A partir de um ponto 2DE-Gel para a função da proteína: lição aprendida com HS1 em leucemia linfocítica crônica

O objetivo geral do experimento a seguir é usar uma abordagem proteômica combinada para identificar potenciais marcadores prognósticos e/ou alvos terapêuticos em doenças humanas. Isso é conseguido isolando as células leucêmicas primárias do sangue periférico do paciente, com prognóstico bom ou ruim, e expressando os marcadores de superfície CD 19 e CD cinco para usar na análise proteômica como uma segunda etapa. Os lisados de células leucêmicas são resolvidos por eletroforese bidimensional ou dois de, e a comparação de mapas proteômicos permite a identificação de manchas diferencialmente expressas entre pacientes de bom e mau prognóstico, que podem ser posteriormente identificadas por espectrometria de massas ou ms.

Em seguida, diferentes ensaios podem ser usados para validar e dissecar o papel das proteínas identificadas na história natural da doença. Os resultados mostram que diferentes estados de fosforilação da HS, detectados por dois géis, se correlacionam com o resultado clínico dos pacientes. A implicação desta técnica se estende para a terapia da leucemia linfocítica crônica, pois pode ajudar a identificar proteínas envolvidas na progressão da doença que podem ser exploradas como marcador prognóstico e ou alvos terapêuticos demonstrando que este procedimento será junto comigo.

Pamela correu para o técnico no laboratório e um pós-doutorado de um laboratório externo Antes de iniciar este procedimento, colete sangue periférico em tubos de coleta de sangue vacutainer com heparina sódica. Transfira o sangue para um tubo de 15 mililitros e adicione o coquetel de enriquecimento de células B humanas a 50 microlitros por mililitro de sangue total. Em seguida, misture bem e incube por 20 minutos em temperatura ambiente.

Após a incubação, dilua a amostra com um volume igual de PBS mais 2% de mistura de FBS suavemente e cubra cuidadosamente o sangue sobre o chamado da mosca, certificando-se de não quebrar a interface. Centrifugue a amostra a 400 vezes G à temperatura ambiente por 20 minutos sem interrupção. Quando terminar, aspire cuidadosamente a interface para recuperar as células e coloque-as em um novo tubo.

Lave as células uma vez com PBS após centrifugação e remoção do sobrenadante. Resus. Suspender o pellet no sobrenadante restante, sacudindo manualmente o tubo para a frente e para trás após a diluição. Com o meio RPMI completo, conte as células usando o método de exclusão azul Trian.

Em seguida, adicione os seguintes anticorpos a 100 microlitros da suspensão de células purificadas em um tubo de fax. Incubar a amostra durante 20 minutos a quatro graus Celsius no escuro. Após lavar a amostra com quatro mililitros de PBS, verificar a pureza por citometria de fluxo.

Verifique a porcentagem de células de leucemia linfocítica crônica ou LLC, que Coex expressam CD 19 e CD cinco em sua superfície. Certifique-se de que as preparações sejam virtualmente desprovidas de linfócitos e monócitos T NK, verificando a porcentagem de CD três, CD 14 e CD 1656 no gráfico, que deve estar próximo de zero neste ponto. Solubilize os pellets de células LLC com um volume final de 380 microlitros de tampão de eletroforese bidimensional.

Aplique um miligrama das amostras de proteína em 18 tiras de IPG para realizar a eletrofocalização iso. Após a corrida, equilibre as tiras em dois mililitros de tampão de equilíbrio, complementado com 2% de TDT fresco por 15 minutos em temperatura ambiente. Depois de descartar a solução, adicione dois mililitros de tampão de equilíbrio, suplementado com 2,5% de I oto acetamida.

Em seguida, incube a amostra por 15 minutos em temperatura ambiente em uma plataforma de balanço. Em seguida, seque as tiras no papel sem tocar no gel para remover o excesso de solução. Depois de seco, coloque cada tira em cima de um gel de página SDS de nove a 16% de gradiente.

Adicione um pequeno volume de tampão de eletroforese SDS em cima do gel para facilitar o carregamento da tira. Em seguida, sele o gel adicionando aproximadamente cinco mililitros de solução de ágar 0,8% para evitar a flutuação da tira. Uma vez montada a unidade de eletroforese, preencha-a com tampão de eletroforese SDS.

Em seguida, execute a corrida a 60 miliamperes por gel por quatro horas, quatro graus Celsius ou usando um sistema de resfriamento. Depois de remover o gel da unidade eletroforética, coloque-o na caixa de coloração adequada. Prepare cerca de 200 mililitros de cada solução.

Adicione cuidadosamente cada solução à caixa de coloração que contém o gel. Realize todas as incubações em uma plataforma de balanço. Após a coloração, remova a solução de parada e deixe o gel em uma solução de ácido acético a 1% até a aquisição.

Para o ensaio de migração, resus suspende as células previamente purificadas. Em RPMI completo, prepare a câmara inferior do transwell adicionando 600 microlitros de RPMI completo com ou sem os estímulos específicos. Para medir a migração induzida e espontânea, respectivamente, coloque a câmara superior em cima e deixe o sistema se equilibrar por 30 minutos a 37 graus Celsius na incubadora.

Quando terminar, semeie de 10 a seis células por 200 microlitros na câmara superior e incube a placa por quatro horas a 37 graus Celsius na incubadora. Após a incubação, remova a câmara superior e colete a mídia na câmara inferior. Em seguida, lave a câmara inferior uma vez com um mililitro de PBS.

Depois de coletar o PBS em um tubo, centrifugue a amostra por cinco minutos a 300 vezes G após a remoção do sobrenadante. Ressuspender a amostra em 500 microlitros de PBS por citometria de fluxo. Conte o número de células migradas após um minuto de aquisição.

Verifique o número de células em um gráfico de pontos bidimensional considerando as dispersões laterais das células e o número de eventos visualizados em um minuto, que é o número a ser usado para o cálculo. Amostras isoladas de células leucêmicas primárias de pacientes com LLC foram agrupadas em dois subconjuntos principais com base nas características clínicas de cada paciente e analisadas por duas massas DE e MS dentro de uma certa tolerância de massa. Foram atribuídos a sequências de peptídeos no banco de dados e, em seguida, montados em uma proteína que é considerada identificada se passar por uma determinada pontuação de probabilidade.

Por meio dessa análise, proteínas envolvidas principalmente na atividade do citoesqueleto e processos metabólicos foram identificadas entre essas proteínas. Linhagem hematopoiética, proteína específica da célula ou hs. Aquele cuja fosforilação diferencial fortemente associada ao curso clínico da doença foi expressa diferencialmente.

Em particular, os pacientes portadores de uma única mancha apresentam um resultado clínico ruim, enquanto os pacientes com duas manchas têm bom prognóstico. Descobriu-se que as células da LLC que carregam HS um como um ponto têm uma atividade citoesquelética prejudicada em termos de migração, adesão e polimerização de actina em comparação com HS hipofosforilada. Uma, duas amostras pontuais. Explicando assim um comportamento clínico diferente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a proteômica para identificar candidatos biológicos envolvidos na progressão da doença que podem ser usados como marcadores prognósticos e/ou alvos terapêuticos.