Name: A metilação in vitro Ensaio de Proteína Estudo Arginina metilação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Aprenda a realizar ensaio de metilação in vitro para avaliar a metilação de arginina em proteínas usando PRMTs marcados com epítopo. Este método permite determinar o status de metilação de substratos específicos.

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Este estudo foi apoiado por um Prémio de Mérito do Departamento de Assuntos de Veteranos dos Estados Unidos, e um NIH conceder R01CA138528 a RW.

1: Preparação de construções de expressão <ol><li> Antes de se iniciar o protocolo, PRMTs clones em vectores de expressão de mamíferos com um epitopo tag N-terminal (Myc ou HA), e o substrato em-quadro com a glutationa-S-transferase (GST) para a expressão de proteínas de nível elevado e purificação a partir de células bacterianas Os lisados, utilizando técnicas de biologia molecular padrão. </li></ol> 2 Purificação de PRMTs <ol><li> Utilizar placas de 100 mm de cultura para manter as células epiteliais brônquicas humanas (Beas2B). Passagem das células a cada três dias e não deixá-los crescer até confluência. </li><li> No dia antes da transfecção, 7,5 x 10 semear 5 células em 10 ml de meio de cultura de uma cultura de 100 mm de prato. Redemoinho para dispersar uniformemente as células, e incuba-se a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 humidificado incubadora. </li><li> No dia seguinte, aspirar a mídia e adicionar 5 ml de meio de cultura sem soro e antibióticos. Agitar e aspire o meio. Repita este passo ummais tempo e, finalmente, adicionar 5 ml de soro / meio sem antibiótico e prossiga para transfecção. </li><li> Dilui-se 6 ug de ADN de plasmídeo em 750 ul de meio isento de soro em um tubo de 1,5 ml de centrífuga de plástico estéril. </li><li> Em outro tubo de 1,5 ml de centrífuga de plástico, diluir 30 ul de reagente de transfecção em 750 ul de meio isento de soro. </li><li> Transferir a solução de reagente de transfecção diluída (passo 2.5), para o tubo contendo ADN diluído (passo 2.4). Misture com cuidado pipetando para cima e para baixo várias vezes. </li><li> Incubar a mistura de transfecção à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Após 15 min, a mistura de transfecção pipetar suavemente sobre as células, redemoinho para misturar uniformemente, e incubar a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 humidificado incubadora. </li><li> Depois de 3 horas, aspirar o meio contendo misturas de transfecção das células. Adicionar meio de cultura celular fresco suplementado com soro e antibióticos. </li><li> Incubar a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 humidificadoincubadora durante 48 horas. </li><li> Após 48 horas, lisar as células em 1 ml de tampão de lise (1 x solução salina tamponada com fosfato, 1% de Nonidet P-40, 0,5% desoxicolato de sódio, 0,1% de dodecil sulfato de sódio, e 1 ug / ml de fluoreto de sulfonilo phenlymethyl). Recolher os lisados ​​para um tubo de centrífuga de plástico com um tirante de células e incuba-se os lisados ​​em gelo durante 30 min. </li><li> Centrifugar os lisados ​​a 15000 xg durante 10 min numa centrífuga de bancada para limpar os lisados ​​a partir de detritos de células. [* É altamente recomendável para confirmar a expressão da HA-PRMT1 via immunoblotting de uma alíquota de lisados ​​com anticorpos anti-HA, antes de prosseguir para a purificação das enzimas, para ensaio de metilação.] </li><li> Para a purificação de PRMTs, incubar 3 mg de lisados ​​de células com 30 ul de suspensão de 50:50 anti-HA matriz de afinidade em tampão fosfato salino (PBS), e rodar durante a noite a 4 ° C em um tubo de rotor. </li><li> No dia seguinte, girar os tubos a 14.000 xg em uma centrífuga de bancada para 2 min para recolheros grânulos. Descartar o sobrenadante e lava-se as pérolas de 3x com 1 ml de tampão RIPA [Tris 20 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM e 1% de Triton-X-100], em cada lavagem foi seguido por centrifugação a 14.000 xg durante 2 min. Após a terceira lavagem, lavagem das esferas uma vez com 100 ul de tampão de metilação (50 mM Tris pH 8,5, KCl 20 mM, 10 mM de MgCl2, 1 mM de β-mercaptoetanol, 100 mM de sacarose). Após a centrifugação, remove-se o sobrenadante. As contas contendo os PRMTs imobilizados está pronto para ser utilizado no ensaio de metilação. [* É altamente recomendável usar as PRMTs imobilizados imediatamente no ensaio de metilação.] </li></ol> 3 Purificação de Substrato <ol><li> Inocule uma colónia única de GST-G3BP1 BL21 transformada em 5 ml de meio de Luria-Bertani (LB) contendo 100 ug / ml de ampicilina. Crescer as culturas durante a noite a 37 ° C com agitação a 250 