancar e horizontalmente acima do diafragma. Para visualizar o coração, abra a parede torácica. Em seguida, segure a pinça no alto ao longo dos grandes vasos, levante o coração e corte os vasos abaixo.
Em seguida, corte acima da pinça para libertar o coração. Se os vasos pulmonares permanecerem sem corte, remova os pulmões com o coração antes de continuar nos estágios embrionários aqui descritos, a artéria pulmonar é ligeiramente opaca. Depois de identificar a artéria, corte-a e remova-a acima do nível da válvula.
Agora, corte logo abaixo da válvula pulmonar, evitando o miocárdio ventricular ECD, e remova o excesso de tampão tris da região de interesse. Antes de colocar a válvula em um tubo einor contendo dois microlitros de tampão de lise como a artéria pulmonar, a aorta parecerá ligeiramente opaca. Após sua identificação, corte logo abaixo da válvula aórtica.
Novamente, evitando o miocárdio ventricular trabeculado. Remova qualquer excesso de solução tri e, em seguida, transfira a válvula para o tubo einor contendo lise, tampão e tecido da artéria pulmonar. Depois que todo o tecido tiver sido coletado, coloque imediatamente as amostras a menos 80 graus Celsius até mais.
Use para a extração de proteínas, descongele os tecidos coletados no gelo e, em seguida, pellet as amostras por um minuto a 13, 100 Gs a quatro graus Celsius. Verifique o volume da amostra resultante e use tampão de lise para elevar o volume total a 40 microlitros. Em seguida, adicione cinco milímetros de esferas de aço inoxidável para romper e homogeneizar as amostras em um lyr por dois a quatro minutos a 50 hertz, de acordo com as instruções do fabricante.
Após a homogeneização, gire os tubos brevemente e transfira as amostras para novos tubos, deixando para trás os detritos insolúveis para posterior análise experimental. Usando esta técnica de preparação, o smad fosforilado 1 5 8 pode ser detectado em regiões de válvula aórtica única de embriões E 13.5. Por exemplo, a proteína isolada de uma única região valvar é suficiente para detectar uma banda p smad fraca com a intensidade do sinal aumentando proporcionalmente ao número de regiões valvares agrupadas.
É importante ressaltar que a proporção de beta actina p smad permanece claramente constante nos diferentes tamanhos de amostra devido aos baixos níveis de proteína disponíveis, o mesmo blot não pode ser removido e reexaminado para o smad total. No entanto, um blot separado mostrando smad total um e beta actina exibe o mesmo padrão de expressão. Essas regiões valvares são quase totalmente desprovidas de miocárdio ventricular contaminante usando esta técnica de preparação em combinação com amostras do ventrículo direito, o marcador do miocárdio ventricular, um NP não é detectável nas regiões da válvula aórtica, enquanto este marcador é prontamente detectado no ventrículo.
Além disso, o marcador miocárdico ventricular de cadeia leve de miosina dois V também é facilmente detectável na amostra ventricular, mas é quase imperceptível nas regiões da válvula aórtica, ressaltando a precisão da dissecção após esta dissecção. Outros mes como QPCR ou RN AIC podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quais genes a jusante são afetados durante as diferentes etapas de desenvolvimento.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para isolar e extrair proteína de válvulas cardíacas embrionárias em camundongos. O método aborda desafios na análise da expressão de proteínas devido à disponibilidade limitada de tecido.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia do Desenvolvimento
- Pesquisa Cardiovascular
Fundamentos
- A análise da expressão de proteínas em tecidos embrionários é frequentemente limitada pelo tamanho da amostra.
- Compreender os níveis de proteínas nas válvulas cardíacas é crucial para estudos de desenvolvimento.
- A análise de Western blot é uma técnica comum para avaliar a expressão de proteínas.
- A dissecação de pequenos tecidos como corações embrionários pode ser tecnicamente desafiadora.
Propósito do Estudo
- Fornecer um protocolo detalhado para extração de proteínas de válvulas cardíacas embrionárias de camundongos.
- Facilitar a análise de Western blot para estudar níveis de expressão de proteínas.
- Melhorar a reprodutibilidade e precisão na análise de proteínas a partir de amostras limitadas.
Métodos Utilizados
- Isolamento de embriões de camundongos grávidas.
- Dissecação do coração do embrião.
- Coleta de válvulas cardíacas para extração de proteínas.
- Lise do tecido para preparar amostras de proteínas para análise.
Principais Resultados
- Extração bem-sucedida de proteína de válvulas cardíacas embrionárias.
- Preparação de amostras adequadas para análise de Western blot.
- Demonstração de técnicas de dissecação para aprendizagem eficaz.
- Avaliação dos níveis de expressão de proteínas em tecidos cardíacos em desenvolvimento.
Conclusões
- O protocolo permite o estudo eficaz da expressão de proteínas em válvulas cardíacas embrionárias.
- Auxílios visuais são essenciais para dominar as técnicas de dissecação.
- Este método pode avançar a pesquisa em desenvolvimento cardíaco e campos relacionados.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Protein isolation from limited embryonic tissue enables detection of signaling pathway activation in early developmental models. This approach supports target validation by providing semi-quantitative data on phosphorylated proteins from pooled microdissected valve regions. The method addresses a key bottleneck in preclinical research where sample scarcity hinders mechanistic de-risking of cardiovascular targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in cardiac valve development through detection of phosphorylated signaling proteins like pSmad1/5/8.
- Operational Value: Provides a reproducible workflow for protein extraction from four E13.5 mouse aortic valve regions, each yielding ~1 µg protein.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing semi-quantitative assessment of pathway activation in disease-relevant embryonic systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological samples for downstream western blot analysis, enabling reliable compound evaluation in phenotypic screening.
- Operational Value: Standardizes lysis and homogenization protocols using Tris-based buffer with protease inhibitors and SDS-sample buffer for denaturation.
- Scalability: Enables platform reuse across developmental timepoints by pooling tissue to overcome low protein yield limitations.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase protein expression data to preclinical validation through consistent pSmad/β-actin ratios across sample sizes.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target engagement by confirming ventricular myocardium exclusion via absence of MYL2V and ANP markers in valve regions.
- Predictive Confidence: Enables risk-adjusted advancement decisions by linking protein expression patterns to developmental stages using internal controls.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing mechanistic readouts from disease-relevant embryonic systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through detection of phosphorylated signaling proteins in valve tissue.
- Screening: Delivers assay-ready samples with standardized protein extraction, enabling reproducible western blot outputs for compound screening.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements via chemiluminescent signal intensity proportional to protein pool size, supporting comparative condition analysis.
- Translational Research: Maintains continuity from embryonic discovery to preclinical models by preserving pathway-specific expression patterns detectable in separate blots for total Smad and β-actin.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable capability for protein isolation across embryonic cardiovascular studies, reducing redundant protocol development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by enabling detection of low-abundance phosphorylated proteins from microdissected tissues.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined lysis volumes, bead-based homogenization, and consistent sample preparation for western blot.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in early cardiovascular target assessment.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by providing semi-quantitative pathway activation data from embryonic valve regions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection of embryonic cardiac structures to isolate valve regions without ventricular myocardium contamination.
- Dependent on instrumentation for homogenization (lyser with stainless steel beads) and centrifugation at 13,100 × g for sample clarification.
- Necessitates cross-team standardization of lysis buffer volumes (40 µL final volume) and protease inhibitor use to ensure sample consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to other embryonic tissues or developmental stages beyond E13.5 aortic valve regions.
- Includes practical limitations such as inability to quantify total protein via spectrophotometry due to low yield, requiring reliance on semi-quantitative western blot analysis.
