Name: Geração de Enterobacter Sp. YSU auxotrofos Usando Transposon Mutagênese (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 31 s
Description: Aprenda a gerar mutantes auxotróficos de Enterobacter sp. YSU usando mutagênese por transposon. Este método permite identificar genes essenciais para crescimento em meio mínimo com glicose através de replica plating e sequenciamento.

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O autor gostaria de agradecer a todos da minha graduação Pesquisa Independente Estudantes e todos os meus alunos de pós-graduação em Fisiologia Microbiana que testaram as minhas ideias mutagênese transposon durante os semestres 2010-2014 primavera. Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Youngstown.

1. Eletroporação de células competentes 5,11 <ol><li> Dilui-se uma S / N cultura LB de Enterobacter sp. YSU 1/20 em 50 ml de meio LB fresco e crescer com agitação a 120 rpm e 30 ° C para uma DO (600 nm) entre 0,4 e 0,6. Opcionalmente, crescer outras estirpes de bactérias na sua temperatura de crescimento ideal. </li><li> Relaxar as células em gelo durante 5 min e centrifuga-se a 4 ° C e 7000 x g durante 5 min. </li><li> Descartar o sobrenadante, ressuspender as células em 50 ml de água gelada estéril e centrifugar a 4 ° C e 7000 x g durante 5 min. Repita este passo. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em um volume de água gelada igual ao volume de sedimento celular. Para armazenamento a longo prazo, lavar as células com 10 ml de gelado a 10% (v / v) de glicerol, ressuspender o sedimento em um volume igual de gelado a 10% (v / v) de glicerol, armazenar a -80 ° C, e descongelar em gelo antes da electroporação. </li><li> Adicionar 0,5 mL da transposome a 40 ul decélulas. A solução transposome disponível comercialmente é fornecido a uma concentração de ADN de 0,33 ug / ul. Embora seja recomendado 0,33 g, 0,165 ug de DNA é suficiente. </li><li> Coloque a mistura de células / transposome numa gelada, 0,2 mm, de cuvete de electroporação e toque na mistura para o fundo da cubeta. Chocar as células a 25 mF, 200 Ω, e 2,5 kV. Para garantir que as células permanecem refrigerados, armazenar as tinas de eletroporação em um freezer -20 ° C antes do uso. </li><li> Imediatamente, adicione 960 mL de caldo de super filtro esterilizados ideal com catabólito repressão (SOC) médio. Misture por pipetagem cima e para baixo e transferir as células para um estéril de 1,5 ml tubo de microcentrífuga. NOTA: As células começam a morrer após o choque, mas o sal no meio SOC lhes permite recuperar. Para economizar, não é necessário adicionar transposome ou para chocar as células de controlo negativo. Basta adicionar 960 ul de meio SOC estéril a ele. </li><li> Incubar as células a 30 ° C fou 45-60 min com agitação a 120 rpm. Isso proporciona um tempo para o transposome para recombinar-se com o genoma do hospedeiro e para as células para expressar resistência à canamicina. </li><li> Espalhe 100 ul de células numa placa de agar LB-kan e incubar a placa de O / N a 30 ° C. Armazenar a mistura de transformação remanescente no frigorífico a 4 ° C. Espalhe valores adicionais em uma data mais tarde para duas semanas após a eletroporação inicial, se necessário. </li></ol> 2. Gridding de transformantes <ol><li> Fita de uma grade para a tampa de um vazio de 100 x 15 mm placa de petri. Copie uma grade de &quot;Um Curso de curta duração em Genética bacteriana&quot; 12. </li><li> Desenhar uma linha na parte inferior de uma placa de agar LB-kan. Usar um pequeno pedaço de fita adesiva para o ancorar a tampa em grade de modo que a grade é visível através do ágar. Certifique-se de que a linha na parte inferior da placa está alinhada com o topo, centro da grade. Ancorando a placa com fita impede de correr, permitindo até mesmo gridding. A linha facilita a identificação colônia após réplica de placas. </li><li> Escolha um único transformante com um palito estéril e detectá-lo no centro de uma praça no grid. Basta tocar a colônia eo local. Não cavar o palito no agar. Para evitar a contaminação da chapa, lidar com o palito apenas em uma extremidade. </li><li> Manchar outro transformante em um quadrado adjacente como no passo 2.3. Quando o prato está cheio, ele incubar O / N a 30 ° C. Esta é a placa mestre. </li></ol> 3. réplica