Name: Isolamento e Cultura de Dissociated neurônios sensoriais de Chick Embriões (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar neurônios sensoriais dissociados de embriões de galinha. Este método rápido e confiável permite estudar biologia celular neuronal com controle experimental preciso em neurociência.

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Gostaríamos de agradecer a Alison Philbrook, Belinda Barbagallo e Michael Francis para comentários perspicazes sobre este papel. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada por um prêmio AREA R15 1R15NS070172-01A1 atribuído a MLL.

1. Coverslip Preparação: lavagem ácida e Bake <ol><li> Pelo menos 2 dias antes da dissecção (passo 2), começam as seguintes etapas para preparar lamelas. Execute o passo de lavagem de ácido para remover óleos e lamelas completamente limpas. </li><li> Lamelas de carga em suporte de porcelana que posiciona verticalmente lamelas e impede que eles se toquem. Submergir titular e lamelas em recipiente de vidro cheio histologia com ácido clorídrico 2 M (HCl). Alternativamente, se o titular de porcelana não está disponível, espalhe ~ 20 lamelas horizontalmente para cobrir o fundo de 100 milímetros de vidro placa de Petri e submergir lamelas em HCl 2 M. </li><li> Coloque recipiente de vidro (com lamelas submersas em ácido) na tabela de balancim em hotte e permitir agitação suave durante pelo menos 5 horas à temperatura ambiente. Alternativamente, lavagem ácida lamelas durante a noite sob as mesmas condições. </li><li> Lavar as lamelas com H2O destilada (dH2O), transferindo o suporte carregado porcelanacom lamelas de HCl 2 M para um recipiente de vidro limpo histologia preenchido com dH2O Alternativamente, decantar M HCl 2 de vidro placa de Petri com lamelas e encha com dH 2 O. </li><li> Lave por decantação dH2O novamente e recarregar recipiente de vidro com dH fresco 2 O. Repetir para um total de três lavagens rápidas. </li><li> Comece já esquema de lavagem retornando recipiente de vidro (com lamelas e dH 2 O) na cadeira de balanço. Permitir a agitação suave durante 10-30 minutos à temperatura ambiente. Então, decantar dH2O e adicionar dH fresco 2 O. Repita o procedimento para um total de pelo menos dez lavagens. Como alternativa, continuar a lavar durante a noite. </li><li> Coloque lamelas foram lavadas em forno pré-aquecido a 350 ° C. Se utilizar o suporte de porcelana, remova o suporte de dH 2 recipiente de vidro O-preenchido e coloque titular com lamelas diretamente no forno. Se estiver usando uma placa de Petri de vidro, decantar dH2O e coloque o prato de vidro com lamelas na furnace. </li><li> Asse lamelas durante pelo menos cinco horas ou durante a noite a 350 ° C. </li><li> Após o cozimento estiver concluída, remova lamelas do suporte de porcelana com uma pinça fina e coloque em estéril 100 milímetros de vidro placa de Petri. Deixe lamelas que não foram originalmente colocados no suporte de porcelana no vidro placa de Petri. </li></ol> 2. Pintinho dissecção e isolamento da GDH <ol><li> Remover fértil, encenado White Leghorn pintcher da incubadora (realizada no 37-38,5 ° C com balanço suave). NOTA: estudos anteriores usaram dia embrionário 7-10 para isolamento de GDH 2,8,11-13,16. </li><li> Coloque ovo selecionado na capela de fluxo laminar. Realizar todos os procedimentos listados abaixo, sob condições assépticas na câmara de fluxo laminar, com soluções e instrumentos esterilizados. Pré-quentes todas as soluções em um banho de água a 37 ° C. </li><li> Rachadura conteúdo dos ovos e coloque em um plástico 100 milímetros placa de Petri. Use uma pinça padrão para transferência de embriões para outra 100 milímetros placa de Petri. </li><li&gt; Com uma pipeta Pasteur, adicione aquecido 1x PBS a placa de Petri para manter o tecido molhado. Decapitar embrião apertando o pescoço com uma pinça fina. Transferir para outro corpo limpo 100 milímetros placa de Petri. </li><li> Adicionar F12HS10 quente (F12 de Ham, HEPES 10 mM, 100 unidades / ml de penicilina, 0,1 mg / ml de estreptomicina, 10% de soro fetal bovino) a repartir com pipeta de Pasteur a manter o tecido molhado. Use fórceps para posicionar embrião no seu lado dorsal (Figura 1A). </li><li> Coloque 100 milímetros de plástico placa de Petri contendo tecido embrionário em um microscópio binocular estereoscópica