Geração de Enterobacter Sp. YSU auxotrofos Usando Transposon Mutagênese

O objetivo geral do experimento a seguir é produzir TROs de uma cepa bacteriana do tipo selvagem que cresce em meio de sais mínimos suplementados com glicose. Isso é conseguido transformando uma zona de transpo na cepa hospedeira do tipo selvagem para obter uma população de bactérias resistentes à micina de canna com transposição aleatória em inserções. Em seguida, os transformantes são rastreados por réplica de chapeamento, que identifica TROs que crescem em meio rico, mas não crescem em sais mínimos, meio suplementado com glicose.

Em seguida, genômico, o DNA do mutante é digerido, ligado e transformado em e coli para obter um plasmídeo contendo o transposon flanqueado em cada extremidade por segmentos do gene interrompido. São obtidos resultados que mostram a identidade putativa do gene interrompido com base no sequenciamento de DNA e na análise básica da ferramenta de pesquisa de alinhamento local. O transposon usado nesta técnica tem uma origem de replicação, um gene resistente à canamicina e extremidades em mosaico.

Para transpor a ligação às proteínas. Falta o gene da proteína transposta e, portanto, temos que adicionar esse gene transposto com o fragmento de DNA do transposon e, em seguida, o complexo entre o DNA transposto e a proteína é eletroporado para o hospedeiro. As principais vantagens da eletroporação são a eliminação da necessidade de transdução ou conjugação.

A falta de um gene transposto geralmente produz inserções estáveis e a presença de uma origem de replicação e um gene de resistência CIN permitem uma fácil identificação do gene mutado, que é recuperado como um plasmídeo recombinante. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da fisiologia microbiana, como a identificação de genes necessários para a biossíntese de aminoácidos, ácidos nucléicos e vitaminas. Tive a ideia para este método pela primeira vez quando estava procurando genes de resistência a metais em espécies de enterobacter YSU e decidi incorporá-lo a um laboratório de fisiologia microbiana que estava desenvolvendo para células competentes eletroporadas usando uma cultura noturna de espécies de enterobacter.

YSU prepara uma diluição de um a 20 em meio LB fresco e incuba a 30 graus Celsius e 120 RPM a um OD 600 entre 0,4 e 0,6. Quando as células atingirem a densidade adequada, resfrie-as no gelo por cinco minutos e depois centrifugue a quatro graus Celsius e 7.000 Gs por cinco minutos. Descarte o sobrenadante e use um volume igual de água gelada para Resus.

Suspender as células centrifugar a quatro graus Celsius e 7 000 Gs durante cinco minutos. Depois de repetir a lavagem, rejeitar o sobrenadante e, com água gelada, suspender as células num volume igual ao volume do sedimento celular. Em seguida, adicione 0,5 microlitros da zona de transporte a 40 microlitros de células.

Em seguida, coloque a mistura da zona de transporte de células em um veterinário de eletroporação gelada e bata a mistura no fundo do Q Vet para chocar as células a 25 micro phs, 200 ohms e 2.5 quilovolts. Adicione imediatamente 960 microlitros de meio SOC esterilizado por filtro misturado pipetando para cima e para baixo antes de transferir as células para um tubo de microfuge estéril de 1,5 mililitro. Incube as células a 30 graus Celsius e 120 RPM por 45 a 60 minutos.

Em seguida, espalhe 100 microlitros de células em uma placa de ágar LB antes de incubar a placa durante a noite a 30 graus Celsius para grelhar os Transformantes. Cole uma grade na tampa de uma placa de Petri vazia de 100 por 15 milímetros. Desenhe uma linha na parte inferior de uma placa de ágar LB e use um pequeno pedaço de fita adesiva para ancorá-la na tampa gradeada de modo que a grade fique visível através da broca com um palito estéril.

Escolha um único transformante e localize-o no centro de um quadrado na grade, localize outro transformador em um quadrado adjacente e continue até que a placa esteja cheia. Em seguida, incube-o durante a noite a 30 graus Celsius. Esta é a placa mestra para cada placa que foi gradeada.

Faça uma pilha de três placas de broca frescas numeradas de um a três. O número um para LB pode ser o número dois para M nove pode. E o número três para LB pode secar as placas de cabeça para baixo durante a noite a 37 graus Celsius antes de usar.

Depois de desenhar uma linha na parte superior de cada placa, conforme demonstrado anteriormente, use etanol a 70% para limpar a réplica da ferramenta de revestimento e coloque um quadrado de veltin estéril em cima dela antes de prender o quadrado de veltin para baixo. Em seguida, alinhe a linha na placa mestre com uma linha desenhada no clamp e coloque a placa em cima do quadrado veltin. Aplique uma leve pressão para transferir as bactérias da placa para o quadrado veltin.

Em seguida, alinhe a linha desenhada na placa número um com a linha no grampo e coloque-a em cima do quadrado veltin. Aplique uma leve pressão para transferir as bactérias do quadrado do veltin para a placa. Remova a placa número um.