de placas para determinar a auxotrofo Fenótipo 12 <ol><li> Para cada placa que foi reticulada, fazer uma pilha de três placas de agar fresco numeradas de um a três: um para LB-kan, dois para M-9-kan e três para LB-kan. Secar as placas de cabeça para baixo, S / N, a 37 ° C antes da utilização. </li><li> Desenhar uma linha no topo de cada placa como no passo 2.2. </li><li> Limpe a ferramenta réplica de placas com 70% de etanol, coloque um quadrado de veludo estéril em cima do forro réplica paraol e apertar o quadrado de veludo para baixo. As mãos estão cheias de micróbios mesmo depois de lavá-las. Evitar a introdução de contaminantes micróbios pela manipulação da praça de veludo pelas bordas. </li><li> Alinhar a linha na placa principal com uma linha traçada sobre o grampo e colocar a placa na parte superior do quadrado veludo. Aplique uma leve pressão para transferir as bactérias da placa até a praça de veludo. Tenha cuidado para não manchar as bactérias. Remova a placa mestre da praça de veludo. </li><li> Alinhe a linha desenhada na placa o número um com a linha no suporte e coloque-o em cima da praça de veludo. Aplique uma leve pressão para transferir as bactérias a partir da praça de veludo para a chapa. Retire a placa de número um. </li><li> Descarte a praça de veludo para um copo de água e coloque um pano limpo, quadrado veludo estéril na ferramenta réplica de placas como no passo 3.3. Este passo evita o excesso de inoculação, que provoca o crescimento avanço e resultados falsos positivos. </li><li> Alinhe alinha na placa o número um com a linha do grampo e coloque-o em cima da nova praça de veludo. Aplique uma leve pressão para transferir as bactérias da placa número um para a praça de veludo. Retire a placa de número um. </li><li> Alinhe a linha desenhada na placa de número dois com a linha no suporte e coloque-o em cima da praça de veludo. Aplique uma leve pressão para transferir as bactérias a partir da praça de veludo para placa de número dois. Retire a placa de número dois. </li><li> Repita o passo 3.8 para três número da placa. A terceira placa é um controlo para a transferência completa da placa mestra para as outras duas placas. Descarte a praça de veludo para um copo de água. Para reutilizar as praças de veludo, autoclave o copo contendo os quadrados de veludo contaminados, lave-as, seque-as, enrole-os em papel alumínio e re-autoclave-los. </li><li> Incubar as placas a 30 ° CO / N. As colónias que crescem em ambas as placas de agar LB-kan mas não conseguem crescer em placas de M-9-kan são considerados (auxotrofos <stRong&gt; Figura 2). </li><li> Streak fora auxotrofos de placa número um em um prato fresco agar LB-kan, e incubar a placa a 30 ° CO / N. </li><li> Streak fora para isolamento três colônias da placa raia na etapa 3.11 em uma placa LB-kan fresco. Incubar a placa a 30 ° CO / N. Isto assegura que o mutante é bem isolado. Divida o prato em três partes e raia a cada colônia em uma seção. </li><li> Colônias spot das colônias estrias derivados de passo 3,12 em uma placa de LB-kan fresco para formar uma grade como nos passos 2,1-2,4. Cada mutante está sendo re-testadas em triplicata. </li><li> Replicar placa novamente como nos passos 3,1-3,10 para confirmar o fenótipo auxotrofo. </li></ol> 4. Gene Resgate <ol><li> Cresça um 3 ml O / N a cultura de um mutante isolado de colónias a partir do passo 3.13 em meio LB-kan líquido a 30 ° C. Purifica-se o ADN genómico a partir de 1 ml de cultura utilizando um kit de purificação de ADN genómico disponíveis comercialmente. </li><li> Configurar uma mistura de 0,025 LBFU CI endonuclease de restrição e 14 uL de 1 ug de ADN genómico ul / em uma reacção de 20 ul em gelo. Desde BFU CI corta o transposão em doze locais diferentes, pode ser mais eficiente a utilização de endonuclease de restrição, Bfa I ou Hae III, que corta o transposão em dois e três locais diferentes, respectivamente. </li><li> Incubar a reacção a 37 ° C durante 25 minutos e depois a 80 ° C durante 20 minutos para inactivar a enzima. Analise 3 ul de DNA parcialmente digerido num gel de agarose a 0,8% (Figura 3). Uma bem-sucedida de digestão resultados parciais em um esfregaço de acima de 10 kb para a parte inferior do gel. </li><li> Ligadura de 15 ul de ADN genómico digerido parcialmente usando 800 unidades