Name: Medindo espacial e temporal Ca 2 + Sinais em Arabidopsis Plantas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprenda a monitorar sinais de cálcio em plantas de Arabidopsis em nível celular e de planta inteira usando indicadores geneticamente codificados. Este método simples e robusto permite visualizar respostas ao estresse abiótico.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Somos gratos a B. Stevenson pela assistência técnica e ao Dr. Marc R. Knight por fornecer a linha transgênica Aequorin. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grant R01 GM059138.

1. Aequorina Based Ca2 + Imagem Usando o Sistema FAS <ol><li> Preparar mudas para imagens de luminescência. Esterilizar as sementes de plantas de Arabidopsis expressando a Aequorina com uma solução de lixívia a 10% contendo 0,01% de Triton-100. Semear as sementes estéreis sobre uma placa quadrada (10 x 10 cm quadrados placa de Petri com grade,) contendo força total MS (Murashige e Skoog Basal Mistura de sal), 1% de sacarose, e 1.2% de ágar. Colocar as placas verticalmente em uma câmara de crescimento, após a estratificação a 4 ° C durante 2 dias (Figura 1A). </li><li> Transferir as plantas para um filme. Coloque uma película adesiva (Figura 1B) na parte superior, de 7-10 dias de idade em crescimento mudas na placa. Com cuidado, empurre o filme à mão para garantir que as mudas aderir ao filme (Figura 1C). Descascar suavemente a película de modo que as plântulas permanece aderida à película (Figura 1D e 1E) </li><li> Incubar as mudas com cofator. Coloque a umdhered mudas para a placa quadrada (10 x 10 cm) contendo 15 ml de 2 ug / ml de h-CTZ (coelenterazina) em água. Incubar as plântulas, à temperatura ambiente durante 4 horas durante a noite (Figura 1F). </li><li> Prepare-se para imagens de luminescência. Pegue o filme fora da solução h-CTZ e cortá-la ao meio, formando duas partes. Coloque cada pedaço de filme com mudas de face para cima em duas placas diferentes. Deixe as placas no escuro por 5 min. </li><li> Adquirir imagens de luminescência. No escuro, colocar as duas placas ao lado do outro na fase do sistema de imagem de luminescência (Figura 1G). Adquirir imagens imediatamente após a adição de 20 ml de solução de estímulos para as placas simultaneamente. </li><li> Analisar imagens de luminescência. Escolha a mesma faixa de exibição para todas as imagens de luminescência. Cortar a região de interesse (ROI) e gerar as imagens como arquivos JPEG (Figura 2A). Alternativamente, exportar as imagens como arquivos de formato SPE e importá-los para oSoftware de análise de imagem ImageJ. Definir medidas para cálculo do valor médio de cinza de ROI. Selecione o mesmo tamanho da área ROI e medir os dados cinza e presentes médios como gráficos de barras (Figura 2B). </li></ol> 2. vivo celular confocal Ca2 + Imagem <ol><li> Preparar mudas para imagem confocal. Esterilizar sementes de plantas de Arabidopsis expressando case12 com solução de água sanitária a 10% contendo 0,01% de Triton. Semear as sementes estéreis em uma placa contendo sais MS força integral, 1% de sacarose e 1,2% de ágar. Colocar as placas verticalmente em uma câmara de crescimento, após a estratificação a 4 ° C durante 2 dias. </li><li> Câmaras de imagem Setup <ol><li> Monte uma câmara de imagem usando uma lâmina e lamela (Câmara A). Coloque um pedaço de algodão embebido de água para o meio da lâmina. Em seguida, transferir uma ou duas mudas de cinco dias de