dissecação em capela de fluxo laminar. Use uma pinça fina para fazer uma incisão na linha vertical a partir da cauda para o pescoço, apertando a derme em desenvolvimento para expor o coração, pulmão e outros órgãos. Como alternativa, fazer uma série de pequenas lágrimas para expor os órgãos internos. </li><li> Suavemente utilizar dois conjuntos de pinça fina estéreis para: a) compreender o pescoço e b) compreender a aorta ou outro tecido imediatamente superior ao coração e ao puxar para a cauda,evisceração do animal. </li><li> Aplicar F12HS10 quente com pipeta Pasteur para o tecido. Use uma pinça para remover todos os restantes órgãos cardiovasculares, respiratórias ou digestivas para expor as costelas em desenvolvimento, coluna vertebral e GDH (Figuras 1B-1D). </li><li> Sob o microscópio de dissecação, use uma pinça fina para remover mais órgãos e recolher GDH ao longo de ambos os lados da coluna vertebral lombar, inferior das costelas. Colete GDHs arrancando GDHs intactas do embrião. Aperte e cortar as raízes que chegam do DRG para a medula espinhal e agarrando o nervo desenvolvimento que chega do DRG para a periferia, ou vice-versa. </li><li> Coloque GDHs intactas em uma placa de cultura 35 milímetros cheio de F12HS10 quente. Remova qualquer excesso de tecido, como a dorsal ou raízes ventrais que possam ter aderido a GDH, a partir dos GDH intactas em 35 milímetros prato de compressão com uma pinça fina. </li><li> Para obter GDHs superiores para a região lombar, retire a metade ventral do tórax e Cervicoluna vertebral cal. Isso é feito por meio de corte na coluna vertebral em desenvolvimento perpendicular ao eixo da medula espinal na região cervical superior e outro corte na região lombar superior. Em seguida, fazer os cortes paralelos ao eixo da medula espinal ao longo do lado esquerdo da coluna vertebral e da direita. Levante a metade ventral da coluna vertebral do embrião, o que expõe os expõe a medula espinhal (Figuras 1E-1F). </li><li> Para permitir o acesso fácil para os GDH, retire a medula espinhal torácica e cervical, segurando a medula espinhal com uma pinça fina. Utilizar as pinças para levantar a medula da coluna vertebral. Como aproximação, a medula espinal torácica é ao nível de costelas e a área do colo do útero é superior à das nervuras. </li><li> Colete torácica intacta e GDH cervical com uma pinça fina e colocá-los em F12HS10 quente com outros GDH. Retire o excesso de tecido que podem aderir a GDH. </li><li> Lavar interior de uma nova pipeta Pasteur de vidro com F12HS10 para ajudarevitar GDH de degola para paredes de pipeta. Use pipeta lavado para transferir todos os GDH e F12HS10 de pequena placa de Petri a uma estéril tubo de 15 ml e proceder de imediato para a etapa 3. NOTA: Adicionais embriões podem ser dissecados para aumentar o número de GDH. GDH deveria ser mantido na F12HS10 a 37 ° C até estar pronto para a etapa 3. </li></ol> 3. dissociação, enriquecendo, e Cultivo DRG Neurônios - Parte 1 <ol><li> Coloque o tubo cônico com GDHs intactas para centrífuga e girar suavemente (200 xg) por 2-3 min. Confirme que GDHs ter afundado ao fundo do tubo. Se não, girar novamente. </li><li> Com uma pipeta, remova cuidadosamente F12HS10, deixando DRG pellet imperturbável. Adicionam-se 2 ml de 1x de cálcio e magnésio livres (CMF) PBS, desalojando o sedimento de DRG. Girar novamente e retire CMF PBS, deixando a pelota DRG intacta. Repetir esta etapa de lavagem para um total de três lavagens para remover o soro fetal bovino em F12HS10, o que iria interferir com a digestão da tripsina na próxima etapa. </li><li> Adicionam-se 2 ml de tripsina aquecida ao tubo de 15 ml contendo 2 ml de PBS e CMF DRGs. Coloque o tubo de 37 ° C banho-maria durante 10-15 minutos para digerir GDH em células dissociadas. </li><li> Durante a incubação, fazer F12H + suplemento contendo meio (F12 de Ham, 10 mM de HEPES a 100 unidades / ml de penicilina, 0,1 mg / ml de estreptomicina, 10 ng / ml de NT3, 10 ng / mL de NGF, 200 mM de L-glutamina e N2) e aquecer em 37 ° C num banho de água. Tipicamente, 10 ml de meio total é suficiente para 4-5 pratos de 35 mm de neurónios sensoriais primários. Também começar o descongelamento da laminina-1 para lamelas de revestimento (passo 4). </li><li> GDH suavemente triturado em solução de tripsina com pipeta P1000 e inspecionar visualmente a