Name: Estratégias para Rastreamento Anastasis, uma célula de sobrevivência Fenômeno que reverte apoptose (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Aprenda a detectar e rastrear anastase em células mamíferas usando microscopia de células vivas e biossensores. Este método permite observar a reversão da apoptose e suas consequências para a biologia celular.

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Agradecemos Rev. Dr. Ralph Bohlmann e Rev. Dr. James Voelz por sugerir a palavra &quot;anastasis&quot; para descrever a reversão da apoptose; Douglas R. Green para as células HeLa que expressam estavelmente o citocromo c -GFP; Charles M. Rudin e Eric E. Gardner para H446 células; Lamb Heather de assistência em desenho dos desenhos animados para o vídeo; Yee Hui Yeo para valiosa discussão deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado por uma Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), a Bolsa de Estudos Dr. Walter Szeto Memorial (HLT), bolsa Fulbright 007-2009 (HLT), Life Science Foundation Research fellowship (HLT), NIH concede NS037402 (JMH) e NS083373 (JMH) e Universidade Comitê Grants do Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang é um Shurl e Kay Curci Fundação Fellow da Fundação Life Sciences Research.

Os autores não têm nada a divulgar.

Anastasis se refere ao fenômeno em que as células que tenham activado via de morte celular reverter posteriormente o processo de morrer e sobreviver. Aqui, nós demonstramos que imagens de células vivas podem ser usados ​​para confirmar que as mesmas células individuais de fato pode reverter processo de morte celular por apoptose numa fase tardia, e, em seguida, continuar a sobreviver e reproduzir. Os nossos protocolos descrever várias condições de tratamento específicas do tipo de células optimizado para induzir apoptos...