idade a partir da placa para o topo da água encharcada algodão. Cole pequenos pedaços de barro para cada canto de uma lamela, umd lugar lamela no topo de mudas de criar um espaço (câmara) entre a lamela e corrediça (Figura 3A, painel esquerdo). Ligar uma extremidade do tubo de polietileno (0,58 mm de diâmetro) para uma seringa de 1 ml e colocar a outra extremidade do tubo imediatamente adjacente à câmara. Segurar o tubo no lugar com fita adesiva (Figura 3A, painel da direita). </li><li> Monte uma câmara de imagem utilizando uma câmara de plexiglass (Câmara B). <ol><li> Espalhar uma camada fina de massa de silicone em torno de dois tubos de polietileno (0,58 mm de diâmetro) e pressionar os tubos revestidos para os canais em cada lado da câmara de plexiglass (Figura 3B painel da esquerda). Espalhar uma camada fina de massa de silicone sobre a superfície da câmara que contém as ranhuras do tubo e apertar uma lamela na graxa para vedar um lado da abertura da câmara (cortadas). </li><li> Transferir uma plântula cinco dias de idade a partir da placa para a câmara e colocar um pedaço de algodão embebido em água na parte superior of a muda. Espalhe massa de silicone sobre a outra superfície da câmara, e pressionar outra lamela sobre a selar. Ligar a extremidade de um dos tubos a uma seringa de 1 ml. Deixar a extremidade do outro tubo aberto (painel direito Figura 3B). </li></ol></li><li> Preparar uma câmara de imagem usando uma tampa de vidro câmaras (Câmara C). Esterilizar o vidro da tampa câmaras com etanol 70% e deixá-la sobre o capô até secar. Adicionar 0,6 ml ou 0,2 ml de força total meio MS contendo 1% de sacarose e 0,5% de phytagel em cada poço de uma câmara de dois poços ou de uma câmara de 8 poços (Figura 3C painel da direita), respectivamente. Esterilizar sementes e semear as sementes diretamente em uma tampa de vidro câmaras contendo uma fina camada de gel transparente e deixá-los crescer verticalmente, durante 5 dias (Figura 3C). </li></ol></li><li> Adquirir imagens usando um microscópio confocal. Para aplicar estímulos de estresse, tais como sal, frio ou peróxido, lentamente injete cerca de 200 mL de NaCl 150 mM, ice-cold água ou 1 mM de H 2 O 2 a solução para dentro da câmara (Secção A ou B), imediatamente antes da obtenção de imagens, ou adicionar cuidadosamente 500 ul ou 100 ul de solução de estímulo para o poço de uma câmara 2 ou 8 poços, respectivamente . Capturar imagens imediatamente após a aplicação da solução de estímulo usando uma Nikon A1R microscópio confocal de varredura a laser invertido com uma lente de imersão em água 20X (abertura numérica 0,75). Coletar uma série temporal de imagens em intervalos de 4 s com comprimentos de onda de excitação e emissão de 488 nm e 500-550 nm, respectivamente, e com uma resolução de pixel de 512 x 512. </li><li> Análise de Imagem Usando Nikon Elements, ROIs foram desenhadas ao redor de cada célula (ou área) de interesse. Intensidade total dentro de cada ROI foi medido ao longo do tempo usando a caixa de diálogo Tempo de medição (ImageJ poderia ser usado em vez disso). Total de medições de intensidade foram exportados e processados ​​em DataGraph. Ca2 + spike amplitude foi definida como a intensidade do pico de menos descansando intensidade, duração como the de tempo entre o início ea conclusão de uma espiga, eo período como o intervalo de tempo entre os picos de pico adjacentes de dois picos. teste t foi utilizado para comparar as médias. </li></ol>

