Medindo espacial e temporal Ca 2 + Sinais em Arabidopsis Plantas
2 de setembro de 2014
Sinalização de Ca2 + regula diversos processos biológicos em plantas. Aqui apresentamos abordagens para monitorar o estresse abiótico induzida Ca espacial e temporal 2 + sinais em células e tecidos, utilizando os codificados geneticamente Ca2 indicadores aequorin ou case12 Arabidopsis.
O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um método de monitoramento dos sinais de cálcio tanto no nível celular quanto na planta inteira. Isso é feito primeiro cultivando mudas na placa de ágar MS ou diretamente dentro da câmara de imagem. O segundo passo é transferir as mudas para um filme adesivo ou mantê-las na câmara de imagem.
Em seguida, estímulos aplicados às mudas para induzir sinais de cálcio. Em última análise, a luminescência do estilo de vida ou a imagem de fluorescência são usadas para mostrar a resposta de cálcio nuclear de plântula inteira ou citosólica, respectivamente, a diferentes estímulos. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a ocorrência de uma única planta, é que o ensaio de mudas adesivas de filme é simples, sensível e robusto.
Portanto, esta técnica pode ser adaptada para a triagem de alto rendimento para mutantes com respostas de sinal de cálcio alteradas. Além disso, em comparação com a imagem de cálcio de base plana, o uso de indicador de cálcio geneticamente codificado baseado em GFP evita configurações e cálculos microscópicos complicados. Este método fornece informações sobre a sinalização de cálcio durante a resposta ao estresse em Arabidopsis, mas também pode ser usado em outros contextos, como durante o desenvolvimento ou defesa em outros modelos de plantas.
Demonstrar este método será brilhante. Um aluno do nosso laboratório Para iniciar este procedimento, esterilize as sementes de uma planta de opsis de coelho expressando uma quain com solução de alvejante a 10% contendo 0,01% Triton 100, semeie as sementes em um prato quadrado contendo MS 1% de sacarose e 1,2% de ágar. Em seguida, coloque as placas verticalmente em uma câmara de crescimento após estratificação de quatro graus Celsius por dois dias.
Depois, transfira as mudas para um filme. Coloque uma película adesiva em cima das mudas de sete a 10 dias que crescem no prato. Empurre suavemente o filme com a mão para garantir que as mudas estejam aderidas ao filme.
Em seguida, descasque o filme suavemente para que as mudas permaneçam aderentes ao filme. Em seguida, incube as mudas com o cofator, colocando as mudas A aderem em uma placa quadrada contendo 15 mililitros de dois microgramas por mililitro HCTZ em água. Incube as mudas em temperatura ambiente por quatro horas a durante a noite.
Para se preparar para a imagem de luminescência, retire o filme da solução HCTZ e corte-o ao meio para formar dois pedaços. Coloque os dois pedaços de filme com as mudas voltadas para cima em dois pratos diferentes. Em seguida, deixe as placas no escuro por cinco minutos para adquirir imagens de luminescência no escuro.
Coloque duas placas uma ao lado da outra no palco do sistema de imagem de luminescência. Adquira imagens imediatamente após adicionar 20 mililitros de solução de estímulo às placas simultaneamente. Para analisar as imagens de luminescência, escolha o mesmo intervalo de exibição para todas as imagens de luminescência, corte o ROI e gere as imagens como arquivos jpeg.
Como alternativa, exporte as imagens como arquivos no formato SPE e importe-as para o software de análise de imagem Image J. Defina as medidas para calcular o valor médio de cinza do ROI selecione o mesmo tamanho da área de ROI. Em seguida, meça o valor médio de cinza e apresente os dados como gráficos de barras.
Para preparar mudas para imagens confocais. Esterilize as sementes das plantas opsis expressando o caso 12 com solução de alvejante a 10% contendo 0,01% de Triton. Portanto, as sementes estéreis em um prato contendo sais de MS de força total, 1% de sacarose e 1,2% de ágar.
Em seguida, coloque as placas verticalmente em uma câmara de crescimento após estratificação a quatro graus Celsius por dois dias. Enquanto isso, monte uma câmara de imagem com uma lâmina e uma lamínula. Coloque um pedaço de algodão embebido em água na parte superior da lâmina.
Em seguida, transfira uma ou duas mudas de cinco dias da placa para o meio da lâmina. Em seguida, cole pequenos pedaços de argila em cada canto da lamínula e coloque a lamínula em cima das mudas para criar um espaço entre a lamínula e o slide. Depois disso, conecte uma extremidade do tubo de polietileno a uma seringa de um mililitro e coloque a outra extremidade do tubo imediatamente adjacente à câmara.
