Name: Estratégias para Rastreamento Anastasis, uma célula de sobrevivência Fenômeno que reverte apoptose (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Aprenda a detectar e rastrear anastase em células mamíferas usando microscopia de células vivas e biossensores. Este método permite observar a reversão da apoptose e suas consequências para a biologia celular.

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Agradecemos Rev. Dr. Ralph Bohlmann e Rev. Dr. James Voelz por sugerir a palavra &quot;anastasis&quot; para descrever a reversão da apoptose; Douglas R. Green para as células HeLa que expressam estavelmente o citocromo c -GFP; Charles M. Rudin e Eric E. Gardner para H446 células; Lamb Heather de assistência em desenho dos desenhos animados para o vídeo; Yee Hui Yeo para valiosa discussão deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado por uma Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), a Bolsa de Estudos Dr. Walter Szeto Memorial (HLT), bolsa Fulbright 007-2009 (HLT), Life Science Foundation Research fellowship (HLT), NIH concede NS037402 (JMH) e NS083373 (JMH) e Universidade Comitê Grants do Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang é um Shurl e Kay Curci Fundação Fellow da Fundação Life Sciences Research.

Os autores não têm nada a divulgar.

Anastasis se refere ao fenômeno em que as células que tenham activado via de morte celular reverter posteriormente o processo de morrer e sobreviver. Aqui, nós demonstramos que imagens de células vivas podem ser usados ​​para confirmar que as mesmas células individuais de fato pode reverter processo de morte celular por apoptose numa fase tardia, e, em seguida, continuar a sobreviver e reproduzir. Os nossos protocolos descrever várias condições de tratamento específicas do tipo de células optimizado para induzir apoptos...

A apoptose (palavra grega para &quot;cair para a morte&quot;) é geralmente aceite que é um processo de uma maneira que termina em suicídio celular 1-7. Perturbação genética de pró-morte genes resulta na sobrevivência de células extra que de outra forma morrem em animais inteiros, incluindo as células que já iniciadas 8,9 a via de apoptose. Da mesma forma, as manipulações genéticas permitem que as células de mamíferos saudáveis ​​que artificialmente mostrar &quot;me come&quot; sinais ou que perdem aderência à sua matriz extracelular para escapar da morte por fagocitose de células inteiras ou entosis, respectivamente 10,11. No entanto, nós e outros mostraram que, sem manipulação genética de células de mamíferos saudáveis ​​normais e linhas de células também pode recuperar desde as fases iniciais da apoptose 12-15. Usando ferramentas para rastrear células individuais, demonstramos ainda mais a recuperação de estágios finais de apoptose 12,13, depois que as células passaram checkpoints importante que típicoly marcar o &quot;ponto de não retorno&quot; 2-6. Estes pontos de controlo de fase de apoptose tardia incluem libertação mitocondrial de citocromo c, a activação de caspases, fragmentação nuclear, e formação de corpos apoptóticos. Adotamos uma palavra composta grega &quot;anastasis&quot;, que significa &quot;subindo para a vida&quot;, para descrever essa inversão de apoptose à beira da morte celular 2-6. A não ser que todo o processo de morrer recuperação é observado por imagens de células vivas, é um desafio para distinguir as células que sofreram anastasis a partir de células que nunca experimentaram eventos apoptóticos. Décadas de trabalho têm revelado que as características morfológicas de suicídio celular por apoptose são movidos por eventos bioquímicos e moleculares conservados evolutivamente 16-19. Estes eventos promover a auto-destruição das células que regulam os processos de desenvolvimento e homeostáticos em organismos unicelulares e pluricelulares, eliminando danificado ou dcélulas angerous 16-19. Enquanto as células em apoptose pode ser facilmente distinguidos por manifestações morfológicas, bioquímicas e moleculares padronizados de apoptose 1,5,6,16,20, atualmente não há nenhum marcador conhecido específico para anastasis 12,13. É importante notar que as células que sofreram anastasis parecem ser as células saudáveis ​​normais, e as células que começam a inversão apoptose apenas aparecem como células moribundas apoptóticos 12,13. Assim, novas ferramentas são necessárias para concluir com segurança que uma determinada célula sobreviver já havia experimentado processos apoptóticos ativos. A apoptose é geralmente assumido como uma cascata irreversível porque é um processo de destruição rápida e maciça. Embora possa demorar alguns minutos para dias para algumas células para iniciar a apoptose, uma vez que as mitocôndrias têm lançado fatores apoptogénicas como citocromo c para o citosol 21,22, caspases pode ser ativado dentro de 5 minutos 23,24, seguido por citoplasmática econdensação nuclear dentro de 10 min 25-27, e morte celular pouco depois 25-27. Caspases activadas orquestrar a apoptose por clivagem e inactivação de componentes estruturais e funcionais importantes para o propósito de demolição 2,28 celular, tais como o inibidor da endonuclease DFF45 / ICAD 29,30. Caspases também ativar fatores pró-apoptóticos, como BID membro família Bcl-2, que transloca para a mitocôndria para promover a liberação mitocondrial do citocromo c 31,32. Atividade Caspase também resulta em exposição na superfície celular de phosphatidylserine como um &quot;me comer&quot; sinal para a promoção engulfment de morrer células por macrófagos ou células vizinhas através de fagocitose 33. Além disso, os eventos apoptóticos tornar mitocôndrias disfuncionais, interrompendo bioenergética celular e metabolismo 34,35,36. Assim, a recuperação de tal destruição parece intuitivamente improvável. Contrariamente ao original esperarções, as células podem reverter o processo de morte celular por apoptose, mesmo numa fase tardia. Ao monitorar continuamente o destino de morrer células em cultura, observou-se a reversibilidade da fase de apoptose tardia em um intervalo de células primárias e linhas de células 12,13. A remoção do estímulo morte permitiu a recuperação das características evidentes de apoptose, tais como a fragmentação mitocondrial, a condensação da cromatina, danos no ADN, de vesículas de membrana do plasma, a exposição da superfície celular de fosfatidilserina, a libertação de citocromo c mitocondrial, activação de caspases, fragmentação nuclear, encolhimento da célula, e formação de corpos apoptóticos. Estas observações levantam questões sem respostas sobre as funções, as consequências, e os mecanismos de anastasis. Para responder a estas perguntas, um pré-requisito é para identificar com segurança as células que sofreram anastasis. Aqui, descrevemos os métodos de microscopia ao vivo e um biossensor caspase para detectar células que já inverteu apoptose fase tardia e then sobreviveu.