<ol><li>Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signals%3A+the+lead+currency+of+plant+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signals: the lead currency of plant information processing.</a> Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).</li>
<li>Pan, Z., Zhao, Y., Zheng, Y., Liu, J., Jiang, X., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+screening+Arabidopsis+mutants+with+disordered+abiotic+stress-induced+calcium+signal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for screening Arabidopsis mutants with disordered abiotic stress-induced calcium signal.</a> J. Genet. Genomics. 39 (5), 225-235 (2012).</li>
<li>Ranf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defense-related+calcium+signaling+mutants+uncovered+via+a+quantitative+high-throughput+screen+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana.</a> Mol. Plant. 5 (1), 115-130 (2012).</li>
<li>Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aequorin-based+luminescence+imaging+reveals+stimulus-+and+tissue-specific+Ca2%2B+dynamics+in+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants.</a> Mol. Plant. 6 (2), 444-455 (2013).</li>
<li>Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+plant+aequorin+reports+the+effects+of+touch+and+cold-shock+and+elicitors+on+cytoplasmic+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium.</a> Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).</li>
<li>Van der Luit, A. H., Olivari, C., Haley, A., Knight, M. R., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+calcium+signalling+pathways+regulate+calmodulin+gene+expression+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct calcium signalling pathways regulate calmodulin gene expression in tobacco.</a> Plant Physiol. 121 (3), 705-714 (1999).</li>
<li>Johnson, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+oscillations+of+cytosolic+and+chloroplastic+free+calcium+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants.</a> Science. 269 (5232), 489-503 (1995).</li>
<li>Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+calcium+signaling+in+Arabidopsis+involves+two+cellular+pools+and+a+change+in+calcium+signature+after+acclimation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation.</a> Plant Cell. 8 (3), 489-503 (1996).</li>
<li>Logan, D. C., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+and+cytosolic+calcium+dynamics+are+differentially+regulated+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial and cytosolic calcium dynamics are differentially regulated in plants.</a> Plant Physiol. 133 (1), 21-24 (2003).</li>
<li>Mehlmer, N., Parvin, N., Hurst, C. H., Knight, M. R., Teige, M., Vothknecht, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolset+of+aequorin+expression+vectors+for+in+planta+studies+of+subcellular+calcium+concentrations+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana.</a> J. Exp. Bot. 63 (4), 1751-1761 (2012).</li>
<li>Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+calcium+responses+to+drought%2C+salt+and+cold+in+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root.</a> Plant J. 23 (2), 267-278 (2000).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li>
<li>Souslova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+fluorescent+protein-based+Ca2%2B+sensors+with+increased+dynamic+range%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single fluorescent protein-based Ca2+ sensors with increased dynamic range.</a> BMC. Biotechnol. 7, 37-46 (2007).</li>
<li>Tanaka, K., Swanson, S., Gilroy, S., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+nucleotides+elicit+cytosolic+free+calcium+oscillations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular nucleotides elicit cytosolic free calcium oscillations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154 (2), 705-719 (2010).</li>
<li>Iwano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-tuning+of+the+cytoplasmic+Ca2%2B+concentration+is+essential+for+pollen+tube+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fine-tuning of the cytoplasmic Ca2+ concentration is essential for pollen tube growth.</a> Plant Physiol. 150 (3), 1322-1334 (2009).</li>
<li>Sieberer, B., Chabaud, M., Timmers, A., Monin, A., Fournier, J., Barker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear-targeted+Cameleon+demonstrates+intranuclear+Ca2%2B+spiking+in+Medicago+truncatula+root+hairs+in+response+to+rhizobial+nodulation+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A nuclear-targeted Cameleon demonstrates intranuclear Ca2+ spiking in Medicago truncatula root hairs in response to rhizobial nodulation factors.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1197-1206 (2009).</li>
<li>Loro, G., Drago, I., Pozzan, T., Lo Schiavo, F., Zottini, M., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+Cameleons+to+different+subcellular+compartments+reveals+a+strict+cytoplasmic%2Fmitochondrial+Ca2%2B+handling+relationship+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Targeting of Cameleons to different subcellular compartments reveals a strict cytoplasmic/mitochondrial Ca2+ handling relationship in plant cells.</a> Plant J. 71 (1), 1-13 (2012).</li>
<li>Krebs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+genetically+encoded+sensors+allow+high-resolution+live+cell+imaging+of+Ca2%2B+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics.</a> Plant J. 69 (1), 181-192 (2012).</li>
<li>Bonza, M. C., Loro, G., Behera, S., Wong, A., Kudla, J., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+Ca2%2B+accumulation+and+dynamics+in+the+endoplasmic+reticulum+of+Arabidopsis+root+cells+using+a+genetically+encoded+Cameleon+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analyses of Ca2+ accumulation and dynamics in the endoplasmic reticulum of Arabidopsis root cells using a genetically encoded Cameleon sensor.</a> Plant Physiol. 163 (3), 1230-1241 (2013).</li>
<li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2O2+in+plant+peroxisomes%3A+An+in+vivo+analysis+uncovers+a+Ca2%2B+dependent+scavenging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">H2O2 in plant peroxisomes: An in vivo analysis uncovers a Ca2+ dependent scavenging system.</a> Plant J. 62 (5), 760-772 (2010).</li>
<li>Zhu, X., Caplan, J., Mamillapalli, P., Czymmek, K., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+endoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+in+innate+immunity-mediated+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Function of endoplasmic reticulum calcium ATPase in innate immunity-mediated programmed cell death.</a> EMBO J. 29 (5), 1007-1018 (2010).</li>
<li>Roszik, J., Lisboa, D., Szöllosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intensity-based+ratiometric+FRET+in+image+cytometry--approaches+and+a+software+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution.</a> Cytometry A. 75 (9), 761-767 (2009).</li>
<li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%3A+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J. Physiol. 578 (Pt 1), 55-67 (2007).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Nós demonstramos um sistema FAS para a gravação do espaço-temporal de Ca2 + resposta de mudas de Arabidopsis. Este FAS Ca2 + sistema de gravação proporciona uma abordagem simples, sensível e robusto, que pode ser adaptado para medir a Ca2 dinâmica desencadeada por estímulos diversos, para além dos estímulos de stress abiótico, que são aqui apresentados. Usando este sistema, podemos facilmente comparar tecido- ou específicos de estímulos espaço-temporais Ca2 + dinâmica a nível ...