A apoptose (palavra grega para &quot;cair para a morte&quot;) é geralmente aceite que é um processo de uma maneira que termina em suicídio celular 1-7. Perturbação genética de pró-morte genes resulta na sobrevivência de células extra que de outra forma morrem em animais inteiros, incluindo as células que já iniciadas 8,9 a via de apoptose. Da mesma forma, as manipulações genéticas permitem que as células de mamíferos saudáveis ​​que artificialmente mostrar &quot;me come&quot; sinais ou que perdem aderência à sua matriz extracelular para escapar da morte por fagocitose de células inteiras ou entosis, respectivamente 10,11. No entanto, nós e outros mostraram que, sem manipulação genética de células de mamíferos saudáveis ​​normais e linhas de células também pode recuperar desde as fases iniciais da apoptose 12-15. Usando ferramentas para rastrear células individuais, demonstramos ainda mais a recuperação de estágios finais de apoptose 12,13, depois que as células passaram checkpoints importante que típicoly marcar o &quot;ponto de não retorno&quot; 2-6. Estes pontos de controlo de fase de apoptose tardia incluem libertação mitocondrial de citocromo c, a activação de caspases, fragmentação nuclear, e formação de corpos apoptóticos. Adotamos uma palavra composta grega &quot;anastasis&quot;, que significa &quot;subindo para a vida&quot;, para descrever essa inversão de apoptose à beira da morte celular 2-6. A não ser que todo o processo de morrer recuperação é observado por imagens de células vivas, é um desafio para distinguir as células que sofreram anastasis a partir de células que nunca experimentaram eventos apoptóticos. Décadas de trabalho têm revelado que as características morfológicas de suicídio celular por apoptose são movidos por eventos bioquímicos e moleculares conservados evolutivamente 16-19. Estes eventos promover a auto-destruição das células que regulam os processos de desenvolvimento e homeostáticos em organismos unicelulares e pluricelulares, eliminando danificado ou dcélulas angerous 16-19. Enquanto as células em apoptose pode ser facilmente distinguidos por manifestações morfológicas, bioquímicas e moleculares padronizados de apoptose 1,5,6,16,20, atualmente não há nenhum marcador conhecido específico para anastasis 12,13. É importante notar que as células que sofreram anastasis parecem ser as células saudáveis ​​normais, e as células que começam a inversão apoptose apenas aparecem como células moribundas apoptóticos 12,13. Assim, novas ferramentas são necessárias para concluir com segurança que uma determinada célula sobreviver já havia experimentado processos apoptóticos ativos. A apoptose é geralmente assumido como uma cascata irreversível porque é um processo de destruição rápida e maciça. Embora possa demorar alguns minutos para dias para algumas células para iniciar a apoptose, uma vez que as mitocôndrias têm lançado fatores apoptogénicas como citocromo c para o citosol 21,22, caspases pode ser ativado dentro de 5 minutos 23,24, seguido por citoplasmática econdensação nuclear dentro de 10 min 25-27, e morte celular pouco depois 25-27. Caspases activadas orquestrar a apoptose por clivagem e inactivação de componentes estruturais e funcionais importantes para o propósito de demolição 2,28 celular, tais como o inibidor da endonuclease DFF45 / ICAD 29,30. Caspases também ativar fatores pró-apoptóticos, como BID membro família Bcl-2, que transloca para a mitocôndria para promover a liberação mitocondrial do citocromo c 31,32. Atividade Caspase também resulta em exposição na superfície celular de phosphatidylserine como um &quot;me comer&quot; sinal para a promoção engulfment de morrer células por macrófagos ou células vizinhas através de fagocitose 33. Além disso, os eventos apoptóticos tornar mitocôndrias disfuncionais, interrompendo bioenergética celular e metabolismo 34,35,36. Assim, a recuperação de tal destruição parece intuitivamente improvável. Contrariamente ao original esperarções, as células podem reverter o processo de morte celular por apoptose, mesmo numa fase tardia. Ao monitorar continuamente o destino de morrer células em cultura, observou-se a reversibilidade da fase de apoptose tardia em um intervalo de células primárias e linhas de células 12,13. A remoção do estímulo morte permitiu a recuperação das características evidentes de apoptose, tais como a fragmentação mitocondrial, a condensação da cromatina, danos no ADN, de vesículas de membrana do plasma, a exposição da superfície celular de fosfatidilserina, a libertação de citocromo c mitocondrial, activação de caspases, fragmentação nuclear, encolhimento da célula, e formação de corpos apoptóticos. Estas observações levantam questões sem respostas sobre as funções, as consequências, e os mecanismos de anastasis. Para responder a estas perguntas, um pré-requisito é para identificar com segurança as células que sofreram anastasis. Aqui, descrevemos os métodos de microscopia ao vivo e um biossensor caspase para detectar células que já inverteu apoptose fase tardia e then sobreviveu.

<table><tbody><tr><td>Microscopia confocal LSM780</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prato de cultura com fundo de vidro</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Transparente CultFoi</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1116-084</td><td></td></tr><tr><td>CO2 meio independente</td><td>Life Technologies</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker</td><td>Life Technologies</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Red CMXRos</td><td>Life Technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Anexina V marcada com fluorescência Biovision</td><td></td><td>K201</td><td></td></tr></tbody></table>

estratégias para rastreamento anastasis, uma célula de sobrevivência fenômeno que reverte apoptose

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (grego para &quot;ressuscitar para a vida&quot;) refere-se a recuperação de células que morrem. Antes essas células se recuperar, eles passaram por checkpoints importantes da apoptose, incluindo fragmentação mitocondrial, liberação de citocromo c para o citosol, ativação de caspases, condensação da cromatina, danos no DNA, fragmentação nuclear, blebbing membrana plasmática, o encolhimento celular, exposição da superfície celular de fosfatidilserina, e formação de corpos apoptóticos. Anastasis pode ocorrer quando os estímulos apoptóticos são removidos antes da morte, permitindo assim que as células morrem a inverter a apoptose e, potencialmente, outros mecanismos de morte. Portanto, anastasis parece envolver processos de cura fisiológicas que também poderiam sustentar as células danificadas de forma inadequada. As funções e mecanismos de anastasis ainda não estão claros, prejudicado em parte pelas ferramentas limitadas para a detecção de eventos passados ​​após a recuperação de células aparentemente saudáveis. Estratégias para detectar Anastasis permitirá estudos sobre os mecanismos fisiológicos, os perigos de células mortas-vivas em patologia da doença e possíveis terapias para modular anastasis. Aqui, descrevemos estratégias eficazes por meio de microscopia de células vivas e um biossensor caspase mamífero para identificar e rastrear anastasis em células de mamíferos.