ausência de GDH intactas. Continue trituração até GDHs intactas já não são vistos a olho nu e / ou permitir mais tempo de incubação de tripsina em 37 ° C banho-maria até GDHs intactas são dissociados. Para proteger os neurônios DRG de danos, evitar bolhas de ar durante a trituração e limitar digestão com tripsina a &lt;30 min. </li><li> Centrifugtubo e contendo GDHs dissociados e tripsina a 200 xg por 3-5 min para formar pelotas. Girar mais longo se necessário, até que se formou sedimento. </li><li> Aspirar cuidadosamente tripsina sem interromper pellet. Adicionar 2 ml de F12HS10 para sedimentar. Gentilmente triturar GDH com uma ponta de pipeta P1000. </li><li> Transferir todo o conteúdo do tubo de 15 ml em 100 milímetros placa de cultura. Lavar o tubo com 8 ml F12HS10 e transferi-lo para o prato de cultura, 2 ml de cada vez, para um total de 10 ml. Esta etapa de lavagem permite a recolha de células que podem ter permanecido adere às paredes do tubo. </li><li> Coloque 100 mm prato de cultura (com 10 ml F12HS10 e células dissociadas DRG) em atmosfera húmida a 37 ° C durante 3 horas incubadora. NOTA: CO 2, não é necessária na incubadora porque buffers HEPES pH do meio, na ausência de CO 2. Durante a incubação, as células gliais se ligam a superfície de cultura de tecidos de plástico e tendem a aderir neurónios frouxamente a cama da glia. </li></ol> 4 Ácido Coating LavadoLamelas e cozidas com laminina-1 <ol><li> Descongele alíquotas estéreis congelado laminina-1 no gelo. </li><li> Sob condições estéreis, adicionar 1 ml de PBS estéril 1x a alíquota de 50 ul da laminina-1. </li><li> Utilizar um espectrofotómetro para se obter um valor de absorção de laminina-1 a 280 nm. Utilizar este valor na seguinte equação para determinar a concentração de laminina-1. </li></ol> ABS 280 = (concentração mg / ml) * (coeficiente de extinção da proteína) O coeficiente de extinção para a laminina-1 é de 0,86. <ol start="4"><li> Sob condições de esterilidade, diluído laminina-1 com 1X PBS para se obter as concentrações de 1 mg / ml e 20 mg / ml. Usar estas duas concentrações aplicadas de laminina-1 para atingir uma diferença de dez vezes da laminina-1 ligado a lamela (30 ng / cm 2 e 300 ng / cm 2, respectivamente), após incubação 7,8,10. </li><li> Em uma capela de fluxo laminar, use uma pinça fina para colocar uma lavada com ácido e cozido coverslip no fundo de um prato de cultura de 35 mm. Repita conforme necessário para obter o número de pratos necessários. </li><li> Apresentar as lamelas a luz UV por 20-30 min para garantir ainda mais a esterilização. Manter tampa prato, durante este passo. </li><li> Adicionar 400 mL de preparadas laminina-1 para cada lamela de vidro. Use a ponta da pipeta para espalhar laminina-1 para garantir a cobertura completa da lamela. A tensão superficial vai permitir que a laminina-1 permaneça na lamela e não espalhada na parte inferior da placa de cultura, que é necessária. </li><li> Colocar a tampa no prato e permitir que a laminina-1 a incubar durante 2-3 horas à temperatura ambiente (3 horas é o ideal). </li><li> Depois de laminina-1 de incubação, lavar lamelas usando uma técnica asséptica com PBS estéril em capela de fluxo laminar. Remova a solução em lamela e adicionar 400 mL de PBS. Espere 5-10 min. Repita o procedimento para um total de 3 lavagens. </li><li> Deixe PBS em lamela após a última lavagem. Não quebrar a tensão superficial durante a lavagem e não permitem lamelas a secar. Letampa av em até estar pronto para a chapa neurônios dissociados na coverlip. </li></ol> 5. dissociação, enriquecendo, e Cultivo DRG Neurônios - Parte 2 <ol><li> Após a incubação, usar uma pipeta estéril 10 mL para lavar suavemente a parte inferior da placa de 100 mm contendo células DRG dissociados. Segure prato em ~ 45 ° de ângulo, puxe ~ 7 ml de F12HS10 com auxílio de pipeta, em seguida, expulsar gentilmente 7 ml para cerca de 1/3 do prato. Repita 5x, deslocando suavemente neurônios. </li><li> Rodar prato e repetir procedimento de lavagem, para outros seis lavagens, por outro 1/3 do prato. Repita o procedimento novamente para 1/3 restante do prato. Desta forma, lavar cuidadosamente toda a parte inferior do prato com F12HS10 para remover os neurónios. </li><li> Usando mesma pipeta, transferir F12HS10 contendo neurônios de prato de 100 mm a 15 tubo cônico. Centrifuga-se