A célula de planta responde ao meio ambiente através de sinalização que coordena as acções de células. Um evento de sinalização precoce de células em resposta a estímulos do meio ambiente é um aumento transitório de Ca2 +. O padrão, ou a assinatura de um aumento transitório da concentração de Ca2 + livre é caracterizado pela sua amplitude, frequência e duração. Assinaturas Ca2 + espaço-temporais distintas regular diferentes atividades celulares 1. Estímulos específicos, como o calor, o frio, o sal, a seca, a luz, ou hormônios vegetais, pode ajustar a atividade espaço-temporal localizada à membrana canais de Ca2 + e / ou transportadores, resultando em específicos de Ca2 + assinaturas. Embora os transportadores de Ca2 + têm sido bem caracterizados, pouco é conhecido sobre as identidades molecular e as funções de canais de Ca 2 + em plantas 1. Telas genéticos para os mutantes com alteração de Ca2 + resposta ao estresse pode ser um estímulo eficaz aproxoach para identificar os componentes que compõem Ca2 + assinaturas. Ca2 sistemas de detecção com base recentemente vários Aequorina têm sido desenvolvidos que facilitam telas genéticos para componentes de sinalização de Ca2 + em resposta a ataque patogénico e stress abiótico 2-4. Aequorina foi usado pela primeira vez para detectar sinais de Ca2 + em plantas no início de 1990 5. Desde então, a Aequorina foi orientada para diferentes compartimentos celulares, tais como o 5 citoplasma, núcleo 6, 7 cloroplastos, tonoplast 8, 9 mitocôndrias, e estroma 10, bem como para diferentes tipos de células na raiz para monitorar célula específica de Ca 2 + sinais 11. Medições de Ca 2 + base de Aequorina revelar o espacial e temporal de Ca2 + resposta de uma população de células ao estresse estímulos. No entanto, na maioria dos casos, as respostas do Ca2 + de células individuais são unsynchronized no tecido respondendo 4. Por conseguinte, a Aequorina Ca2 + gravação não necessariamente comunicar o sinal de Ca2 + em células individuais. Nos últimos anos, a proteína fluorescente geneticamente codificado (FP) à base de Ca2 + de indicadores, tais como cameleon amarelo (YCS) 12 e 13 casos12 têm sido utilizados para estudar a sinalização de Ca2 + com alta resolução subcelular. YCS são fluorescência transferência de energia de ressonância (FRET) à base de Ca 2 + indicadores, contendo PCP e YFP variantes ligadas pela Ca2 + ligaï¿½o ao calmodulina proteínas e peptídeos de ligação à calmodulina M13. A calmodulina sofre uma alteração conformacional, uma vez que se liga a Ca 2 +, pondo assim PCP e YFP mais juntos, o que resulta num aumento da transferência de energia (reforçada FRET). O nível de FRET ao longo do tempo, calculada aproximadamente como a razão entre a intensidade do sinal YFP PCP, reflecte intracelular de Ca2 + dinâmica. Várias versões YC têm sido utilizados em plantas. YC3.6 era targeted para o citosol 14,15, núcleo 16, 17 mitocôndrias e membrana plasmática 18, e YC4.6 e D4ER foram direcionados para o ER 15,19, e D3cpv foi direcionada para os peroxissomos 20. Plantas transgênicas expressando YCS permitir a geração de imagens de células vivas de Ca2 + dinâmica em diferentes compartimentos celulares de diferentes tipos de células. Casos (presumivelmente Ca lcium se nsor) são proteínas simples permuta circular fluorescentes (cpFPs) abrigam uma calmodulina e peptídeos de ligação à calmodulina M13. Após a ligação ao Ca2 +, os casos sofrer alterações conformacionais, que conduz a um aumento da intensidade da fluorescência. A correlação entre a resposta da fluorescência do CASE e concentração de Ca2 + permite intracelular de Ca2 + dinâmica a ser medido quantitativamente. A variante case12 tem 12 vezes maior de fluorescência nas Ca2 + formas saturados. N. plantas benthiminana transitoriamente expressing case12 ou plantas de Arabidopsis expressando estavelmente Caso 12 foram usados ​​para estudar Ca 2 + sinalização na defesa e abióticos de estresse 4,21. Asynchronous espacial e temporal Ca2 oscilações nas células respondem ao ataque de patógenos, ou ao estresse desidratação foram revelados com base case12 Ca2 + imagem. Aqui, apresentamos instruções detalhadas para a Aequorina imagem luminescência base de Tecido e estímulos específicos Ca2 dinâmica em plântulas de Arabidopsis, e por imagem confocal de citosólica e Ca 2 + dinâmica nuclear em células das raízes de Arabidopsis que expressam Caso 12 luminescência de imagem de FAS pode ser adaptado para analisar induzidas pelo stress Ca2 dinâmica em plantas ou tecidos intactos não descritos aqui, ou para pesquisar populações de plantas de Arabidopsis mutantes por mutagénese com o stress alterado induzido Ca2 sinais. A configuração da imagem de células vivas de Ca2 + pode ser adaptado para analisar Ca2 + dinâmica em diferentes compartimentos subcelluar ou em diferentes tipos de células utilizando outros indicadores de Ca2 +.