rpm. </li><li> No dia seguinte, a transferência da cultura durante a noite para 50 ml de meio fresco LB e contInue a crescer a um OD 600 de 0,5-0,7 (Demora cerca de 2 horas). </li><li> Quando a DO600 atinge 0,5-0,7, adicionar isopropil-β-D-tiogalactósido (IPTG) até uma concentração final de 1 mM e continuar a cultura durante 4 horas adicionais a 37 ° C com agitação a 250 rpm. </li><li> Colher as células por centrifugação a 1500 xg durante 10 min, e processar o pellet para a purificação de GST ou armazenar a -80 ° C. </li><li> Re-suspender o sedimento de bactérias em 5 ml de tampão de lise (PBS 1x com inibidores de protease, 100 ug / ml de lisozima, e 0,1% de Triton-X-100) e incuba-se os lisados ​​a 37 ° C durante 30 min. Nesta altura, os lisados ​​aparece turvo e viscoso, devido à libertação de ADN genómico bacteriano. </li><li> Cisalhamento do ADN genómico por ultra-sons (10 impulsos de 1 segundo cada um com uma amplitude de 30%). </li><li> Limpar os lisados ​​por centrifugação a 15.000 xg durante 10 minutos e transferir o sobrenadante límpido para um tubo de 15 ml. Se o sobrenadante é claro não repetir o centrifugação processo mais uma vez. </li><li> Enquanto isso, lavar as esferas de GST-Sepharose duas vezes com PBS gelado e se obter uma suspensão de GST-Sepharose em PBS de 50:50. Adicionar 200 ul da suspensão de GST-Sepharose para o ligado celular bacteriana foi afastada e rodam a 4 ° C durante 1 hora. </li><li> Depois de 1 hora, centrifugar os tubos a 500 xg por 3 min para recolher as esferas. Lavam-se as esferas de 3x com PBS gelado. </li><li> Após a lavagem final, voltar a suspender as pérolas em 100 ul de tampão de eluição (50 mM Tris pH 8,0, NaCl 150 mM, glutationa 30 mM) e rodar a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Centrifugar os tubos a 15.000 xg durante 2 minutos e transfere-se o sobrenadante contendo a proteína purificada num outro tubo de centrífuga de plástico. Efectuar a electroforese de gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) em 5 ul de análise da proteína purificada, juntamente com quantidades conhecidas de albumina de soro bovino (BSA) para estimar a concentração de proteína purificada. </li></ol> 4. metilação Assay Nota: Execute seguintes passos em uma área separada designada para o trabalho de radioisótopos e de acordo com os protocolos da instituição sobre a realização de experimentos com isótopos radioativos. <ol><li> Adicionar 2 mg de substrato purificada GST-e uma mistura mestre contendo tampão de metilação 1x (50 mM Tris pH 8,5, KCl 20 mM, 10 mM de MgCl2, 1 mM de β-mercaptoetanol, 100 mM de sacarose), 1 uCi de S-adenosil- L-[metil-3H] metionina, e água até um volume final de 10 ul às PRMTs imobilizadas passo (2.13) e incuba-se a reacção a 30 ° C durante 1 hora. </li><li> Após 1 h, parar a reacção por adição de 10 ul de tampão de amostra 2x SDS. Após a desnaturação das amostras a 95 ° C durante 10 min, separar as amostras sobre um gel de SDS-PAGE. </li><li> Mais tarde, transferir as proteínas separadas a partir do gel de SDS para uma membrana de nitrocelulose usando uma transferência electroforética semi-seca. </li><li> Após a transferência, a membrana de cobertura com umautofluor (intensificador de imagem autorradiográfica), e agitar suavemente durante 2 horas à temperatura ambiente. Após 2 horas, despeje o autofluor e guarde para uso posterior. [* Rotular o tubo de material radioativo] </li><li> Ar rapidamente secar a membrana sobre um papel de filtro, selá-lo em um saco de plástico e expor a membrana a um filme de raios-X a -20 ° C. Tempo de exposição suficiente varia entre 5-30 dias. </li></ol> 5. Confirmação de Expressão PRMT e carga igual de substrato <ol><li> Depois de atingir posições suficientes, transferir a membrana a uma caixa de plástico que contém um tampão de bloqueio [solução salina tamponada com Tris com Tween-20 (TBST + 3% de leite magro)] e agitar suavemente durante 1 hora. </li><li> Descarte o tampão de bloqueio como resíduos radioactivos. Incubar a membrana com anticorpo anti-HA (1: 1000 de diluição) em TBST durante a noite a 4 ° C, com balanço suave. </li><li> Lava-se a membrana 3 x com TBST e incubar a membrana com um anticorpo secundário marcado com HRP anti-rato(1: 5000 de diluição) em TBST à temperatura ambiente durante 1 hora com agitação suave. </li><li> Após 1 h, lavar a membrana com TBST 3x, e realizar a detecção de proteínas chemiluminiscence com um substrato HRP. </li><li> Após a detecção dos PRMTs marcadas com HA, incubar a membrana com uma solução de coloração Ponseau-S, durante 5 minutos à temperatura ambiente. Lavar rapidamente as membranas 3x com água para detectar os substratos etiquetados com GST. Digitalizar a imagem. </li></ol>