de DNA ligase de T4 numa reacção de 500 ul. Incubar a reacção de O / N a 4 ° C. O grande volume de reacção maximiza a ligação de fragmentos individuais para si e minimiza as interacções entre dois ou mais fragmentos de ADN. </li><li> Precipitate o DNA ligado por adição de 50 ul de acetato de sódio 3M, pH 5,5, e 1 ml de etanol a 95% e incubando-se a -20 ° C durante 20 min. </li><li> Microcentrífuga o DNA a 4 ° C e 13.500 xg durante 10 min, lavar o sedimento com etanol a 70%, secá-lo num concentrador centrífugo de vácuo, e ressuspender-lo em 10 ul de água livre de nuclease. Alternativamente, o ADN pode ser seca ao ar à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Use 4 ul de DNA para transformar E. ressuspensas coli pir ECD100D tensão ou ECD100D pir116 por eletroporação como na seção 1. A origem de replicação γ R6K requer uma estirpe bacteriana com um gene pir replicar 6. Os resultados da estirpe pir em baixas plasmídeos de cópia, e a estirpe pir116 contém um gene mutante pir que resulta em plasmídeos de elevado número de cópias. Cada transformante contém um novo plasmídeo com o transposão e uma região do cromossoma interrompido (Figura 1E). </li><li> InoculComeram 5 ml de meio LB-kan com uma única colónia, que crescem O / N com agitação a 120 rpm e 37 ° C, e purifica-se DNA de plasmídeo a partir de toda a cultura D / N usando um kit comercial. </li><li> Digerir 14 ul do plasmídeo usando a endonuclease de restrição Xho I. Certifique-se o volume final da reacção é de 20 uL. Este enzima reconhece um local no meio do transposão na extremidade 5 &#39;do gene de resistência à canamicina. Analise 10 ul do plasmídeo não digerido e digerido num gel de agarose a 0,8% (Figura 3). O plasmídeo consiste no DNA do hospedeiro transposão 2 kb de flanqueamento mais. </li></ol> Sequenciamento 5. DNA <ol><li> Sequenciar o plasmídeo utilizando um kit disponível comercialmente sequenciação, os iniciadores que são homólogas a cada uma das extremidades do transposão, e um sistema de análise de sequenciação capilar. Alternativamente, o plasmídeo pode ser enviado para uma instituição fora para o seqüenciamento. </li><li> Use o padrão de peso molecular (escada 1 kb) emo gel para estimar o tamanho do plasmídeo. Em seguida, estimar o número de nanogramas (ng) de plasmídeo que é exigido por 50 fmol. </li><li> Medir a concentração do ADN do plasmídeo utilizando um espectrofotómetro a comprimentos de onda de 260 nm (A 260) e 280 nm (A280). Assegurar o comprimento do percurso da luz através da cuvete é de 1 cm. Determinar a concentração multiplicando-se a absorvância a 260 nm por 50 ng / ul. DNA de plasmídeo alta qualidade terá um A 260 / A 280 rácio entre 1,8 e 2,0. </li><li> O volume de ADN necessário para cada reacção de sequenciação é o número de ng necessária para 50 fmol dividida pela concentração do plasmídeo. Misturar o volume do plasmídeo requerido com água para levar o volume total até 10 ml. </li><li> Aquece-se a mistura de ADN de plasmídeo / água a 96 ° C durante 1 min e em seguida arrefecer-lo para a TA. </li><li> Adicionar 8 ul de mistura principal a partir do kit de sequenciação e 2 ul de 1,6 uM de um dos iniciadores de sequenciação. </li><li> Folbaixo o protocolo do kit de sequenciamento para o programa do termociclador e limpeza reação. </li><li> Analise cada amostra, utilizando um sistema de análise de DNA capilar. </li><li> Use um pacote de software disponível no mercado para ver a seqüência de DNA. Busca para a sequência &quot;, 5&#39;-GAGACAG-3 &#39;&quot;, que é o último 7 pb do transposão (Figura 4). A sequência antes da extremidade 5 &#39;deste segmento de 7 pb pertence ao transposão. A sequência após a extremidade 3 &#39;deste segmento de 7 pb pertence ao gene interrompido. </li><li> Determinar a possível função do gene interrompido usando o Básico Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8. Use o seguinte link: <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch" target="_b;ank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch</a> . Cole a sequência da interrupçãogene ed na caixa de consulta, selecione &quot;outros&quot; sob o banco de dados e clique em &quot;BLAST&quot; na parte inferior da página. Quando o resultado aparece, role a página para ver os resultados do alinhamento (Figura 5). </li></ol>