<table><tbody><tr><td>Placa de Petri quadrada de 10 cm x 10 cm</td><td>VWR</td><td>60872-310</td><td></td></tr><tr><td>Película adesiva</td><td>VWR</td><td>60941-062</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno</td><td>PerkinElmer</td><td>9908265</td><td></td></tr><tr><td>seringa de 1 ml</td><td>VWR</td><td>53548-000</td><td></td></tr><tr><td>Massa lubrificante de silicone</td><td>Beckman</td><td>335148</td><td></td></tr><tr><td>vidro de cobertura com câmara de 2 poços&nbsp;</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155379</td><td></td></tr><tr><td>vidro de cobertura com câmara de 8 poços</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagem de luminescência</td><td>Princeton Instruments</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de varredura a laser confocal invertido</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>N/A</td><td>Nikon A1R&nbsp;</td></tr><tr><td>Software de imagem</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>N/A</td><td>Nikon Elements&nbsp;</td></tr><tr><td>DataGraph</td><td>Visual Data Tools Inc</td><td>N/A</td><td>DataGraph 3.1.1 é a versão mais recente</td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>NanoLight Technolgies</td><td>#301B NF-BCTZ-FB</td><td></td></tr><tr><td>Alvejante multiuso</td><td>Qualquer loja local</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151500</td><td></td></tr><tr><td>MS sal</td><td>Phytotechnology Labs</td><td>M524-50L</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>VWR</td><td>BDH8029-12KG</td><td></td></tr><tr><td>Ágar</td><td>Sigma</td><td>A1296-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel Sigma</td><td></td><td>P8169-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