Para estudar a reversão da apoptose, células de cultura de tecido são primeiro expostos a um estímulo de morte para desencadear a apoptose. Quando as células apresentam marcas de apoptose, o meio de cultura fresco é então aplicada para lavar o estímulo e em seguida incubar as células moribundas para permitir a recuperação (Figura 1A). Aqui, a questão-chave a ser abordado é o quão longe morrendo células cultivadas individuais podem progredir para apoptose e ainda sofrer anastasis. Esta questão pode ser d...

O termo anastase refere-se ao fenômeno no qual as células moribundas revertem um processo de suicídio celular em um estágio tardio, se reparam e, finalmente, sobrevivem. Aqui demonstramos protocolos para detectar e rastrear células que passam por anástase.

Estratégias para Rastreamento Anastasis, uma célula de sobrevivência Fenômeno que reverte apoptose

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

O objetivo geral deste procedimento é detectar e rastrear a reversão do processo de morte celular apoptótica e células cultivadas por microscopia de células vivas. As células saudáveis se espalham no substrato e contêm mitocôndrias filamentosas tubulares ao redor do núcleo. No entanto, quando as células cometem suicídio por apoptose, as células moribundas exibem características morfológicas únicas para detectar e rastrear a reversão da apoptose.As células são colocadas em placas de cultura de células com fundo de vidro. O próximo passo é realizar a coloração de células vivas para marcar mitocôndrias e núcleos. Isso permite a detecção de características morfológicas de células saudáveis e apoptóticas.Por microscopia de células vivas, as células saudáveis marcadas são então expostas a um estímulo de morte para induzir a apoptose. Quando a apoptose é detectada, as células moribundas são lavadas e depois incubadas com meio de cultura de células frescas para permitir a recuperação celular, a imagem de células vivas é usada para detectar e rastrear a reversão da apoptose e suas consequências, como reparo e sobrevivência celular, conforme mostrado pela recuperação morfológica celular e migração, respectivamente, respectivamente. A apoptose é um tipo de morte celular programada que desempenha um papel essencial para eliminar células indesejadas ou perigosas em nosso corpo.Esse processo sintetizado por células é geralmente considerado irreversível porque, uma vez iniciada, a célula morre certamente depois, no entanto, descobrimos que, de fato, a célula moribunda pode iniciar o processo de morte celular e depois sobreviver e até mesmo derivar. Eles têm possíveis etapas críticas que foram forçadas a ser o ponto de baixo retorno, como cito C, liberação, ativação baseada em caso, fragmentação nuclear e formação de corpo apoptótico. Depois de consultar especialistas gregos, adotamos um termo, uma estase, que significa ressuscitar.Para descrever o fenômeno de reversão da apoptose e outros processos de morte celular, a antese é difícil de detectar porque as células que revertem a apoptose se parecem com células pesadas normais. No entanto, por microscopia contínua de células vivas, podemos detectar que a anastase ocorre em grande parte das células. Dominar essa técnica é importante porque nos permite estudar a recriação da antese.Propusemos que a antese pode curar danos ao tecido, mas também pode permitir que as células danificadas sobrevivam e formem cânceres. Portanto, identificar mecanismos que controlam as anestesias pode nos fornecer novas abordagens para tratar doenças injetáveis, como câncer, insuficiência cardíaca e degeneração, mediando a morte celular e a sobrevida para detectar e rastrear a anastase. Após eventos apoptóticos, a microscopia de células vivas com lapso de tempo é realizada para rastrear quais células podem reverter a apoptose após a indução da morte celular transitória.Para começar, adicione um mililitro de solução de poli de licina a uma placa de cultura de células de 35 milímetros com um fundo de vidro mais fino. Após uma incubação de um minuto para revestir a superfície do vidro, aspire a