Segure o tubo no lugar com fita adesiva para montar uma câmara de imagem com uma câmara de plexiglass. Espalhe uma fina camada de graxa de silicone em torno de dois tubos de polietileno e pressione os tubos revestidos nos canais de cada lado da câmara de plexiglass. Em seguida, espalhe uma fina camada de graxa de silicone na superfície da câmara que contém as ranhuras do tubo e coloque uma lamínula sobre a graxa para selar um lado da abertura da câmara.
Em seguida, transfira uma muda de cinco dias do prato para a câmara e coloque um pedaço de algodão embebido em água em cima da muda. Espalhe a graxa de silicone na outra superfície da câmara e pressione outra lamínula na parte superior para selar. Em seguida, conecte a extremidade de um dos tubos a uma seringa de um mililitro e deixe a extremidade do outro tubo aberta.
Para preparar uma câmara de imagem com uma lamínula com câmara, primeiro esterilize a lamínula com etanol a 70% e deixe-a na coifa até secar a 0,6 mililitros ou 0,2 mililitros de MS de força total. Meio contendo 1% de sacarose e 0,5% de gel de lutador em cada poço de uma câmara de dois poços ou de uma câmara de oito poços, respectivamente. Em seguida, esterilize as sementes e semeie-as diretamente em uma lamínula contendo uma fina camada de gel transparente e deixe-as crescer verticalmente por cinco dias. Para aquisição de imagem.
O uso de um microscópio confocal aplica estímulos de estresse injetando lentamente 200 microlitros de cloreto de sódio 150 milimolar, água gelada ou uma solução milimolar de peróxido de hidrogênio na câmara antes de adquirir as imagens. Capture as imagens imediatamente após a aplicação da solução de estímulo. Usando um microscópio de varredura a laser confocal invertido com uma lente de imersão em água de 20 x.
Colete uma série temporal de imagens em intervalos de quatro segundos com comprimentos de onda de excitação e emissão de 4 88 nanômetros e 500 a 550 nanômetros, respectivamente, e uma resolução AIX de cinco 12 por cinco 12 ou análise de imagem usando elementos Nikon. Os ROIs são desenhados em torno de cada célula de interesse. A intensidade total dentro de cada ROI é medida ao longo do tempo usando a caixa de diálogo de medição de tempo.
Em seguida, as medições de intensidade total são exportadas e processadas no gráfico de dados mostrado. Aqui está a comparação da resposta espaço-temporal do cálcio de mudas de 10 dias. Os diferentes estímulos de estresse aqui são as séries temporais de luminescência, imagens de mudas submetidas a 400 milimolares manitol e 400 milimolares mais um milimolar cloreto de cobre, 75 milimolares de cloreto de sódio e 75 milimolares de cloreto de sódio mais um milimolar de cloreto de cobre e um milimolar de peróxido de hidrogênio ou um mili molar de peróxido de hidrogênio mais um milimolar de cloreto de cobre.
Os painéis superior e inferior são as imagens de luminescência adquiridas durante os primeiros 40 segundos e segundos 40 segundos, respectivamente. E aqui está o gráfico de barras da intensidade média de luminescência das mudas em resposta aos estímulos de estresse indicados mostrados aqui como a oscilação citosólica e nuclear do cálcio. Em resposta ao estresse salino, as imagens confocais mostram que o caso 12 é expresso no citoplasma e núcleos das células radiculares e nas células foliares das plantas transgênicas expressando o caso 12.
Esta imagem é emergida, imagem do vermelho, autofluorescência dos cloroplastos e a fluorescência verde do caso 12. Esses dois gráficos mostram a oscilação de cálcio induzida pelo estresse salino no citosol, um núcleo das células radiculares. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar mudas bem cultivadas.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como monitorar dynas tanto no nível celular quanto em toda a planta.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método para monitorar a sinalização de cálcio (Ca2+) em plantas de Arabidopsis sob estresse abiótico. A técnica utiliza indicadores genéticos de Ca2+ para visualizar alterações espaciais e temporais nos níveis de cálcio.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Vegetal
- Sinalização Celular
- Respostas ao Estresse Abiótico
Antecedentes
- A sinalização de cálcio é crucial para diversos processos biológicos em plantas.
- Compreender a dinâmica de Ca2+ pode ajudar a elucidar as respostas das plantas ao estresse ambiental.
- Indicadores geneticamente codificados oferecem uma abordagem inovadora para visualizar esses sinais.
- Os métodos existentes podem apresentar menor sensibilidade ou robustez em comparação com esta técnica.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar um método confiável para monitorar sinais de cálcio em plantas.
- Avaliar as respostas celulares e da planta inteira ao estresse abiótico.
- Aprimorar as técnicas existentes para o estudo da sinalização de Ca2+.
Métodos Utilizados
- Plântulas são cultivadas em placas de ágar MS ou em câmaras de imagem.