durante 5-10 minutos a 200 g para sedimentar as células. </li><li> Remover F12HS10, deixando sedimento imperturbável. Ressuspender o sedimento com 2 mL de F12H aquecida + suplementos. </li><li&gt; Use um hemocitômetro para determinar a densidade celular. </li><li> Dilui-se as células conforme necessário com F12H + suplementos para obter a concentração desejada chapeamento (120.000 células / ml para lamelas revestidas com 1 ug / ml de células de laminina-1 e 40000 / ml para lamelas revestidas com 20 ug / ml de laminina-1 8,16). </li><li> Remover PBS de lamelas revestido de laminina e coloque imediatamente 400 mL de células em lamelas. Transferir cuidadosamente prato para um umidificado, 37 ° C de cultura de células incubadora. Deixa-se incubar durante pelo menos 1 hora e até 3 horas para permitir que os neurónios para aderir à laminina-1. </li><li> Em condições estéreis, inundar suavemente 35 milímetros pratos contendo neurônios com 1,6 ml de F12H + suplementos. NOTA: Neste momento, a tensão superficial na lamela pode ser quebrado. Os neurônios têm suficientemente respeitado laminina-1 na lamela. </li><li> Voltar células para incubadora e incubar durante a noite. Realizar experimentos tais como imunocitoquímica no dia seguinte. </li></ol> 6.mmunocytochemistry <ol><li> Antes de imunocitoquímica, a solução fixadora quente (paraformaldeído a 4%, sacarose a 30% 2X PBS) em 37 ° C num banho de água. NOTA: Antes de fixar as células, trata-se com vários reagentes, como a netrina-1, Mn 2 +, sonic hedgehog, semaforina, e efrina 16,29-31. </li><li> Lentamente remover 1 ml dos 2 ml de F12H + suplementos do prato de cultura. Suavemente adicionar 1 ml de solução fixadora aquecido. Deixa-se incubar à temperatura ambiente durante 10-15 min. </li><li> Remova cuidadosamente a solução fixadora e adicionar 2 ml de PBS. Aplicar a solução para a borda do prato, evitando possível desalojamento de células fixas devido à aplicação de PBS. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Repetir lavagem com PBS para um total de cinco lavagens. Não permitir que as células secar durante qualquer passo de imunocitoquímica. </li><li> Remover PBS. Aplicar 1 ml de solução de bloqueio (0,1% de Triton-X, 1X PBS, 5% de soro normal de cabra). Incubar durante 1 h à temperatura ambiente. Alternativamente, para corar as moléculas de superfície, Não use Triton-X em solução 8 bloqueio. </li><li> Dilui-se os anticorpos primários em solução de acordo com a recomendação do fabricante bloqueio. Use 1: 500 para anticorpos contra NCAM e ativado β1 integrinas 16. Retirar solução de bloqueio, adicionar 1 ml de uma solução de anticorpo primário e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Remover solução de anticorpo primário e adicionar 2 ml de 1X PBS. Incubar durante 5-10 min à temperatura ambiente. Repetir para um total de 4 lavagens com PBS. Lavagens pode ser prorrogado, se necessário. </li><li> Dilui-se o anticorpo secundário de 1: 1000 em solução de bloqueio. Remover PBS, adicionar 1 ml de solução de anticorpo secundário e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. NOTA: anticorpos secundários são sensíveis à luz. Manter as soluções e células no escuro, tanto quanto possível a partir deste ponto em diante. </li><li> Remova a solução anticorpo secundário e enxaguar 5x com 1x PBS, como feito anteriormente. </li><li> Aplicar ~ 60-80 ul de FluoromountG sobre uma lâmina de microscópio. Usando uma pinça fina, levante suavemente lamela de prato e menor lamela em Fluoromount G em lâmina de microscópio. Evite bolhas de ar. </li><li> Loja desliza horizontalmente, a 4 ° C no escuro. Após 12-24 horas, Fluormount G polimerizará e lamela será firmemente ligado a lâmina de microscópio. Células imagem após esta etapa de polimerização está completa. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui apresentamos protocolos detalhados para isolar e cultura dissociada neurônios sensoriais de um embrião de galinha. Este procedimento gera uma população enriquecida de neurónios em crescimento in vitro de forma robusta 7,8,10,16. Numerosas técnicas celulares e moleculares podem ser aplicados a essas culturas de neurónios, incluindo a imunocitoquímica, o qual é descrito aqui. Este protocolo foi recentemente utilizado para avaliar quantitativamente a intensidade das integrinas ativados imunomarcada...