<ol><li>Paik, W. K., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+methylase+I.+Purification+and+properties+of+the+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme.</a> J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).</li>
<li>Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+immediate-early+TIS21+protein+and+the+leukemia-associated+BTG1+protein+interact+with+a+protein-arginine+N-methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase.</a> J Biol Chem. 271, 15034-15044 (1996).</li>
<li>Boffa, L. C., Karn, J., Vidali, G., Allfrey, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+NG%2C+NG%2C-dimethylarginine+in+nuclear+protein+fractions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Distribution of NG, NG,-dimethylarginine in nuclear protein fractions.</a> Biochem Biophys Res Commun. 74, 969-976 (1977).</li>
<li>Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation at a glance.</a> J Cell Sci. 120, 4243-4246 (2007).</li>
<li>Lee, Y. H., Stallcup, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+protein+arginine+methylation+of+nonhistone+proteins+in+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation.</a> Mol Endocrinol. 23, 425-433 (2009).</li>
<li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+in+mammals%3A+who%2C+what%2C+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why.</a> Mol Cell. 33, 1-13 (2009).</li>
<li>Bikkavilli, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dishevelled3+is+a+novel+arginine+methyl+transferase+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Dishevelled3 is a novel arginine methyl transferase substrate.</a> Scientific reports. 2, 805(2012).</li>
<li>Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation+of+G3BP1+in+response+to+Wnt3a+regulates+%7Bbeta%7D-catenin+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation of G3BP1 in response to Wnt3a regulates {beta}-catenin mRNA.</a> J Cell Sci. 124, 2310-2320 (2011).</li>
<li>Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt3a-stimulated+LRP6+phosphorylation+is+dependent+upon+arginine+methylation+of+G3BP2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Wnt3a-stimulated LRP6 phosphorylation is dependent upon arginine methylation of G3BP2.</a> J Cell Sci. , (2012).</li>
<li>Tini, M., Naeem, H., Torchia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+arginine+methylation+in+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of arginine methylation in transcription.</a> Methods Mol Biol. 523, 235-247 (2009).</li>
<li>Lee, J., Cheng, D., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+in+protein+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Techniques in protein methylation.</a> Methods Mol Biol. 284, 195-208 (2004).</li>
<li>Cheng, D., Vemulapalli, V., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+applied+to+the+study+of+protein+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methods applied to the study of protein arginine methylation.</a> Methods Enzymol. 512, 71-92 (2012).</li>
<li>Zurita-Lopez, C. I., Sandberg, T., Kelly, R., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+protein+arginine+methyltransferase+7+%28PRMT7%29+is+a+type+III+enzyme+forming+omega-NG-monomethylated+arginine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human protein arginine methyltransferase 7 (PRMT7) is a type III enzyme forming omega-NG-monomethylated arginine residues.</a> J Biol Chem. 287, 7859-7870 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo aqui descrito, é rotineiramente utilizada para estabelecer o estado de metilação dos substratos PRMT identificados. Este ensaio robusto e consistente também irá fornecer provas definitivas sobre a especificidade da PRMTs para os seus substratos. Os componentes essenciais para o sucesso deste ensaio são os seguintes: 1 Expressão de PRMTs em células de mamíferos, 2 Actividade de PRMTs purificadas, 3 Expressão e purificação de substrato, e 4 completa transferência western das proteínas para a membrana de nitroc...