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O autor não tem nada a divulgar.

Mutagênese Transposon usando um transposome é uma ferramenta eficiente para a geração de auxotrofos em Enterobacter sp. YSU e outros tipos de bactérias Gram negativas e Gram positivas 3,4. O processo foi iniciado pela introdução do Tn 5 transposome -derived no hospedeiro por electroporação. Para identificar as colónias com inserções, a estirpe não transformada alvo teve de ser sensíveis à canamicina, de modo a seleccionar para o marcador de resistência transportado pelo transposon. Alguns ho...

Bactérias prototróficas crescer em M-9 sais de meio mínimo contendo glucose (meio M-9), a conversão de glicose através centrais vias de metabolismo de carbono para gerar precursores, tais como aminoácidos, ácidos nucleicos e vitaminas, para a biossíntese 1. M-9 meio contém cloreto de amónio como uma fonte de azoto, de sódio e fosfato de potássio como tampão e fonte de fósforo, sulfato de magnésio como fonte de enxofre e de glucose como fonte de carbono e energia. Luria-Bertani (LB) é rica em aminoácidos a partir de triptona e em vitaminas e factores de crescimento a partir de extracto de levedura. Ele suporta o crescimento de auxotrofos que não podem sintetizar aminoácidos, vitaminas e outros factores de crescimento necessários para o crescimento em meio M-9. Assim, prototrofos vai crescer em LB e meio M-9, ao passo que os auxotrofos vai crescer em meio LB, mas não em meio M-9. Com a introdução de mutações em uma população de bactérias e prototrófica identificação de genes mutantes que causam fenótipos auxotróficas, é possible para se obter uma melhor compreensão do metabolismo de uma estirpe bacteriana. Mutagénese de transposões pode ser utilizado para identificar muitos dos genes necessários para o crescimento em glicose em meio M-9. Os transposões inserir-se aleatoriamente no genoma do hospedeiro 2. Ao detectar transformantes transposões em placas de agar LB e plaqueamento de réplicas em placas de agar de meio M-9, é possível para o rastreio de auxotrofos. Genes interrompidos são identificados por meio de resgate gene. Este estudo utiliza um Tn comercialmente disponível 5 -derived transposome que é fornecido como uma solução de um segmento de DNA transposon linear misturado com proteína transposase. O segmento de DNA não possui um gene de transposase, mas contém um gene de resistência a canamicina, uma origem de replicação R6K γ e dois motivos de mosaico que são sequências de ADN para a transposase de ligação em cada extremidade do segmento de 3,4. Uma vez que a proteína transposase é adicionado directamente ao ADN, o segmento de ADN sozinhoé definida como o transposão, e o complexo de proteína de ADN / transposase é definida como a transposome. O transposome é transformada por electroporação 5 num hospedeiro sensível a canamicina (Figura 1A). As colónias que crescem em placas de agar LB contendo canamicina (LB-kan) têm inserções de transposões (Figura 1B), e de réplica banhado transformantes que não conseguem crescer em M-9 placas de agar com meio contendo canamicina (M-9-kan) são auxotróficos (Figire 1C). O ADN genómico de um mutante é purificado e parcialmente digerido com a base de 4-endonuclease de restrição de corte, BFU CI (Figura 1D). O DNA ligado é transformado numa estirpe de Escherichia coli (E. coli) que contém o gene pir (Figura 1E). Este gene permite que o novo plasmídeo contendo o transposão e região flanqueadora cromossómico do hospedeiro para se replicar em E. coli 6. O gene de resistência à canamicina serve como quantoelectable marcador para o novo plasmídeo. Por último, a sequenciação utilizando iniciadores complementares a cada uma das extremidades do transposão e Básico Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8 análise da sequência resultante são utilizados para determinar a identidade dos genes interrompidos. Esta estratégia de mutagênese transposome oferece três vantagens 3. Em primeiro lugar, uma vez que a proteína de transposase está ligado directamente ao transposão, a inserção não depende da expressão do gene de transposase dentro do hospedeiro. Uma vez que o transposão incorpora-se no genoma do hospedeiro, a transposase é degradada, impedindo o movimento adicional do transposão. No entanto, o movimento adicional não pode ser evitado se o host possui um Tn 5 elemento transposicional endógena. Em segundo lugar, a introdução de transposome por electroporação torna possível utilizá-lo em uma ampla variedade de hospedeiros. Também elimina a necessidade de introduzir o transposão por conjugação bacteriana ou por viinfecção ral. Ambos os processos requerem a susceptibilidade do hospedeiro. Em terceiro lugar, a inclusão do gene de resistência à canamicina e a origem de replicação R6K γ na transposome faz com que seja mais fácil para identificar o gene interrompido. Regiões de transposões-interrompido pode ser armazenado e sequenciados como plasmídeos, eliminando a necessidade de se utilizar a reacção em cadeia inversa da polimerase (PCR) para a identificação de genes. O protocolo apresentado neste vídeo descreve cada passo para transposon mutagênese de Enterobacter sp. YSU 9 usando um transposome a partir da sua introdução nas células bacterianas para a identificação do gene putativo la interrompido. Além de protocolos previamente publicados 3,4,10, métodos detalhados para usar réplica de placas para rastrear auxotrofos são apresentados. Esta técnica de mutagénese podem ser usados ​​para a investigação de outros fenótipos, tais como antibióticos e resistências de metal, em diferentes tipos de bactérias, para identifying o número mínimo de genes necessários para o crescimento sob condições de cultura definidas em estudos de biologia sintética, ou para o ensino de um componente de um laboratório de genética ou curso de fisiologia microbiana.

