Imagens em tempo real de células mielóides em Dynamics Apc ^{Min / +} Intestinal Tumores girando Disk microscopia confocal

O objetivo geral deste procedimento é visualizar a dinâmica das células mieloides dentro dos tumores intestinais de um animal vivo. Isso é feito injetando primeiro moléculas fluorescentes e atropina em camundongos PC min. Na segunda etapa, o intestino é preparado para a imagem e o camundongo é posicionado no estágio do microscópio.

Na etapa final, as imagens do tumor dentro do animal vivo são adquiridas, em última análise, girando o disco confocal. A microscopia pode ser usada para visualizar o comportamento das células mieloides dentro dos tumores de camundongos vivos durante várias horas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do câncer, como qual é o papel das células humanas no câncer colorretal?

Comece usando fita adesiva de laboratório para prender duas lamínulas na inserção da platina da plataforma de imagem do microscópio. Em seguida, coloque a inserção no palco e limpe-o com lenços umedecidos com álcool. Em seguida, gire o esterilizador de esferas quentes a 250 graus Celsius e, em seguida, esterilize os instrumentos cirúrgicos por 30 segundos enquanto as ferramentas estão esfriando.

Coloque esta tampa de isopor entre dois absorventes de laboratório na bancada de cirurgia. Então, quando o camundongo estiver respirando profunda e lentamente, coloque o animal no estágio cirúrgico em seu flanco e retroorbital. Injete a fita DExT, a haste Domine e a solução de anticorpo GR um.

Após a injeção, vire o mouse de costas com o nariz no cone de anestesia e use um barbeador elétrico para remover os pelos da superfície ventral e do membro posterior esquerdo do animal. Quando o pelo for removido, coloque um novo absorvente de laboratório no estágio cirúrgico para evitar a contaminação do cabelo e, em seguida, desinfete a superfície ventral do animal com lenços umedecidos com álcool e Betadine. Em seguida, por via subcutânea, injete a solução de atropina em um flanco do camundongo e, em seguida, use uma tesoura e um par de pinças para fazer uma incisão na linha média ventral de um centímetro através da pele e do peritônio.

Retire cuidadosamente três a quatro centímetros do intestino e identifique um ou vários tumores para imagem. Em seguida, posicione a alça do intestino contendo o tumor de interesse em cima de uma fenda de microscópio de vidro. Coloque algumas gotas de super cola ao longo do intestino para prendê-lo à lâmina depois que a cola secar por um minuto, use um marcador para desenhar uma linha na lâmina apontando para o tumor para facilitar sua localização durante a imagem.

Agora transfira o mouse cuidadosamente para o microscópio stage com o lado ventral voltado para baixo e o nariz no cone do nariz. Prenda a linha de anestesia com fita adesiva e reposicione a configuração de forma que o intestino fique no centro de uma das janelas deslizadas da tampa. Prenda suavemente a lâmina e prenda a sonda do oxímetro ao membro esquerdo do mouse para acompanhar suas frequências cardíaca e respiratória e os níveis de saturação de oxigênio arterial.

Em seguida, cubra o mouse com a manta de aquecimento para evitar hipotermia e diminuir a concentração de flúor ISO para imagens. Por fim, na janela de aquisição multidimensional, clique em adquirir para iniciar a aquisição. Quando a aquisição é concluída, o filme é gravado e salvo usando um software Mars.

Usando microscopia confocal de disco giratório, tecidos não tumorais e tumorais. No intestino delgado de um PC min, camundongos podem ser visualizados a partir da superfície serosa após injeção intravenosa de dextrana rodina fluorescente e um antígeno linfocitário, seis anticorpos conjugados complexos do locus G 6 47, vasos sanguíneos e células polimorfonucleares podem ser detectados, respectivamente. As placas de IPs que são agregações de tecido linfóide e cheias de células mieloides também podem ser facilmente observadas.

Os Crips do intestino delgado são cercados por vasos sanguíneos e células mieloides. O tecido tumoral é frequentemente mais vascularizado e mais infiltrado por células mieloides, e a estrutura dos Crips é menos bem organizada dependendo do tamanho do tumor. A expressão de ACTINA ECFP pela camada de músculo liso às vezes pode dificultar um foco nítido do epitélio intestinal, como pode ser observado nesta imagem, a dinâmica das células mieloides em tumores pode ser acompanhada em tempo real por algumas horas, como demonstrado neste filme, enquanto os neutrófilos positivos de G um circulam nos vasos sanguíneos e patrulham os tecidos.

Outras células mieloides, principalmente macrófagos, circundam os Crips e são menos modais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como visualizar a dinâmica das células mieloides em tumores intestinais em animais vivos.