medindo espacial e temporal ca 2 + sinais em arabidopsis plantas

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Sinais ambientais e de desenvolvimento induzir oscilações de Ca2 + em células de plantas. Espaço-temporais de Ca2 + padrões específicos de estímulo são detectados por proteínas Ca2 + ligação celulares que iniciam Ca2 + cascatas de sinalização. No entanto, ainda sabemos pouco sobre como estímulo sinais de Ca 2 + específico são gerados. A especificidade de um sinal de Ca2 + pode ser atribuído à regulação sofisticados das actividades dos canais de Ca2 + e / ou transportadores, em resposta a um dado estímulo. Para identificar estes componentes celulares e compreender as suas funções, é essencial a utilização de sistemas que permitem a gravação sensível e robusto de sinais de Ca 2 + em ambos os tecidos e níveis celulares. Codificados geneticamente Ca2 indicadores que são direcionados para diferentes compartimentos celulares têm proporcionado uma plataforma para células vivas imagem confocal de celulares Ca2 + sinais. Aqui descrevemos instruçãos para a utilização de dois sistemas de detecção de Ca 2 +: aequorina baseado FAS (mudas adesivas película luminescência) de Ca2 + e de imagiologia case12 confocal de fluorescência de células vivas com base de Ca2 + de imagem. Imaging luminescência usando o sistema FAS fornece uma detecção simples, robusto e sensível de Ca2 + sinais espaciais e temporais em nível tecidual, enquanto células vivas imagem confocal usando case12 fornece detecção simultânea de citosólica e Ca2 + sinais nucleares em uma resolução alta.

Manitol, NaCl e H 2 O 2 foram usados ​​como proxies para a desidratação, de sal e de estresse oxidativo estímulos, respectivamente. Para verificar se o ião de metal pesado Cu2 + sinergiza com qualquer destes três estímulos de stress, comparou-se a resposta de Ca 2 + a cada estímulo na presença ou ausência de Cu2 +. Como mostrado na Figura 2, o FAS luminescência imagiologia revelou que as plântulas Arabidoposis responderam diferentemente a desidrataç...

Sinalização de Ca2 + regula diversos processos biológicos em plantas. Aqui apresentamos abordagens para monitorar o estresse abiótico induzida Ca espacial e temporal 2 + sinais em células e tecidos, utilizando os codificados geneticamente Ca2 indicadores aequorin ou case12 Arabidopsis.

Medindo espacial e temporal Ca 2 + Sinais em Arabidopsis Plantas

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um método de monitoramento dos sinais de cálcio tanto no nível celular quanto na planta inteira. Isso é feito primeiro cultivando mudas na placa de ágar MS ou diretamente dentro da câmara de imagem. O segundo passo é transferir as mudas para um filme adesivo ou mantê-las na câmara de imagem.Em seguida, estímulos aplicados às mudas para induzir sinais de cálcio. Em última análise, a luminescência do estilo de vida ou a imagem de fluorescência são usadas para mostrar a resposta de cálcio nuclear de plântula inteira ou citosólica, respectivamente, a diferentes estímulos. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a ocorrência de uma única planta, é que o ensaio de mudas adesivas de filme é simples, sensível e robusto.Portanto, esta técnica pode ser adaptada para a triagem de alto rendimento para mutantes com respostas de sinal de cálcio alteradas. Além disso, em comparação com a imagem de cálcio de base plana, o uso de indicador de cálcio geneticamente codificado baseado em GFP evita configurações e cálculos microscópicos complicados. Este método fornece informações sobre a sinalização de cálcio durante a respo

measuring-spatial-and-temporal-ca2-signals-in-arabidopsis-plants

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Análise de célula específico<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Folhas utilizando ordenação células activadas por fluorescência

Este artigo fornece um protocolo para o cultivo de mudas de Arabidopsis no RootChip, uma plataforma microfluídica imagem que combina controle automatizado das condições de crescimento com acompanhamento raiz microscópica e FRET baseado em medição de níveis de metabólitos intracelulares.