<table><tbody><tr><td>EZ-Tn5 R6K&gamma; ori/KAN-2 Tnp Transposome Kit</td><td>Epicentro (Illumina)</td><td>TSM08KR</td><td></td></tr><tr><td>EC100D pir+ Epicentro de E. coli eletrocompetente</td><td>(Illumina)</td><td>ECP09500</td><td>Capaz de replicar plasmídeos com uma origem de replicação R6K&gamma; em um baixo número de cópias</td></tr><tr><td>EC100D pir-116 Epicentro de E. coli eletrocompetente</td><td>(Illumina)</td><td>EC6P095H</td><td>Capaz de replicar plasmídeos com um R6K&gamma; origem de replicação em um alto número</td></tr><tr><td>de cópias 5X M-9 Sais</td><td>Thermo Fisher</td><td>DF048517</td><td></td></tr><tr><td>Lennox LB Caldo</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP1427-2</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J637-1KG</td><td>Meio sólido continha 1,6% (p/v) de ágar</td></tr><tr><td>Sulfato de Canamicina&nbsp;</td><td>Amresco, Inc.</td><td>0408-25G</td><td>Quando necessário, a mídia continha 50 &mu; g / ml de sulfato de canamicina</td></tr><tr><td>D-Glicose Monohidratada</td><td>Amresco, Inc.</td><td>0643-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J850-500G</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Amresco, Inc.</td><td>J859-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Amresco, Inc.</td><td>X190-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Caldo Super Ótimo com meio</td><td></td><td></td> de Repressão Catabólica (SOC) <td>0,5% (p/v) extrato de levedura, 2% (p/v) triptona, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 e 20 mM Glicose</td></tr><tr><td>BfuC I</td><td>NEB</td><td>R0636S</td><td>Digestão parcial do DNA genômico</td></tr><tr><td>Xho I</td><td>NEB</td><td>R0146S</td><td>Digestão de plasmídeo</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Água Livre de Nuclease</td><td>Amresco, Inc.</td><td>E476-1L</td><td>Para dissolver DNA precipitado e reações de endonuclease de restrição</td></tr><tr><td>GenomeLab DTCS - Kit de Início Rápido</td><td>Beckman Coulter</td><td>608120</td><td>Sequenciamento de DNA</td></tr><tr><td>Wizard Kit de Purificação de DNA Genômico</td><td>Promega</td><td>A1120A</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus SV Minipreps Sistema de Purificação de DNA</td><td>Promega</td><td>A1460</td><td>Purificação de plasmídeo</td></tr><tr><td>Réplica de Bloco de Revestimento</td><td>Thermo Fisher</td><td>09-718-1</td><td></td></tr><tr><td>Velveteen Squares</td><td>Thermo Fisher</td><td>09-718-2</td><td>Réplica de chapeamento</td></tr><tr><td>PetriStickers</td><td>Diversified Biotech</td><td>PSTK-1100</td><td>Grade para réplica de chapeamento</td></tr><tr><td>de placas de Petri</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser II</td><td>BioRad</td><td></td><td>Electroporation Electroporation</td></tr><tr><td>Cuvettes &ndash; 2 mm</td><td>BioExpress</td><td>E-5010-2</td><td></td></tr><tr><td>CentriVap DNA Vacuum Concentrator</td><td>Labconco</td><td>7970010</td><td>Secagem de DNA</td></tr><tr><td>CEQ 2000XL Sistema de Análise de DNA</td><td>Beckman Coulter</td><td></td> Vetor <td>de sequenciamento de DNA</td></tr><tr><td>NTI Advance 11.5.0</td><td>Life Technologies</td><td>12605099</td><td>análise de sequência de DNA</td></tr></tbody></table>

geração de enterobacter sp. ysu auxotrofos usando transposon mutagênese

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Bactérias prototróficas crescer em M-9 sais de meio mínimo suplementado com glucose (meio M-9), que é usado como uma fonte de carbono e energia. Auxotrofos pode ser gerado usando um transposome. A disponível comercialmente, Tn 5 transposome -derived utilizado neste protocolo consiste de um segmento linear de DNA contendo uma origem de replicação R6K γ, um gene de resistência à canamicina e dois sequência termina mosaico, que servem como sítios de ligação de transposase. O transposome, fornecida como um complexo de proteína de ADN / transposase, é introduzida por electroporação na estirpe prototrófica, Enterobacter sp. YSU, e incorpora-se aleatoriamente no genoma deste hospedeiro. Os transformantes são plaqueadas em réplica Luria-Bertani placas de agar contendo canamicina (LB-kan) e em placas de agar M-9 médias contendo canamicina (M-9-kan). Os transformantes que crescem em placas de LB-kan mas não em placas de M-9-kan são considerados auxotrofos. Genómico purificadoADN a partir de um auxotrofo é parcialmente digerido, ligados e transformados em uma pir + Escherichia coli (E. coli) estirpe. A origem de replicação R6Kγ permite que o plasmídeo se replique em pir + E. estirpes de E. coli, e o marcador de resistência à canamicina para selecção permite plasmídeo. Cada transformante possui um novo plasmídeo contendo o transposão ladeada pela região cromossómica interrompida. Seqüenciamento Sanger eo Básico Local Alignment Search Tool (BLAST) sugerem uma identidade putativo do gene interrompido. Existem três vantagens de se utilizar esta estratégia mutagênese transposome. Em primeiro lugar, que não se baseia na expressão de um gene de transposase pelo hospedeiro. Em segundo lugar, o transposome é introduzido no hospedeiro-alvo por electroporação, em vez de por conjugação ou por transdução e, por conseguinte, é mais eficiente. Em terceiro lugar, a origem de replicação R6Kγ faz com que seja fácil de identificar o g mutadoeno que é parcialmente recuperada num plasmídeo recombinante. Esta técnica pode ser utilizada para investigar os genes envolvidos em outras características de Enterobacter sp. YSU ou de uma variedade mais ampla de estirpes bacterianas.

Transformação de Enterobacter sp. YSU por electroporação com o genoma transposome iniciado inserção aleatória no genoma do hospedeiro (Figura 1A; B). A eletroporação sucesso rendeu vários milhares de transformantes que cresceram em placas LB-kan. Para obter 300-400, colônias por placa bem espaçados, a quantidade de transformação mistura propagação em cada placa de ágar LB-kan foi otimizado. Cada transformante continha pelo menos uma inserção transposon, mas não estava claro se um gene important...