Descarte o quadrado de veludo adolescente em um copo de água e coloque um quadrado de veludo estéril limpo na réplica da ferramenta de revestimento. Como antes, alinhe a linha da placa número um com a linha do grampo e coloque-a em cima do novo quadrado de veludo. Aplique uma leve pressão para transferir as bactérias da placa número um para o quadrado de veludo.

Remova a placa número um, alinhe a linha desenhada na placa número dois com uma linha no grampo e coloque-a em cima do quadrado de veludo. Aplique uma leve pressão para transferir as bactérias do quadrado de veludo para a placa número dois, remova a placa número dois após repetir o processo para a placa número três, incube as placas durante a noite a 30 graus Celsius. As colônias que crescem em ambas as placas LB, mas não crescem em M nove placas, são consideradas tesouros.

Escolha TROs da placa número um e coloque em uma nova lata de LB. Depois de incubar durante a noite, escolha três colônias da placa de estrias e coloque-as em uma nova placa de lata LB no dia seguinte. Localize as colônias da placa recém-listrada em uma placa de grade de lata LB e use esta placa para repetir a réplica do revestimento conforme demonstrado.

Realize o resgate do gene. Use uma colônia mutante isolada para cultivar uma libra de três mililitros. Pode cultura durante a noite a 30 graus Celsius.

Em seguida, use um kit de purificação de DNA genômico disponível comercialmente para purificar o DNA de um mililitro da cultura a 0,025 unidades de BFUC, uma endonuclease de restrição a 14 microlitros de um micrograma por microlitro de DNA genômico em uma reação de 20 microlitros no gelo. Em seguida, incube a reação a 37 graus Celsius por 25 minutos antes de transferi-la para 80 graus Celsius por 20 minutos. Para inativar a enzima, analise três microlitros do DNA parcialmente digerido em um gel 0,8% AROS.

Em seguida, adicione 800 unidades de T quatro DNA ligase a 15 microlitros de DNA genômico parcialmente digerido em uma reação de 500 microlitros e incube a reação a quatro graus Celsius durante a noite no dia seguinte. Precipite o DNA ligado adicionando 50 microlitros de acetato de sódio de três molares pH 5,5 e um mililitro de etanol a 95% incube a 20 graus Celsius negativos por 20 minutos. Micro fuga do DNA a quatro graus Celsius e 13.500 Gs por 10 minutos.

Despeje os locais de supernat, sete etanol 70% para lavar o pellet. Seque-o em um concentrador centrífugo a vácuo e use 10 microlitros de água livre de nuclease. Para ressuspender o DNA Use quatro microlitros de DNA ressuspenso para transformar por cepa de eletroporação e coli, ECD 100 DPIR ou ECD 100 DPIR um 16 inocular cinco mililitros de LB pode meio com uma única colônia.

Cultive-o a 37 graus Celsius e 120 RPM durante a noite. No dia seguinte, depois de purificar o DNA de toda a cultura, use Joe One para digerir 14 microlitros do plasmídeo. Analise 10 microlitros do plasmídeo não digerido e digerido em um gel de agarro a 0,8%.

Após o sequenciamento do plasmídeo, procure a sequência cinco primos GA, G-A-C-A-G três primos, que são os últimos sete pares de bases da transposição e serão seguidos pela sequência do gene interrompido. Use blast para determinar a possível função do gene interrompido. Uma eletroporação bem-sucedida rendeu vários milhares de transformantes, cada um com pelo menos uma transposição na inserção nesta figura.

Os quadrados pretos mostram duas colônias que cresceram na placa de lata LB, mas não na placa média mínima M nove. Esses TROs provavelmente continham interrupções em genes envolvidos na síntese de um aminoácido, um ácido nucléico ou uma vitamina, que são todos encontrados em lb, mas não em M nove, meio mínimo. As outras 86 colônias não tiveram uma interrupção em um gene necessário para o crescimento em M nove.

Meio mínimo como visto aqui, o DNA genômico parcialmente digerido de um TRO isolado vai de mais de 10 quilobases a menos de 0,5 quilobases de tamanho. O plasmídeo resgatado consiste no transposon de duas quilobases mais o DNA do hospedeiro flanqueador. Esta figura mostra um resultado de explosão para um plasmídeo que foi isolado de um tro.

A sequência interrompida é semelhante a um gene enterobacter cloy para a eat mutase, que está envolvida na biossíntese de L tirosina, L fenilalanina e L triptofano devido a várias etapas de crescimento durante a noite. Esta técnica pode ser concluída em 10 ou 11 dias se realizada corretamente. Durante a réplica, é importante lembrar de não manchar as placas, e você pode evitar isso usando placas secas e não movendo as placas depois de colocadas no quadrado de veltin.

Após este procedimento, outros métodos, como experimentos de clonagem ou complementação, podem ser realizados para verificar a função do gene identificado. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar TROs usando a mutagênese do transposon e como identificar provisoriamente os genes mutantes.