solução e lave o vidro com dois mililitros de solução salina tamponada com fosfato Para preparar as células primeiro olhos de tripsina, células heela a 80 a 90% confluência Após o desprendimento das células, adicione 10 mililitros de meio a 37 graus Celsius para suspender as células. Em seguida, transferir a solução de suspensão celular para um tubo estéril de 10 mililitros para centrifugar a 160 vezes G durante um a dois minutos.Após a centrifugação, aspire cuidadosamente o meio. Não perturbe o pellet celular na parte inferior do tubo. Prossiga para ressuspender as células com 10 mililitros de meio de cultura de células por pipetagem suave.Em seguida, veja dois mililitros das células suspensas em vidro pré-revestido de 35 milímetros. Placas de cultura de células inferiores. Incube as células em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por um dia.O ajuste do número de células pode ser necessário para que as células possam atingir 80% de fluência de co no momento da imagem. A fragmentação mitocondrial e nuclear são as características morfológicas da apoptose. Para visualizar mitocôndrias e núcleos, faça a coloração pouco antes da imagem de células vivas.Comece o protocolo de coloração adicionando primeiro dois microlitros de coloração mitocondrial. Rastreador MIT vermelho 50 solução estoque micromolar e dois microlitros de coloração de DNA enganchada 3 3 3 4 2 10 miligramas por mililitro de solução estoque em um tubo de microcentrífuga estéril, adicione um mililitro do meio de cultura condicionado da placa de cultura de células ao tubo de microcentrífuga e misture bem com as manchas por pipetagem. Em seguida, adicione a mistura de volta ao prato de cultura.Depois de incubar o prato a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 20 minutos, aspire o meio e lave as células coradas três vezes com um mililitro de solução salina tamponada com fosfato ou cultura de células quentes. Em seguida, incube as células com meio de cultura de células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por mais cinco minutos. Evite o tempo de coloração prolongado, pois o sinal de fundo inespecífico das células da coloração pode aumentar devido à coloração excessiva.Após a incubação, aspire o meio, lave as células novamente e continue a incubar as células com dois mililitros de meio de cultura de células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Os componentes do microscópio devem atingir o equilíbrio térmico para evitar o desvio do foco e o deslocamento do plano XY devido à expansão térmica e contração dos componentes. Para garantir que o equilíbrio térmico seja alcançado, ligue a câmara de controle ambiental e a incubadora de platina para pré-aquecer o microscópio a 37 graus Celsius pelo menos duas horas antes do início da imagem.Em seguida, ligue o regulador de dióxido de carbono para fornecer 5% de dióxido de carbono para a câmara de controle ambiental. Quando o suprimento de dióxido de carbono não está disponível, o meio independente de dióxido de carbono pode ser usado para apoiar o crescimento celular. Antes da imagem, coloque uma gota de óleo de imersão diretamente em uma objetiva de 40 x com uma abertura numérica de 1,4.Em seguida, posicione suavemente a placa de cultura com células coradas na incubadora de estágio de 37 graus Celsius. Cubra o prato com papel alumínio frio transparente para evitar perda de água por evaporação e contaminação da amostra para realizar microscopia de contraste de interferência diferencial. Não use a tampa do prato de cultura de plástico, pois o plástico pode perturbar a polaridade da luz.Em seguida, localize e concentre-se em um grupo de células saudáveis que se espalham na superfície do vidro com mitocôndrias tubulares e núcleos redondos. Escolha as células no centro ou próximo ao centro da placa de cultura para garantir que as células estejam no mesmo plano focal uma vez no lugar, faça uma exposição rápida por microscopia confocal para determinar a intensidade mínima do laser e o tempo de exposição para obter imagens nítidas das células e suas organelas. Esta etapa