A Formação Ensaio macio Agar Colony

O objetivo geral deste procedimento é quantificar o crescimento independente da ancoragem celular. Isso é feito primeiro colocando uma camada de ágar na placa de cultura de células e permitindo que ela endureça. O segundo passo é colocar uma mistura de células em ágar por cima da camada de ágar anterior.

Em seguida, as células podem formar colônias durante um período de algumas semanas. A etapa final é a coloração das colônias para visualização e quantificação. Em última análise, o ensaio de formação de colônias de ágar mole é usado para mostrar o crescimento independente de Anchorage como uma indicação de transformação celular.

A principal vantagem desta técnica sobre outros métodos, como o ensaio gênico Clon, é que o ensaio de formação de colônias de ágar mole requer que as células formem colônias de maneira independente de Anchorage. Comece o procedimento rotulando cada poço de uma cultura de tecidos tratada. Placa de seis poços apropriadamente para cada linha celular ou condição que está sendo investigada.

Em seguida, prepare dois meios de cultura Xcel dissolvendo um grama de meio em pó e 0,2 gramas de bicarbonato de sódio na água deionizada até um volume final de 50 mililitros. Passe este meio por um filtro de 0,2 mícron. Adicionar componentes adicionais necessários para a cultura normal da linhagem celular de interesse.

Por exemplo, cultive a linhagem celular CMT 1 67 em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS e 1% de solução de estreptomicina de penicilina. Aqueça médio a 37 graus Celsius em banho-maria quente antes de usar. Agora prepare um meio de cultura Xcel.

Em seguida, prepare o ágar 1% nobre adicionando um grama de ágar nobre a 100 mililitros de água deionizada. Depois disso, prepare 0,6% de ágar nobre adicionando 0,6 gramas de ágar nobre a 100 mililitros de água deionizada. Em seguida, autoclave as misturas de ágar nobre.

Em seguida, fazer uma solução de estoque de cloreto de tetra oleum azul nitro de um miligrama por mililitro em um XPBS com o objetivo de colorir as colônias. Neste procedimento, leve ao micro-ondas a garrafa de ágar 1% nobre por cerca de um a dois minutos enquanto aquece no micro-ondas. Monitore a solução de perto para evitar transbordar.

Em seguida, continue aquecendo e misturando intermitentemente até que o ágar-ágar esteja completamente dissolvido e a solução límpida. Depois disso, coloque a solução de ágar derretido e o meio de cultura pré-aquecido dois x em um balde de gelo cheio de 42 graus Celsius. Água da torneira.

Além disso, coloque um tubo cônico de 50 mililitros em um suporte de tubo no balde de gelo com água quente. Em seguida, transfira o balde para a capa de cultura de células. Em seguida, adicione seis mililitros de meio de cultura e seis mililitros da solução de ágar 1% nobre ao tubo cônico de 50 mililitros.

Pipete para cima e para baixo várias vezes para misturar. Trabalhar em um ritmo acelerado evitará o endurecimento prematuro do ágar macio. Em seguida, retirar cerca de 5,5 ml da mistura com uma pipeta serológica de cinco ml.

Deixe as bolhas de ar subirem até o topo da coluna da pipeta. Em seguida, deposite 1,5 mililitros da mistura em cada poço e evite a deposição de bolhas de ar. Cubra a placa e deixe a mistura de ágar-ágar solidificar na capela de cultura de células à temperatura ambiente por 30 minutos.

Primeiro, colha as células por tripsina e dilua-as de um a cinco em cultura, meio em um tubo cônico de 15 mililitros. Conte as células e calcule o número de células necessárias por poço para preparar uma suspensão celular final neste momento. Em seguida, derreta a solução de ágar 0,6% no micro-ondas.

Coloque-o em um balde de gelo contendo água quente junto com um tubo cônico de 50 mililitros em um suporte de tubo e a suspensão final da célula. Em seguida, transfira o balde de gelo com 0,6% de ágar derretido para a coifa de cultura de células para as etapas subsequentes. Para preparar um volume total de 12 mililitros de suspensão celular para uma placa de seis poços, primeiro pipete seis mililitros de suspensão celular no tubo cônico de 50 mililitros.

Em seguida, adicione seis mililitros de 0,6% de ágar ao tubo. Mantenha a mistura a 42 graus Celsius para evitar o endurecimento prematuro e maximizar a sobrevivência celular. Depois, pipete a mistura rapidamente, duas a três vezes para distribuir as células.

Retire 5,5 mililitros da mistura com uma pipeta sorológica de cinco mililitros e deixe as bolhas de ar subirem até o topo da coluna de pipeta. Em seguida, deposite 1,5 mililitros da mistura em cada um. Bem, permita que a mistura de ágar celular solidifique à temperatura ambiente na capa de cultura de células por 30 minutos antes de colocá-la em uma incubadora de cultura de células umidificada a 37 graus Celsius.

Adicione 100 microlitros de meio de crescimento sobre a camada superior de ágar duas vezes por semana para evitar a dessecação e aguarde cerca de 21 dias para a formação adequada da colônia. Para corar as células, adicione 200 microlitros de solução de cloreto de tetra oleum nitro blue a cada poço e incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius. Depois que as colônias estiverem coradas, tire fotos dos poços usando o gerador de imagens e conte as colônias usando um software de análise de imagem.

Aqui é mostrado o ensaio de formação de colônias de ágar mole do vetor que expressa células CMT 1 67 LNCX LPC X e CMT 1 67 LL foi sete a nove frisados sobre células de expressão. O vetor que expressa células CMT 1 67 L e CXL PC X e CMT 1 67 LL ficou sete vezes frisado. Nove células superexpressivas foram plaqueadas em um ensaio de formação de colônias de ágar mole CMT 1 67 LL foi sete células frisadas nove mostraram uma diminuição acentuada na formação de colônias após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da pesquisa do câncer explorarem a transformação celular in vitro. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar as células para o crescimento independente de Anchorage.