<table><tbody><tr><td>Microscopia confocal LSM780</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prato de cultura com fundo de vidro</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Transparente CultFoi</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1116-084</td><td></td></tr><tr><td>CO2 meio independente</td><td>Life Technologies</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker</td><td>Life Technologies</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Red CMXRos</td><td>Life Technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Anexina V marcada com fluorescência Biovision</td><td></td><td>K201</td><td></td></tr></tbody></table>

estratégias para rastreamento anastasis, uma célula de sobrevivência fenômeno que reverte apoptose

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (grego para &quot;ressuscitar para a vida&quot;) refere-se a recuperação de células que morrem. Antes essas células se recuperar, eles passaram por checkpoints importantes da apoptose, incluindo fragmentação mitocondrial, liberação de citocromo c para o citosol, ativação de caspases, condensação da cromatina, danos no DNA, fragmentação nuclear, blebbing membrana plasmática, o encolhimento celular, exposição da superfície celular de fosfatidilserina, e formação de corpos apoptóticos. Anastasis pode ocorrer quando os estímulos apoptóticos são removidos antes da morte, permitindo assim que as células morrem a inverter a apoptose e, potencialmente, outros mecanismos de morte. Portanto, anastasis parece envolver processos de cura fisiológicas que também poderiam sustentar as células danificadas de forma inadequada. As funções e mecanismos de anastasis ainda não estão claros, prejudicado em parte pelas ferramentas limitadas para a detecção de eventos passados ​​após a recuperação de células aparentemente saudáveis. Estratégias para detectar Anastasis permitirá estudos sobre os mecanismos fisiológicos, os perigos de células mortas-vivas em patologia da doença e possíveis terapias para modular anastasis. Aqui, descrevemos estratégias eficazes por meio de microscopia de células vivas e um biossensor caspase mamífero para identificar e rastrear anastasis em células de mamíferos.

Para estudar a reversão da apoptose, células de cultura de tecido são primeiro expostos a um estímulo de morte para desencadear a apoptose. Quando as células apresentam marcas de apoptose, o meio de cultura fresco é então aplicada para lavar o estímulo e em seguida incubar as células moribundas para permitir a recuperação (Figura 1A). Aqui, a questão-chave a ser abordado é o quão longe morrendo células cultivadas individuais podem progredir para apoptose e ainda sofrer anastasis. Esta questão pode ser d...

O termo anastase refere-se ao fenômeno no qual as células moribundas revertem um processo de suicídio celular em um estágio tardio, se reparam e, finalmente, sobrevivem. Aqui demonstramos protocolos para detectar e rastrear células que passam por anástase.