Os neurônios são células complexas que levam informações essenciais para uma variedade de funções, incluindo a sensação, visão, movimento motor, aprendizagem e memória. Único a partir de outros tipos de células, os neurônios estender os processos de braço-like, chamadas axônios, para formar rodovias neurais essenciais para a comunicação. Durante o desenvolvimento especializada compartimentos localizados na ponta dos axônios em crescimento, chamados cones de crescimento, navegar através de um concerto de sinais extracelulares para liderar o axônio para o seu destino apropriado. Os mecanismos moleculares que estão na base intrincadas do cone de crescimento de navegação não são completamente compreendidos. Para entender melhor esses mecanismos, os pesquisadores usaram modelos de cultura de células para estudar neurônios em um ambiente vitro definido e simplificado. Estudar neurônios em cultura 1 levou a avanços significativos em nossa compreensão da biologia de células neuronais, incluindo: a diferenciação neuronal 2, a dinâmica do citoesqueleto, endocitose e tráfico, dendritoregulação 3,4, a regeneração axonal 5, e as condições clínicas, tais como neuropatias 6. Além disso, os neurónios em cultura são altamente susceptível a uma vasta gama de técnicas de pesquisa, incluindo a imunocitoquímica, de células da superfície de co-imunoprecipitação, transferência Western, transfecção, ARNi, e imagens em tempo real, tais como análise de Timelapse cone de crescimento motilidade. Assim, a cultura de neurônios primários é uma abordagem poderosa para elucidar vários aspectos da biologia celular dos neurônios. O modelo de cultura celular fornece investigadores com controle detalhado sobre as condições ambientais e variáveis. Por exemplo, o substrato sobre o qual os neurónios foram semeadas (e crescer em cima) pode ser facilmente manipulado. Aqui, nós fornecemos instruções detalhadas para a geração de dois substratos distintos, um com uma baixa concentração de laminina-1 e outro com concentrações de saturação de laminina-1. Surpreendentemente, concentrações diferentes da mesma molécula pode ter efeitos dramáticossobre o estado interno de neurónios, bem como a sua composição da superfície da célula. Por exemplo, os níveis intracelulares de cAMP e níveis de superfície de integrinas são significativamente diferentes nos neurónios plaqueados sobre estes dois substratos 7,8. Outros estudos têm mostrado que outras moléculas, incluindo fibronectina e proteoglicanos de sulfato de condroitina, o impacto da expressão de moléculas da superfície celular e a motilidade neuronal 7-11. Além disso, as moléculas solúveis, tais como neurotrofinas e neurotropins também afectar a composição da membrana celular e a motilidade neuronal e 12-16 podem ser facilmente e com precisão manipulado em um modelo de cultura de células. Aqui, descrevemos os métodos para isolar e cultura dissociada neurônios sensoriais a partir de embriões de galinha. Este procedimento tem sido usado para fazer avanços significativos em neurobiologia, incluindo axônio conseqüência 5,7,8,10,11,16-21 e foi modificado a partir de um procedimento destinado a isolar as células ganglionares 22. Temvárias vantagens para esta abordagem. Em primeiro lugar, muitas características da garota gânglio da raiz dorsal (DRG) desenvolvimento estão bem caracterizados, incluindo o período de tempo para o parto, a extensão do axônio, e expressão da proteína perfis 2,23-28, proporcionando assim uma base instrutiva sobre a qual construir informativo experimentos in vitro. Em segundo lugar, dissociado culturas neuronais permitem ao investigador para estudar mais directa em comparação com os neurónios de abordagens alternativas que utilizam explantes DRG intactos (que contêm neurónios e células não neuronais) e / ou culturas mistas que contêm ambos os neurónios dissociados e células não-neuronais. Em terceiro lugar, o procedimento descrito aqui é simples, barato e passível de graduação. Portanto, essa técnica pode ser usada para pesquisa, bem como para fins de ensino. Além disso, pequenas variações deste protocolo deve permitir a purificação rápida, alto rendimento de neurônios a partir de outras fontes de GDH. Por exemplo, este procedimento pode ser modificado para proporcionar neuronalmente enriched culturas de outros tecidos, tais como prosencéfalo embrionário ou da medula espinal. Imunocitoquímica protocolos foram optimizados para estas culturas neuronais dissociadas e são descritos em detalhe aqui. O procedimento para a imunocitoquímica dupla contra molécula de adesão de células neurais (NCAM) e integrinas β1 é fornecido. Os dados gerados a partir destes métodos imunocitoquímicos foram utilizados para examinar o padrão espacial e intensidade de várias moléculas em neurónios cultivados 8,16.

<table><tbody><tr><td>Placas de cultura pequenas estéreis (35 mm)</td><td>Placas</td><td>de</td> cultura grandes estéreis 430165 <td></td></tr><tr><td>(100 mm)</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri grandes estéreis (100 mm)</td><td>VWR</td><td>89000-302</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidro (100 mm)</td><td>VWR</td><td>D108962</td><td></td></tr><tr><td>Pinça fina</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps padrão</td><td>Fine Science Tools</td><td>1100-12</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips (22 x 22 mm)</td><td>Fisher</td><td>12 518 105K</td><td>0.13-0.17 mm de espessura é ideal para microscopia</td></tr><tr><td>Suporte de lamínula de porcelana</td><td>Thomas scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>use alíquotas de 50 ml por 500 ml de mídia F12 da Ham</td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>VW3204-1</td><td>use a 2 M, pode ser usado duas vezes antes de descartar</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>use solução de NaCl 5 M para solução estoque