- Plântulas são transferidas para filmes adesivos para aquisição de imagens.
- Sinais de cálcio são induzidos por estímulos específicos.
- A imagem de luminiscência ou fluorescência capta as respostas de cálcio.
Resultados Principais
- A técnica visualiza efetivamente as respostas de cálcio em níveis celular e de planta inteira.
- Ela demonstra alta sensibilidade e robustez em comparação com métodos tradicionais.
- As respostas variam conforme o tipo de estímulo aplicado.
- Os resultados contribuem para a compreensão das respostas ao estresse em plantas por meio da sinalização de cálcio.
Conclusões
- Este método fornece uma ferramenta poderosa para o estudo da sinalização de cálcio em plantas.
- Ele aprimora a compreensão de como as plantas respondem ao estresse abiótico.
- Os achados podem orientar pesquisas futuras sobre resiliência e adaptação em plantas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O monitoramento de sinais espaciais e temporais de Ca2+ em sistemas vegetais auxilia na validação de alvos no descobrimento de agroquímicos, ao associar respostas específicas a estímulos a mecanismos moleculares. O método permite a triagem fenotípica de mutantes com sinalização de cálcio alterada, proporcionando desvio mecanicista de riscos para compostos que visam vias de resposta ao estresse. Leituras quantitativas e reprodutíveis em níveis teciduais e celulares melhoram a confiança preditiva em fluxos de trabalho de descobrimento precoce.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas ao associar padrões de fluxo de Ca2+ a estímulos abióticos específicos e cascatas de sinalização downstream.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de canais iônicos e transportadores como alvos farmacológicos por meio de perfis de resposta específicos a estímulos.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao distinguir compostos que modulam assinaturas específicas de Ca2+ associadas a fenótipos desejados.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos relevantes para doenças para triagem subsequente, estabelecendo a dinâmica basal de Ca2+ em linhagens selvagens e mutantes.
- Valor Operacional: Fornece saídas padronizadas e robustas de luminiscência e fluorescência adequadas para adaptação em alto rendimento.
- Escalabilidade: O sistema de luminiscência FAS permite um monitoramento simples e sensível em nível tecidual, compatível com formatos de múltiplas poças, para triagem de mutantes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta descobertas iniciais à validação pré-clínica, demonstrando mecanismos conservados de sinalização de Ca2+ sob condições de estresse.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece se os fenótipos observados decorrem da modulação específica do manuseio de Ca2+ ou de efeitos fora do alvo.
- Alinhamento de Biomarcadores: As oscilações de Ca2+ no citosol e no núcleo funcionam como leituras farmacodinâmicas quantificáveis do engajamento da via.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a verificação da hipótese do alvo até a identificação de compostos líderes e a validação pré-clínica, permitindo o aprimoramento iterativo de compostos com base em fenótipos de sinalização de Ca2+.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao revelar como perturbações genéticas ou químicas alteram os padrões espaciais e temporais específicos ao estímulo do Ca2+.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio de linhagens transgênicas estáveis que expressam indicadores de Ca2+ direcionados a compartimentos, garantindo detecção reprodutível do sinal.
- Análises: Gera leituras quantitativas de intensidade de luminiscência e de fluorescência ratiométrica que permitem comparação entre genótipos e condições de tratamento.
- Pesquisa Translacional: Demonstra a continuidade entre sinalização celular e respostas da planta inteira, apoiando a extrapolação para resultados fisiológicos complexos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para triagem de diversas bibliotecas químicas ou fundos genéticos sob paradigmas padronizados de estresse.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade na atribuição do mecanismo de ação.
- Valor Operacional: Oferece padronização e reprodutibilidade entre laboratórios por meio de protocolos de imagem e sistemas indicadores bem definidos.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir decisões precoces de avançar/não avançar com base na fidelidade do sinal de Ca2+, e não apenas em âncoras fenotípicas.
- Impacto na Carteira: Facilita o avanço ajustado ao risco ao identificar compostos que produzem assinaturas desejadas de Ca2+ sem desencadear respostas estressoras maladaptativas.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em transformação vegetal, microscopia confocal e sistemas de imagem de luminiscência.
- Depende da disponibilidade de linhagens transgênicas de Arabidopsis expressando aequorina ou Case12 e acesso a leitores de placas ou microscópios confocais.
- Necessita padronização na aplicação do estímulo, tempos de incubação e parâmetros de imagem entre diferentes usuários e locais.
- A adaptação a espécies não pertencentes ao gênero Arabidopsis pode exigir otimização da eficiência de transformação e da localização do indicador.
- Limitações práticas incluem vazamento do sinal em tecidos autofluorescentes e a necessidade de condições adaptadas à escuridão para a detecção de luminiscência.