Time-lapse imagens de fluorescência de crescimento de raiz Arabidopsis com Manipulação acelerada do meio root usando o RootChip

Este protocolo descreve um método para testar a hipótese de que a reversão do campo geomagnético efetivo (GMF) induz expressão gênica diferencial e altera a morfologia de Arabidopsis thaliana. Um sistema octogonal triaxial de pares de bobinas de Helmholtz foi usado para gerar artificialmente condições de GMF invertidas na câmara de crescimento da planta.

Geomagnética Field (Gmf) and Plant Evolution: investigação dos efeitos dos Gmf Reversão sobre<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Desenvolvimento e Expressão Gênica

Este protocolo descreve um método simples para análise de sinais de cálcio em plantas geradas pela alimentação hemipteran insetos, como pulgões. Arabidopsis thaliana transformada com o biosensor de cálcio GFP GCaMP3 permitem a imagem em tempo real na vivo da dinâmica de cálcio com alta resolução temporal e espacial.

Gravação em tempo real na Vivo de Arabidopsis sinais de cálcio durante a alimentação de insetos usando um biossensor fluorescente

Aqui, apresentamos um protocolo para estudar o comportamento do crescimento de planta e especialmente fenótipos de forma reproduzível. Mostramos como fornecer variável e ao mesmo tempo estável condições de luz. Adequada análises dependem de números suficientes de amostra e avaliações de estatísticas válidas.

Análise do comportamento de crescimento de Arabidopsis thaliana em diferentes qualidades de luz

Percepção de Giberelina Sensor 1 (GPS1) é o primeiro Förster ressonância energética baseada em transferência biosensor para medir os níveis celulares de fitohormônios Giberelina com uma alta resolução spatiotemporal. Este protocolo informa o método para visualizar e quantificar os níveis de Giberelina celular usando o biosensor nlsGPS1 geneticamente codificado em Arabidopsis hipocótilo e dicas de raiz.

Níveis de Giberelina celular visualização usando a energia de ressonância de Förster NlsGPS1 transferir Biosensor (FRET)

O objetivo deste protocolo é mostrar como carregar o CFDA em diferentes locais das partes inferiores de Arabidopsis. Apresentamos, então, o padrão de distribuição resultante da FC nas brotações.

Shootward movimento de CFDA Tracer carregado no fundo pia tecidos de Arabidopsis

A sinalização sistêmica de cálcio acionada por glutamato extracelular é fundamental para a indução de respostas de defesa vegetal a ferimentos mecânicos e ataque herbívoro em plantas. Este artigo descreve um método para visualizar a dinâmica espacial e temporal de ambos os fatores usando plantas arabidopsis thaliana expressando biosensores fluorescentes sensíveis ao cálcio e glutamato.

Imagens em campo amplo e em tempo real de sinais de feridas locais e sistêmicas em Arabidopsis

Aqui, descrevemos uma ferramenta avançada projetada para o monitoramento da biossíntese de clorofila durante os estágios iniciais da desetiolação de plântulas de Arabidopsis . A nova metodologia fornece imagens não invasivas de fluorescência da clorofila em tempo real com alta resolução espacial e temporal.

Ensaio Não Invasivo para Determinação da Cinética de Biossíntese de Clorofila durante os Estágios Iniciais da Desetiolação de Arabidopsis

Esta é uma demonstração de como membranas biológicas podem ser compreendidos através de modelos elétricos. Nós também demonstramos os procedimentos para registrar potenciais de ação a partir do cordão nervoso ventral do crustáceo para laboratórios de estudantes orientados.

Modelagem de Membranas Biológicas, com placas de circuito e medição de sinais elétricos em Axônios: Exercícios Laboratório Student

Aprenda a monitorar sinais de cálcio em plantas de Arabidopsis em nível celular e de planta inteira usando indicadores geneticamente codificados. Este método simples e robusto permite visualizar respostas ao estresse abiótico.

Medindo espacial e temporal Ca^{2 +} Sinais em Arabidopsis Plantas

Explorar mais vídeos