de laminina-1</td></tr><tr><td>Laminin-1</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td>Adicione 72 &micro; l de 5 M NaCl estéril e alíquota em 50 &micro; l</td></tr><tr>15 ml <td>de tratamento de células</td><td>de tubo cônico</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>PBS CMF 10x</td><td>Gibco</td><td>14200</td><td>usado em 1x, diluir com água filtrada Millipore estéril</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Gibco</td><td>14080</td><td>usado em 1x, diluir com água filtrada Millipore estéril</td></tr> Albumina de soro bovino fetal (BSA) <tr><td>Albumina bovina fetal F12</td><td>Lonza</td><td>12-615F</td><td></td></tr> (<tr><td>BSA)</td> <td>Gibco</td><td>10438</td><td>use em F12HS20 a 10%</td></tr> <tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>faça uma solução estéril de 1 M em água destilada, dilua em meio F12 para obter a concentração final de 10 mM</td></tr> de <tr><td>penicilina / estreptomiocina</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>use 5 ml em 500 ml de meio F12</td></tr><tr><td>NT3</td><td>Millipore</td><td>GF031</td><td>Adicione 1 ml de água Millipore estéril, alíquota em condições estéreis, armazene a -20 &graus; C, utilizar na concentração final de 10 ng/ml em meios F12H, manter em -20 &graus; C congelador sem descongelação</td></tr><tr><td>NGF</td><td>RnD systems</td><td>256-GF</td><td>Adicionar 1 ml de PBS estéril 1x com 0,1% BSA, alíquota em condições estéreis, conservar a -20 &graus; C, usado na concentração final de 10 ng / ml em meio F12H</td></tr><tr><td>Alíquota L-Glutamina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>em condições estéreis, armazenar a -20 &deg; C, usar na concentração final de 200 mM em meio F12H</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>alíquota em condições estéreis, armazenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>Gibco</td><td>15260</td><td></td></tr> <tr>< td colspan = "4 "> Outros itens necessários: instrumentos de dissecação geral, incluindo pipetas de vidro Pasteur, ovos de galinha leghorn brancos férteis, incubadora de ovos de verificação (umidificado, 37 &deg; C), câmara de incubação celular (umidificada, 37 &deg; C), capa de fluxo laminar, escopo de dissecação de estereovisão binocular</td></tr> < td colspan = "4 ">< forte > Tabela de reagentes de imunocitoquímica< / forte > sacarose Sigma S9378 usado em solução fixadora (4% de paraformaldeído, 30% de sacarose, 2x PBS) Triton-X 100 Sigma T-8787 Paraformaldeído Sigma P6148 usado em solução fixadora (4% de paraformaldeído, 30%<tr></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> sacarose, 2x PBS)</td></tr> <tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Life technologies</td><td>PCN500</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>VWR</td><td>16004-430</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela de anticorpos primários</td></tr><tr><td>Anticorpo contra NCAM</td><td>Millipore</td><td>AB5032</td><td>anticorpo policlonal</td></tr><tr><td>contra ativado &beta; 1 ingegrina</td><td>Millipore</td><td>MAB19294</td><td>monoclonal</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela de anticorpos secundários</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG Alexa 488</td><td>Life technologies</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG Alexa 548</td><td>Life technologies</td><td>A11036</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e cultura de dissociated neurônios sensoriais de chick embriões

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Os neurônios são as células multifacetadas que carregam informações essenciais para uma variedade de funções, incluindo a sensação, movimento motor, aprendizagem e memória. Estudar neurônios in vivo pode ser um desafio, devido à sua complexidade, seus ambientes variados e dinâmicos, e as limitações técnicas. Por estas razões, estudando neurônios in vitro pode ser benéfico para desvendar os mistérios complexos de neurônios. A natureza bem definida de modelos de cultura celular fornece controle detalhado sobre as condições ambientais e variáveis. Aqui nós descrevemos como isolar, dissociar, e neurônios cultura primária de embriões de galinha. Esta técnica é rápida, barata, robusta e gera crescente neurónios sensoriais. O procedimento produz consistentemente culturas que estão altamente enriquecidas em neurónios e tem muito poucas células não neuronais (menos do que 5%). Neurônios primários não adere bem ao vidro não tratada ou de cultura de tecidos de plástico, portanto, os procedimentos detalhados para criar dois disct, substratos contendo laminina bem definida para o chapeamento neuronais são descritos. Neurônios cultivados são altamente suscetíveis a várias técnicas celulares e moleculares, incluindo a co-imunoprecipitação, imaginação de células vivas, RNAi, e imunocitoquímica. Procedimentos para imunocitoquímica duas vezes nesses neurônios cultivados foram otimizados e descrito aqui.

O protocolo aqui descrito permite que os investigadores a cultura de uma população enriquecida de neurónios sensoriais dissociados de embriões com muito poucas células (por exemplo, &lt;5%) não neuronais 7,8,10,16. Numerosos GDHs pode ser obtido a partir da região cervical lombossacral, torácicas e. Dependendo das necessidades do investigador, DRGs destas regiões anatómicas distintas pode ser facilmente isolado. Por exemplo, a Figura 1 mostra imagens do embrião de galinha por várias ...

Modelos de cultura celular proporcionar um controle detalhado sobre as condições ambientais e, assim, proporcionar uma plataforma poderosa para elucidar vários aspectos da biologia celular neuronal. Nós descrevemos um método rápido, barato e confiável para isolar, dissociar e cultura neurônios sensoriais a partir de embriões de galinha. Os detalhes da preparação substratos e imunocitoquímica também são fornecidos.