Enterobacter sp. YSU cresce em meio de sais mínimos de glucose. Auxotrofos são geradas através da transformação com um transposome qual se insere aleatoriamente no genoma do hospedeiro. Os mutantes são encontrados pela réplica de placas a partir de meio complexo para meio mínimo. Genes interrompidos são identificados por socorro e seqüenciamento genético.

Geração de Enterobacter Sp. YSU auxotrofos Usando Transposon Mutagênese

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

O objetivo geral do experimento a seguir é produzir TROs de uma cepa bacteriana do tipo selvagem que cresce em meio de sais mínimos suplementados com glicose. Isso é conseguido transformando uma zona de transpo na cepa hospedeira do tipo selvagem para obter uma população de bactérias resistentes à micina de canna com transposição aleatória em inserções. Em seguida, os transformantes são rastreados por réplica de chapeamento, que identifica TROs que crescem em meio rico, mas não crescem em sais mínimos, meio suplementado com glicose.Em seguida, genômico, o DNA do mutante é digerido, ligado e transformado em e coli para obter um plasmídeo contendo o transposon flanqueado em cada extremidade por segmentos do gene interrompido. São obtidos resultados que mostram a identidade putativa do gene interrompido com base no sequenciamento de DNA e na análise básica da ferramenta de pesquisa de alinhamento local. O transposon usado nesta técnica tem uma origem de replicação, um gene resistente à canamicina e extremidades em mosaico.Para transpor a ligação às proteínas. Falta o gene da proteína transposta e, portanto, temos que adicionar esse gene transposto com o fragmento de DNA do transposon e, em seguida, o complexo entre o DNA transposto e a proteína é eletroporado para o hospedeiro. As principais vantagens da eletroporação são a eliminação da necessidade de transdução ou conjugação.A falta de um gene transposto geralmente produz inserções estáveis e a presença de uma origem de replicação e um gene de resistência CIN permitem uma fácil identificação do gene mutado, que é recuperado como um plasmídeo recombinante. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da fisiologia microbiana, como a identificação de genes necessários para a biossíntese de aminoácidos, ácidos nucléicos e vitaminas. Tive a ideia para este método pela primeira vez quando estava procurando genes de resistência a metais em espécies de enterobacter YSU e decidi incorporá-lo a um laboratório de fisiologia microbiana que estava desenvolvendo para células competentes eletroporadas usando uma cultura noturna de espécies de enterobacter.YSU prepara uma diluição de um a 20 em meio LB fresco e incuba a 30 graus Celsius e 120 RPM a um OD 600 entre 0,4 e 0,6. Quando as células atingirem a densidade adequada, resfrie-as no gelo por cinco minutos e depois centrifugue a quatro graus Celsius e 7.000 Gs por cinco minutos. Descarte o sobrenadante e use um volume igual de água gelada para Resus.Suspender as células centrifugar a quatro graus Celsius e 7 000 Gs durante cinco minutos. Depois de repetir a lavagem, rejeitar o sobrenadante e, com água gelada, suspender as células num volume igual ao volume do sedimento celular. Em seguida, adicione 0,5 microlitros da zona de transporte a 40 microlitros de células.Em seguida, coloque a mistura da zona de transporte de células em um veterinário de eletroporação gelada e bata a mistura no fundo do Q Vet para chocar as células a 25 micro phs, 200 ohms e 2.5 quilovolts. Adicione imediatamente 960 microlitros de meio SOC esterilizado por filtro misturado pipetando para cima e para baixo antes de transferir as células para um tubo de microfuge estéril de 1,5 mililitro. Incube as células a 30 graus Celsius e 120 RPM por 45 a 60 minutos.Em seguida, espalhe 100 microlitros de células em uma placa de ágar LB antes de incubar a placa durante a noite a 30 graus Celsius para grelhar os Transformantes. Cole uma grade na tampa de uma placa de Petri vazia de 100 por 15 milímetros. Desenhe uma linha na parte inferior de uma placa de ágar LB e use um pequeno pedaço de fita adesiva para ancorá-la na tampa gradeada de modo que a grade fique visível através da broca com um palito estéril.Escolha um único transformante e localize-o no centro de um quadrado na grade, localize outro transformador em um quadrado adjacente e continue até que a placa esteja cheia. Em seguida, incube-o durante a noite a 30 graus Celsius. Esta é a placa mestra para cada placa que foi gradeada.Faça uma pilha de três placas de broca frescas numeradas de um a três. O número um para LB pode ser o número dois para M nove pode. E o número três para LB pode secar as placas de cabeça para baixo durante a noite a 37 graus Celsius antes de usar.Depois de desenhar uma linha na parte superior de cada placa, conforme demonstrado anteriormente, use etanol a 70% para limpar a réplica da ferramenta de revestimento e coloque um quadrado de veltin estéril em cima dela antes de prender o quadrado de veltin para baixo. Em seguida, alinhe a linha na placa mestre com uma linha desenhada no clamp e coloque a placa em cima do quadrado veltin. Aplique uma leve pressão para transferir as bactérias da placa para o quadrado veltin.Em seguida, alinhe a linha desenhada na placa número um com a linha no grampo e coloque-a em cima do quadrado veltin. Aplique uma leve pressão para transferir as bactérias do quadrado do veltin para a