Estratégias para Rastreamento Anastasis, uma célula de sobrevivência Fenômeno que reverte apoptose

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

O objetivo geral deste procedimento é detectar e rastrear a reversão do processo de morte celular apoptótica e células cultivadas por microscopia de células vivas. As células saudáveis se espalham no substrato e contêm mitocôndrias filamentosas tubulares ao redor do núcleo. No entanto, quando as células cometem suicídio por apoptose, as células moribundas exibem características morfológicas únicas para detectar e rastrear a reversão da apoptose.As células são colocadas em placas de cultura de células com fundo de vidro. O próximo passo é realizar a coloração de células vivas para marcar mitocôndrias e núcleos. Isso permite a detecção de características morfológicas de células saudáveis e apoptóticas.Por microscopia de células vivas, as células saudáveis marcadas são então expostas a um estímulo de morte para induzir a apoptose. Quando a apoptose é detectada, as células moribundas são lavadas e depois incubadas com meio de cultura de células frescas para permitir a recuperação celular, a imagem de células vivas é usada para detectar e rastrear a reversão da apoptose e suas consequências, como reparo e sobrevivência celular, conforme mostrado pela recuperação morfológica celular e mi

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Biology

Biologia

Apresenta-se um protocolo simples de visualizar regiões de morte celular programada (PCD) em embriões de ratinho e de diferenciação estaminais embrionárias de culturas (ES) de células utilizando um corante altamente solúvel chamada Lyso Tracker.

Uso de Lyso Tracker para detectar a morte celular programada em embriões e diferenciação das células-tronco embrionárias

Contribuição do factor de remodelação da cromatina ACF para E4orf4 morte celular induzida foi medida. O protocolo inclui a selecção de clones de células na qual o tratamento doxiciclina induz knockdown condicional do subunidades ACF Acf1 e SNF2h, e utilização do ensaio para medir DAPI E4orf4 morte celular induzida em linhas celulares indutíveis.

Preparação de linhagens de células para Knockdown condicional da expressão gênica e mensuração dos efeitos Knockdown em E4orf4 morte celular induzida por

Este protocolo descreve o uso de bromodesoxiuridina (BrdU) para permitir a absorção de seguimento temporais de células que estavam na fase S de um determinado ponto no tempo. A adição de corantes de ADN e rotulagem anticorpo facilita a análise detalhada do destino das células em fase S em momentos posteriores.

Acompanhamento Temporal de progressão do ciclo celular utilizando citometria de fluxo, sem a necessidade de sincronização

Anastasis é tecnicamente desafiador para detectar na vivo porque as células que reverteram o processo de morte celular podem ser morfologicamente indistinguíveis de células saudáveis normais. Aqui descrevemos os protocolos para detecção e monitoramento de células que passam por anastasis em animais vivos, usando nosso sistema de biosensor recentemente desenvolvido na vivo CaspaseTracker.

Detecção de Anastasis na Vivo por CaspaseTracker Biosensor

Aqui, apresentamos um protocolo para a determinação de eventos de sinalização intracelular induzidos em células viáveis por interação física com células mortas ou moribundas adjacentes. O protocolo se concentra em eventos de sinalização induzidos pelo reconhecimento mediado por receptor das células mortas, em oposição à sua captação fagocítica ou liberação de mediadores solúveis.

Identificação de sinalização intracelular Eventos induzida em células viáveis ​​pela interação com as células vizinhas Submetidos a apoptose celular Morte

Imagem latente da viver-pilha fornece uma riqueza de informações sobre células únicas ou populações inteiras que é inatingível por célula fixa imagem sozinho. Aqui, viver-pilha protocolos de imagens para avaliar as decisões de destino célula após o tratamento com a droga antimitótica paclitaxel são descritos.

A longo prazo viver-pilha de imagem para avaliar o destino da célula em resposta ao Paclitaxel

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar células de câncer de mama apoptotic classificando fluorescência-ativado da pilha e detectar ainda mais a transição de células-tronco de câncer de mama para células de células-tronco, como câncer de mama após a reversão de apoptose por citometria de fluxo.

Fluxo Cytometric deteção da recém-formada mama câncer células-tronco células após a reversão de apoptose

O método apresentado combina a análise quantitativa das rupturas da dobro-Costa do ADN (DSBs), a distribuição do ciclo de pilha e o apoptose para permitir a avaliação ciclo-específica da pilha da indução e do reparo de DSB assim como as conseqüências da falha do reparo.

Medição específica do ciclo celular de γH2AX e apoptose após estresse genotóxico por citometria de fluxo

Este protocolo descreve um método para medição em tempo real dos fluxos de cálcio mitocondrial por imagem fluorescente. O método se aproveita de uma circular permutated sensor de cálcio YFP baseado excitação dupla raciométrica (raciométrica pericam-mt) seletivamente expressos na mitocôndria.

Mudanças Dinâmicas de monitoramento dos níveis de cálcio mitocondrial durante a apoptose através de um sensor de cálcio geneticamente codificado

Um método preciso para a avaliação da morte celular é descrito. O protocolo convencional melhora a anexina V / iodeto de propídio (PI) protocolos, que apresentam até 40% de falsos-positivos eventos em linhagens celulares e pilhas de uma ampla gama de modelos animais.

Modificado anexina V / propídio Assay Apoptose Iodeto para avaliação rigorosa da morte celular

Aprenda a detectar e rastrear anastase em células mamíferas usando microscopia de células vivas e biossensores. Este método permite observar a reversão da apoptose e suas consequências para a biologia celular.

Estratégias para Rastreamento Anastasis, uma célula de sobrevivência Fenômeno que reverte apoptose

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