Metilação proteína foi descrita pela primeira vez em 1968 1. Foi só a primeira clonagem de PRMT1 em 1996, que os pesquisadores começaram a apreciar a importância desta modificação pós-tradução 2. Curiosamente, cerca de 2% de resíduos de arginina em proteínas de extractos nucleares são metilados 3, indicando que a abundância desta modificação. A arginina é um aminoácido carregado positivamente, com uma cadeia lateral básica e os de azoto / s nas cadeias laterais de arginina pode ser modificada após a tradução através da adição de um grupo metilo, um processo conhecido como arginina metilação 4-6. Metilação arginina é catalisada por uma classe de enzimas viz. Transferases de proteína de metilo, arginina (PRMTs). Argininas pode ser ou dimetilado monomethylated e este último pode ser simétrica ou assimétrica, dependendo do tipo de PRMTs que catalisam o processo de 4-6. Proteínas que mostrar argininae-glicina motivos ricos são alvos potenciais para a catálise mediada por PRMT. Metilação mediada por PRMT de substratos foi mostrado para modular a interacção proteína-proteína, interacção proteína-ácido nucleico, a função da proteína, a expressão do gene, e / ou de sinalização celular, as quais são essenciais para a homeostase celular normal 7-9. A fim de entender o papel biológico da proteína arginina metilação, ensaios precisos, eficientes e reproduzíveis são necessários para estabelecer o estado de metilação dos substratos PRMT identificados. No ensaio in vitro de metilação, que avalia a capacidade de catalisar a PRMTs purificados metilação dos seus substratos, é um ensaio bem aceite para o estudo de metilação arginina 10-12. O êxito geral deste ensaio depende em grande parte da actividade dos PRMTs purificadas. PRMTs pode ser expressa e purificada a partir de bactérias ou células de mamífero 10,11. Este ensaio in vitro de metilação, como dPORMENORIZADA na secção de protocolo, baseia-se num método originalmente descrito por Tini e colegas 10. Neste protocolo, que mostram em detalhe os passos envolvidos na expressão e purificação da PRMT1 em células de mamíferos. A capacidade da PRMT1 purificada catalisar a metilação em Ras-activação da GTPase da proteína de ligação da proteína 1 (G3BP1), um substrato conhecido PRMT 8, foi depois avaliado na presença de S-adenosil-L-[metil-3H] metionina como o doador de metilo. Utilizando este ensaio, pode-se definir de forma fiável a capacidade dos PRMTs a novel metilato ou substratos conhecidos, o que é um passo fundamental no estudo da proteína arginina metilação.