placa. Remova a placa número um.Descarte o quadrado de veludo adolescente em um copo de água e coloque um quadrado de veludo estéril limpo na réplica da ferramenta de revestimento. Como antes, alinhe a linha da placa número um com a linha do grampo e coloque-a em cima do novo quadrado de veludo. Aplique uma leve pressão para transferir as bactérias da placa número um para o quadrado de veludo.Remova a placa número um, alinhe a linha desenhada na placa número dois com uma linha no grampo e coloque-a em cima do quadrado de veludo. Aplique uma leve pressão para transferir as bactérias do quadrado de veludo para a placa número dois, remova a placa número dois após repetir o processo para a placa número três, incube as placas durante a noite a 30 graus Celsius. As colônias que crescem em ambas as placas LB, mas não crescem em M nove placas, são consideradas tesouros.Escolha TROs da placa número um e coloque em uma nova lata de LB. Depois de incubar durante a noite, escolha três colônias da placa de estrias e coloque-as em uma nova placa de lata LB no dia seguinte. Localize as colônias da placa recém-listrada em uma placa de grade de lata LB e use esta placa para repetir a réplica do revestimento conforme demonstrado.Realize o resgate do gene. Use uma colônia mutante isolada para cultivar uma libra de três mililitros. Pode cultura durante a noite a 30 graus Celsius.Em seguida, use um kit de purificação de DNA genômico disponível comercialmente para purificar o DNA de um mililitro da cultura a 0,025 unidades de BFUC, uma endonuclease de restrição a 14 microlitros de um micrograma por microlitro de DNA genômico em uma reação de 20 microlitros no gelo. Em seguida, incube a reação a 37 graus Celsius por 25 minutos antes de transferi-la para 80 graus Celsius por 20 minutos. Para inativar a enzima, analise três microlitros do DNA parcialmente digerido em um gel 0,8% AROS.Em seguida, adicione 800 unidades de T quatro DNA ligase a 15 microlitros de DNA genômico parcialmente digerido em uma reação de 500 microlitros e incube a reação a quatro graus Celsius durante a noite no dia seguinte. Precipite o DNA ligado adicionando 50 microlitros de acetato de sódio de três molares pH 5,5 e um mililitro de etanol a 95% incube a 20 graus Celsius negativos por 20 minutos. Micro fuga do DNA a quatro graus Celsius e 13.500 Gs por 10 minutos.Despeje os locais de supernat, sete etanol 70% para lavar o pellet. Seque-o em um concentrador centrífugo a vácuo e use 10 microlitros de água livre de nuclease. Para ressuspender o DNA Use quatro microlitros de DNA ressuspenso para transformar por cepa de eletroporação e coli, ECD 100 DPIR ou ECD 100 DPIR um 16 inocular cinco mililitros de LB pode meio com uma única colônia.Cultive-o a 37 graus Celsius e 120 RPM durante a noite. No dia seguinte, depois de purificar o DNA de toda a cultura, use Joe One para digerir 14 microlitros do plasmídeo. Analise 10 microlitros do plasmídeo não digerido e digerido em um gel de agarro a 0,8%.Após o sequenciamento do plasmídeo, procure a sequência cinco primos GA, G-A-C-A-G três primos, que são os últimos sete pares de bases da transposição e serão seguidos pela sequência do gene interrompido. Use blast para determinar a possível função do gene interrompido. Uma eletroporação bem-sucedida rendeu vários milhares de transformantes, cada um com pelo menos uma transposição na inserção nesta figura.Os quadrados pretos mostram duas colônias que cresceram na placa de lata LB, mas não na placa média mínima M nove. Esses TROs provavelmente continham interrupções em genes envolvidos na síntese de um aminoácido, um ácido nucléico ou uma vitamina, que são todos encontrados em lb, mas não em M nove, meio mínimo. As outras 86 colônias não tiveram uma interrupção em um gene necessário para o crescimento em M nove.Meio mínimo como visto aqui, o DNA genômico parcialmente digerido de um TRO isolado vai de mais de 10 quilobases a menos de 0,5 quilobases de tamanho. O plasmídeo resgatado consiste no transposon de duas quilobases mais o DNA do hospedeiro flanqueador. Esta figura mostra um resultado de explosão para um plasmídeo que foi isolado de um tro.A sequência interrompida é semelhante a um gene enterobacter cloy para a eat mutase, que está envolvida na biossíntese de L tirosina, L fenilalanina e L triptofano devido a várias etapas de crescimento durante a noite. Esta técnica pode ser concluída em 10 ou 11 dias se realizada corretamente. Durante a réplica, é importante lembrar de não manchar as placas, e você pode evitar isso usando placas secas e não movendo as placas depois de colocadas no quadrado de veltin.Após este procedimento, outros métodos, como experimentos de clonagem ou complementação, podem ser realizados para verificar a função do gene identificado. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar TROs usando a mutagênese do transposon e como identificar provisoriamente os genes mutantes.

generation-enterobacter-sp-ysu-auxotrophs-using-transposon

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Sistemáticas e em grande escala genético sintético telas (gene-gene ou epistasia) interação pode ser usado para explorar a redundância genética e via de cross-talk. Aqui, descrevemos um alto rendimento quantitativo tecnologia de rastreamento genético sintético matriz, denominada eSGA que desenvolvemos para a elucidação de relações epistáticos e explorar redes de interação genéticos...