é crítica.Como a luz do laser é fototóxica para as células, otimização e ajuste são necessários Para eliminar o desvio de foco, use um dispositivo de compensação de desvio de foco automático contínuo que usa um diodo emissor de luz infravermelha. Alternativamente, o plano de foco pode ser corrigido manualmente. Quando as células e o plano focal forem identificados, otimize todos os parâmetros e tire uma imagem de teste antes de iniciar a imagem de células vivas.Em seguida, inicie a imagem ao vivo para obter imagens das células saudáveis com intervalos de um minuto por 10 ciclos para induzir a apoptose. Remova o meio celular com uma pipeta transparente. Aplique um estímulo de morte celular pré-misturado com um meio de cultura de células a 37 graus Celsius no prato.Continue a cobrir o prato com papel alumínio transparente. Durante a imagem de lapso de tempo após a aplicação do estímulo de morte celular, ajuste o intervalo de tempo para obter imagens das células tratadas para detectar a apoptose, capturando características morfológicas da apoptose, como bolhas na membrana plasmática, fragmentação mitocondrial, condensação e fragmentação nuclear, condensação citoplasmática, encolhimento celular e formação de corpo apoptótico. Quando a apoptose for observada, remova o meio com o estímulo de morte celular e aplique dois mililitros de meio de cultura de células frescas para incubar as células.Continue a imagem de lapso de tempo para observar a recuperação morfológica das células e a consequência da anastase. Após a remoção de um estímulo de morte celular que morre o câncer de pulmão humano, as células H 4 46 podem reverter a apoptose. Embora as células exibam características de apoptose, como encolhimento celular, oscilação da membrana, fragmentação mitocondrial, condensação nuclear e fragmentação e apoptótica, a formação do corpo após a divisão celular da anastase pode ser anormal.Neste exemplo, em vez de dois núcleos dotter, três núcleos principais são formados após a divisão celular com formação de micronúcleos indicando alterações genéticas nas células dotter. Isso sugere que a anastase pode ser mutagênica após a exposição de uma célula a um estímulo de morte celular. Fatores pró-apoptóticos se translocam para as mitocôndrias para desencadear a liberação do citocromo C, o que leva à montagem de um protossomo e ativação baseada em gesso para demolição celular e, em seguida, morte celular mostrada.Aqui estão as células HELOC que expressam o citocromo C marcado com GFP, que se localiza nas mitocôndrias após a indução da apoptose. O citocromo C é liberado no citosol. No entanto, depois que as células são lavadas e incubadas com citosol de meio fresco, o ex citocromo C reduz de volta aos níveis normais, indicando que a anastase pode ocorrer após a liberação do citocromo C.Aqui são mostradas as células hela que expressam o biossensor baseado em CA N-E-S-D-E-V-D-Y-F-P-N-L-S, que primeiro se localiza no citosol após a indução da apoptose, conforme esperado. Y-F-P-N-L-S transloca para o núcleo devido à clivagem de DEVD por bases fundidas ativadas. No entanto, depois que o estímulo da morte é lavado e as células são incubadas com meio fresco, o YFP permanece no núcleo enquanto as células recuperam a morfologia normal, indicando que a reversão da ptose do VA pode ocorrer após a ativação da base do gesso.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar imagens de células vivas para detectar antese e suas consequências. Nesta demonstração, usamos etanol como indutor de ATO. Ao mesmo tempo, a célula pode reverter o processo de morte celular induzido por outros estímulos de morte, como teso DMSO e esporina A luz fluorescente é fototóica para as células, de modo que é fundamental minimizar as noites que aquecem uma amostra durante a imagem das células vivas.O processo de apoptose e análise noturna depende de atividades sensíveis à temperatura e semáticas. Portanto, é importante manter as células na mesma temperatura do experimento para garantir resultados repetíveis.

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