<table><tbody><tr><td>S-adenosil-L-[metil-3H] metionina</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ecoscint ultra&nbsp;</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-270</td><td></td></tr><tr><td>Dispensador de tampa de garrafa</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-900</td><td></td></tr><tr><td>AutoFluor</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-315</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cintilação de 6 ml</td> National <td>Diagnostics</td><td>SKU:SVC-06</td><td></td></tr><tr><td>GST-sepharose</td><td>GE Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutathione Reduced</td><td>Sigma</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Reagente de transfecção</td></tr><tr><td>Beas2B</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>US-Biologicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>matriz de afinidade anti-HA</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad gel doc</td><td>Bio Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-HA</td><td>roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponseau S</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a metilação in vitro ensaio de proteína estudo arginina metilação

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Proteína arginina metilação é uma das modificações pós-traducionais mais abundantes no núcleo. Proteína arginina metilação pode ser identificada e / ou determinada por meio de métodos de proteómica, e / ou imunotransferência com anticorpos específicos metil-arginina. No entanto, essas técnicas às vezes pode ser enganosa e muitas vezes fornecem resultados falsos positivos. Mais importante, estas técnicas não podem constituir uma prova directa de apoio à especificidade do substrato PRMT. Ensaios in vitro de metilação, por outro lado, são os ensaios bioquímicos, que são sensíveis, e consistentemente se revelar as proteínas identificadas são realmente substratos PRMT. Um ensaio típico de metilação in vitro inclui, PRMTs activa purificada, purificada e substrato marcado com um radioisótopo doador de metilo (S-adenosil-L-[metil-3H] metionina). Aqui, descrevemos um protocolo passo-a-passo para isolar PRMT1 cataliticamente activo, um membro da família PRMT ubiquamente expressa. A mimtilo transferase da PRMT1 purificados foram depois testados em proteína Ras-activação da GTPase de ligação da proteína 1 (G3BP1), um substrato PRMT conhecido, na presença de S-adenosil-L-[metil-3H] metionina como o doador de metilo. Este protocolo pode ser utilizado não só para o estabelecimento do estado de metilação de novos substratos PRMT1 fisiológicos, mas também para a compreensão do mecanismo de base de arginina proteína metilação.

<html> As capacidades de HA-PRMT1 para metilar GST-G3BP1 foram determinadas por um ensaio in vitro de metilação. PRMT1 marcada com HA purificada a partir de lisados ​​de células Beas2B foi utilizado numa reacção de metilação contendo GST-G3BP1, e 1 ^ Ci de S-adenosil-L-[metil-3H] metionina, como um doador de metilo. PRMT1 poderia catalisar eficientemente a metilação de GST-G3BP1 (Figura 1, painel superior). Reacções de metilação, utilizando menus pendentes executadas em lisados ​​de c...

Proteína arginina metilação, catalisada por uma classe de enzimas viz., Proteína arginina metil transferases (PRMTs), é o processo de adição enzimática do grupo (s) metilo para argininas dentro proteínas. O ensaio de metilação in vitro é a ferramenta mais confiável para avaliar o estado de metilação de substratos PRMT conhecidos ou novos.

A metilação in vitro Ensaio de Proteína Estudo Arginina metilação

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer o status de metilação da proteína arginina metil transferase ou substratos de PRMT. Isso é feito expressando primeiro PRTs marcados com epítopos em células de mamíferos. Os P RMTs são então imunoprecipitados dos lisados celulares usando velocidades SRO revestidas com anti-hemaglutinina ou anti-HA, seguidas por uma lavagem extensiva para remover proteínas não especificamente ligadas.Em seguida, as contas lavadas são incubadas com a proteína substrato purificada de bactérias e tritium marcado com caracol L metionina, ou sam. Finalmente, a reação é interrompida e o estado de metilação do substrato é determinado por meio de silsulfato de sódio, eletroforese em gel de poliacrilamida ou análise de página SDS seguida de auto-radiografia. Em última análise, a capacidade dos p RMTs de metilar o substrato é determinada comparando as reações de metilação usando imunoprecipitação realizada nos lisados de células transfectadas de vetor vazio e BRMT.Abordagens proteômicas ou immunoblotting com anticorpos específicos de metilarginina às vezes podem ser enganosas, muitas vezes fornecendo resultados postais falsos. Mais importante ainda, eles não po

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