Mapeamento bacterianas redes funcionais e vias<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Usando sintéticos matrizes genéticas

Fonte: Kazi, M. I., et. al., Gerando bibliotecas de inserção de transposons em bactérias Gram-negativas para sequenciamento de alto rendimento. J. Vis. (2020)Este vídeo demonstra a seleção, quantificação e preservação de bactérias receptoras Gram-negativas portadoras de inserções de transposons com base na resistência à canamicina.

Isolamento de bactérias Gram-negativas com inserções de transposons genômicos

Aqui nós descrevemos um protocolo com o marinheiro mutagênese mini-himar1 mediada por transposon para gerar uma biblioteca de mutantes de inserção de alta densidade para a tela, isolar e identificar novos reguladores de alginato no protótipo PAO1 cepa Pseudomonas aeruginosa.

Identificação de novos genes associados com alginato de Produção em<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Usando Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mutagênese Mariner Transposon mediada

Coxiella burnetii é uma bactéria intracelular obrigatório Gram-negativa responsável pela febre Q doença zoonótica. Aqui, descrevemos métodos para a geração de mutantes por transposões Coxiella fluorescente, bem como a identificação e análise automatizada dos internalização, replicação e citotóxicos fenótipos resultantes.

Geração e Multi-fenotípica rastreio de alto teor de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; mutantes por transposões

Aqui, o poder de uma inserção aleatória de um elemento de DNA não-codificante, mediada por transposon foi usado para resolver a sua posição ideal cromossômica.

Determinação da localização cromossômica ideal para um elemento de DNA em Escherichia coli usando uma nova abordagem mediada por Transposon

Apresentado aqui é um método simples para criar uma biblioteca de inserção alta densidade transposon em Escherichia coli ou Shigella flexneri usando conjugação bacteriana. Este protocolo permite a criação de uma coleção de centenas de milhares de mutantes exclusivos nas bactérias através da inserção de genômica aleatória de um transposon.

Criação de um denso Transposon inserção biblioteca usando bacteriana conjugação em entérobactérienne cepas tais como Escherichia Coli ou Shigella flexneri

Aqui descrevemos uma técnica que combina o mutagenesis transposon com sequenciamento de alto rendimento para identificar e quantificar os mutantes leptospiral de transposon em tecidos após um desafio de hamsters. Este protocolo pode ser usado para mutantes de tela para a sobrevivência e disseminação em animais e também pode ser aplicado aos estudos em vitro .

Elevado-throughput sequenciamento paralela à medida Fitness de Leptospira interrogans Transposon inserção mutantes durante a Golden sírio Hamster infecção

Pseudomonas aeruginosa infecção causa morbidade significativa em hosts vulneráveis. A biblioteca de mutantes de inserção transposon não redundante da estirpe de p. aeruginosa PA14, designado como PA14NR definida, facilita a análise da funcionalidade do gene em inúmeros processos. Apresentado aqui é um protocolo para gerar cópias de alta qualidade da biblioteca mutante PA14NR definido.

Replicação do requisitado, biblioteca não redundante de estirpe Pseudomonas aeruginosa PA14 Transposon mutantes de inserção

O hemizygosity recíproco através de arranjar em seqüência (RH-Seq) é um método novo poderoso para mapear a base genética de uma diferença do traço entre a espécie. As associações de hemizygotes são geradas pela mutagenese do transposon e sua aptidão é controlada com o crescimento competitivo usando o sequenciamento elevado-ao longo. A análise dos dados resultantes identifica genes subjacentes à característica.

Mapeamento genético de diferenças de termotolerância entre espécies de levedura Saccharomyces via análise de Hemizygosidade recíproca em todo o genoma

Descrevemos um método para gerar bibliotecas mutantes transposon saturadas em bactérias Gram-negativas e preparação subsequente de bibliotecas de amplicon de DNA para sequenciamento de alto rendimento. Como exemplo, focamos no patógeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii,mas este protocolo é agradável para uma ampla gama de organismos Gram-negativos.

Gerando Bibliotecas de Inserção Transposon em bactérias gram-negativas para sequenciamento de alto rendimento

Aprenda a gerar mutantes auxotróficos de Enterobacter sp. YSU usando mutagênese por transposon. Este método permite identificar genes essenciais para crescimento em meio mínimo com glicose através de replica plating e sequenciamento.

Geração de Enterobacter Sp. YSU auxotrofos Usando Transposon Mutagênese

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