Isolamento e Cultura de Dissociated neurônios sensoriais de Chick Embriões

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

O objetivo geral deste procedimento é cultivar uma população enriquecida de neurônios sensoriais primários dissociados de embriões de galinha. Isso é feito coletando gânglios da raiz dorsal intactos do dia embrionário, sete a 10 embriões de galinha em um tubo cônico e, posteriormente, quebrando-os em sua suspensão celular dissociada. Como uma segunda etapa dissociada, as células DRG são colocadas em uma placa de cultura para incubação.Depois, a placa de cultura é enxaguada suavemente para desalojar preferencialmente os neurônios. A etapa final inclui o revestimento dos neurônios sensoriais dissociados nos substratos bem definidos, como lamínulas lavadas com ácido e cozidas pré-codificadas com altas ou baixas concentrações de laminina. Uma imunoquímica cito é usada para mostrar a presença de NCA e integrinas beta um ativadas nos corpos celulares, neuritos e cones de crescimento dos neurônios sensoriais de pintinhos embrionários cultivados dissociados.Este método é uma ferramenta poderosa para elucidar vários aspectos da neurobiologia, incluindo mecanismos de orientação de axônios, cones de crescimento, dinâmica do citoesqueleto, bem como composição e regulação da superfície celular. Essa técnica permite que os pesquisadores obtenham rapidamente as culturas altamente enriquecidas com neurônios sensoriais dissociados, que contêm muito poucas células gliais. Isso é diferente das culturas intactas de desnôngas da raiz dorsal que contêm neurônios e células não neuronais.Além disso, pequenas variações deste protocolo devem permitir alto rendimento de culturas neuronais de outras fontes além dos gânglios da raiz dorsal, incluindo o prosencéfalo embrionário. Em uma capela de fluxo laminar, quebre um ovo fértil de pintinho de leghorn branco e coloque seu conteúdo em uma placa de Petri de 100 milímetros. Posteriormente, transfira o embrião para outra placa de Petri de 100 milímetros.Adicione um XPBS aquecido à placa de Petri para manter o tecido úmido. O embrião é decapitado e o corpo é transferido para outra placa de Petri limpa. Aquecido F 12 HS 10 é adicionado ao tecido.Colocar a placa de Petri com tecido embrionário sob o microscópio de dissecação numa capela de fluxo laminar. Depois disso, faça uma incisão vertical na linha média da cauda ao pescoço, beliscando a derme em desenvolvimento para expor o coração, pulmão e outros órgãos. Com a pinça fina, segure suavemente o pescoço e a aorta ou outro tecido imediatamente superior ao coração e puxe em direção à cauda para eviscerar o animal.Em seguida, aplique F 12 HS 10 quente no tecido para limpar ainda mais a preparação e manter o tecido úmido e repita as aplicações de F 12 HS 10 durante a dissecção, conforme necessário. Em seguida, remova quaisquer órgãos cardiovasculares, respiratórios ou digestivos restantes para expor a coluna vertebral das costelas em desenvolvimento e os DRGs para coletar os DRGs ao longo de ambos os lados da coluna vertebral lombar, inferior às costelas, arranque os DRGs do embrião. Isso é feito beliscando e cortando as raízes que vão do Dr.G em direção à medula espinhal e agarrando o nervo em desenvolvimento do DRG em direção à periferia ou vice-versa.Depois, coloque os DRGs intactos em uma placa de cultura de 35 milímetros cheia de F 12 HS 10 quente. Remova qualquer excesso de tecido, como as raízes dorsais ou ventrais, que possam aderir aos DRGs. Para obter DRGs superiores à região lombar, remova a metade ventral da coluna vertebral torácica e cervical.Isso é feito fazendo um corte na coluna vertebral em desenvolvimento perpendicular ao eixo da medula espinhal na região lombar superior e outro corte na região cervical superior. Em seguida, faça cortes ao longo dos lados direito e esquerdo da coluna vertebral. Coletivamente, esses cortes separarão a metade ventral da coluna vertebral do embrião, e a coluna é então removida do embrião para permitir fácil acesso aos DRGs.Remova a medula espinhal torácica e cervical segurando a medula espinhal com uma pinça fina. Em seguida, colete os DRGs torácicos e cervicais intactos como feito anteriormente e coloque-os em F 12 HS 10 quentes com outros DRGs. Remova o excesso de tecido que possa aderir aos DRGs.Em seguida, enxágue o interior de uma nova pipeta de pasta de vidro com F 12 HS 10 Para ajudar a evitar que os DRGs grudem na parede da pipeta. Use a pipeta enxaguada para transferir todos os DRGs e F 12 HS 10 da placa de Petri pequena para um tubo cônico estéril de 15 mililitros, embriões adicionais podem ser dissecados para aumentar o número de DRGs neste procedimento. Coloque o tubo cônico com DRGs intactos na centrífuga e gire suavemente a 200 vezes G por dois a três minutos.Confirme se os DRGs afundaram no fundo do tubo. Em seguida, remova cuidadosamente F 12 HS 10, deixando o pellet DRG intacto. Em seguida, adicione dois mililitros de um X-C-M-F-P-B-S para desalojar o pellet de DRGs.Gire novamente e remova o CMFPS enquanto retém os DRGs. Repita esta etapa de lavagem para um total de três lavagens. Depois que as lavagens estiverem concluídas e o CMFPS for removido, adicione dois mililitros de tripsina aquecida ao tubo de 15 mililitros e desaloje suavemente os DRGs.Em seguida, coloque o tubo em banho-maria a 37 graus Celsius por 10 a 15 minutos para digerir os DRGs em células dissociadas. Trate suavemente os DRGs em solução de tripsina e inspecione visualmente a ausência de DRGs intactos. Continue tation até que os DRGs intactos não sejam mais vistos a olho nu e/ou permita uma incubação mais longa no banho-maria de 37 graus Celsius até que os DRGs intactos sejam dissociados.Em seguida, centrifugue os DRGs dissociados e a tripsina a 200 vezes G por três a cinco minutos para formar um pellet. Gire por mais tempo, se necessário, até que o pellet seja formado. Em seguida, aspire cuidadosamente a tripsina sem interromper o pellet.Adicione dois mililitros de F 12 hs 10 ao pellet e tri suavemente os DRGs. Em seguida, transferir todo o conteúdo do tubo cônico para uma placa de cultura de 100 milímetros. Enxágue o tubo com oito mililitros de F 12 HS 10 e transfira-o para a placa de cultura dois mililitros de cada vez, totalizando 10 mililitros.Depois disso, coloque a placa de cultura em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius por três horas. Agora adicione 400 microlitros de laminina preparada, um para cada lamínula de vidro lavada e cozida com ácido e espalhe com uma ponta de pipeta para garantir a cobertura total. A tensão superficial permitirá que a laminina permaneça na lamínula e não se espalhe no fundo da placa de cultura.Coloque uma tampa sobre o prato e deixe o Lamin um incubar por duas a três horas em temperatura ambiente. Em seguida, enxágue as lamínulas revestidas com laminina com PBS estéril em uma capela de fluxo laminar três vezes. Deixe o PBS nas lamínulas após o último enxágue.Não perca a tensão superficial durante as etapas de enxágue. Após a incubação, use uma pipeta estéril de 10 mililitros para enxaguar suavemente o fundo do prato contendo células DRG dissociadas. Segure o prato em um ângulo de 45 graus.Retire aproximadamente sete mililitros de F 12 HS 10. Em seguida, expulse-o suavemente em um terço do prato para desalojar os neurônios. Repita isso mais cinco vezes.Em seguida, gire o prato aproximadamente 120 graus e repita o procedimento de enxágue por mais seis enxágues. Em seguida, repita o procedimento novamente para o terço restante do prato. Agora, usando a mesma pipeta, transfira F 12 HS 10 contendo neurônios do prato para um tubo cônico.Centrifugue por cinco a 10 minutos a 200 G para granular. As células subsequentemente removem F 12 HS 10, deixando o pellet intacto. Em seguida, ressuspenda o pellet com dois mililitros de suplementos F 12 H plus aquecidos.Em seguida, determine a densidade celular com um hemocitômetro e dilua as células conforme necessário com suplementos de F 12 H plus para obter a concentração desejada de plaqueamento. Em seguida, remova o PBS das lamínulas revestidas com laminina imediatamente. Coloque 400 microlitros de células sobre eles.Transfira cuidadosamente o prato para uma incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius e deixe incubar por duas a três horas em condições estéreis. Inunde suavemente os pratos de 35 milímetros contendo neurônios com 1,6 mililitros de suplementos F 12 H plus. Posteriormente, devolva as células à incubadora e incube-as durante a noite.Esta figura mostra neurônios sensoriais primários dissociados cultivados imunomarcados para NCA e integrinas beta um ativadas. Os neurônios embrionários de pintinhos crescem robustamente em altas concentrações de corpos celulares neuronais de laminina um. Neurites e cones de crescimento são imunopositivos para NCA e integrina beta uma ativada.A imagem mesclada das duas colorações revela que a maioria das células é positiva para N cam e beta uma integrina ativada. Como esperado para neurônios sensoriais de pintinhos embrionários, menos de 5% das células colhidas por esta técnica são não neuronais. Nesta imagem, há uma célula com uma morfologia glial que é NCA M negativa e beta uma integrina positiva.Consistente com uma célula não neuronal. Uma ampliação maior de um neurônio sensorial cultivado mostra claramente os neuritos que se estendem do corpo celular, e essa inserção mostra uma ampliação maior do cone de crescimento na ponta de um neurite. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de dissociar cuidadosa e completamente os gânglios da raiz dorsal intactos e colocar os neurônios em placas e a densidade apropriada nos substratos definidos, como tiras cobertas lavadas e cozidas com ácido codificadas com concentrações conhecidas de laminado após o procedimento de cultura.Métodos de imagem ao vivo, como microscopia de lapso de tempo, podem ser realizados para avaliar a coone de crescimento, filo de motilidade, dinâmica POAL e outros comportamentos de cone de crescimento em substratos definidos e em resposta a moléculas aplicadas ao meio de cultura. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão sólida de como produzir uma cultura de crescimento robusto que seja altamente enriquecida para neurônios dissociados primários dos gânglios da raiz dorsal embrionária de pintinho.

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