Name: O cultivo de células de mamíferos utilizando um uso único sistema pneumático Bioreactor (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Aprenda a cultivar células de mamíferos em grande escala utilizando um biorreator pneumático de uso único. Este método minimiza a contaminação microbiana e otimiza o crescimento celular em ambiente controlado.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este projeto foi apoiado em parte pela Universidade Johns Hopkins, Gabinete do Reitor por meio da Gateway Science Initiative.

1. Entrar <ol><li> Ligue o biorreator. Clique em qualquer lugar para abrir a página de login. Selecione o nome de usuário e digite a senha e clique em &quot;Login&quot;. </li></ol> 2. Calibração <ol><li> Calibre o sensor de pH (2 pontos antes da autoclavagem). </li><li> Inspeccionar sensor de pH e confirmar ponta do sensor é preenchido com uma solução de electrólito. Prepare dois copos com soluções de calibração pH (eletrólito) pH 4 e pH 7 e tem disponível um frasco de lavagem com água destilada. </li><li> Conectar o cabo de pH para o sensor de pH. Navegue até a guia &quot;Ações&quot; na interface Olá e clique em &quot;calibrar&quot;. Digite temperatura tampão no campo Temp Solução de Calibração. </li><li> Colocar o sensor de pH em tampão 1 (pH 4) e inserir o valor no campo de &quot;zero&quot;. Aguarde até que o gráfico para estabilizar e clique no botão &quot;calibrar 1&quot;. Lavar o sensor de pH com água destilada. </li><li> Colocar o sensor em tampão 2 (pH 7). Digite o tampão2 valor no campo &quot;span&quot;. Aguarde até que o gráfico para estabilizar e clique calibrar 2 botão. </li><li> Clique em &quot;Salvar&quot; e depois clique em &quot;Fechar&quot;. </li><li> Calibre o sensor de oxigênio dissolvido (OD). </li><li> Verifique se o sensor de OD foi polarizada por ser ligado ao sistema por várias horas. Navegue até a guia &quot;Ações&quot; na interface Olá e clique em Calibrar. Clique no botão &quot;FAZER A&quot;. </li><li> Desligue o sensor de OD e digite 0 no campo &quot;zero&quot;. Aguarde até que o gráfico para estabilizar e clique no botão &quot;Calibrar 1&quot;. </li><li> Volte a ligar o sensor de OD e digite 100 no campo &quot;Span&quot;. Aguarde até que o gráfico para estabilizar e clique no botão &quot;Calibrar 2&quot;. </li><li> Clique em &quot;Salvar&quot; e clique em &quot;fechar&quot;. </li></ol> 3. autoclave e instalar sensores de e Vasos de reagente <ol><li> Após a calibração, sensores lugar e bem térmica em autocbolsas e lave autoclave durante 30 minutos a 121 ° C, 15 psi. </li><li> Higienizar bolsas de autoclave com 70% de álcool isopropílico (IPA) e bolsas de transferência para cabine de segurança biológica (BSC). Retire a embalagem exterior do navio. </li><li> Higienizar embalagem interior com 70% IPA e transferir navio para cabine de segurança biológica (BSC). Remova a embalagem interior e inspeccionar o navio e tubos por danos causados ​​durante o transporte. </li><li> Instalar o pH e DO sensores nas duas portas dianteiras. Instale o bem térmica para a porta traseira esquerda. Abra a tampa do sensor. </li><li> Guie o sensor através da porta sensor. Passe o sensor com força na porta. </li><li> Navio Transferência de BSC. </li><li> Pendure o DO e cabos dos sensores de pH fora da manga vaso e verifique se não há nada na manga. Deslize o navio na manga, primeiro os pés. </li><li> Ajustar cuidadosamente o sensor de temperatura para o poço térmico navio. Certifique-se de que o fundo do recipiente, assenta contra os aquecedores. </li><li> Removera tubulação fixa de suas malas. Jogo codificação de cores na tubulação para os conectores correspondentes e bombas na unidade de controle biorreator. </li><li> Instale a tubulação de gás principal pressionando o conector na sua saída de gás. Instale a linha de gás micro rodando no sentido horário conector na saída de gás. Instale o tubo de filtro de exaustão: </li><li> Abra o forno filtro. Fixe o filtro de exaustão no canal U para que sua tubulação atravessa os dois ganchos para o filtro e sair do forno. </li><li> Instalar o tubo de bolsa condensador no suporte de tubagem. Feche a porta. </li><li> Rota linhas de adição A e B, ambas as linhas de comunicação social, e da linha de colheita por trás do sensor de OD e para o banco ao lado da unidade de controle biorreator. </li><li> Conecte os cabos dos sensores de OD e pH. </li></ol> 4. adição de meio e Micro-portadores <ol><li> Navegue até a guia &quot;ações&quot; e clique em &quot;Controle de Bombas&quot; na interface do computador. </li><li> Forme um Sterile conexão entre uma linha não utilizado meio disso (1 faixa laranja) e da fonte de garrafa / saco médio por soldagem do tubo ou usar acessórios Luer. </li><li> Clique na barra deslizante para ligar a bomba de mídia on. Clique na barra para transformar a mídia bomba desligada após a adição desejado quantidade de meio. </li><li> Colocar em esferas microtransportadoras Ca 2 +, Mg 2 + livre de PBS durante 3 horas à temperatura ambiente. </li><li> Lavar grânulos várias vezes com Ca2 +, Mg2 + livre de PBS. </li><li> Autoclave durante 15 minutos a 115 ° C, 15 psi. NOTA: Adicionar 3 g / L (peso seco) nesta experiência. </li><li> Bomba em micro-transportadores que tenham sido hidratadas, lavado e autoclavado para o reactor da mesma forma que o meio foi adicionado no passo 4.1. </li></ol> 5. Equilíbrio e de um ponto FAZER Calibração <ol><li> Defina os controladores para Auto e digite os setpoints desejados. Aqui, use Agitação Set Point (SP) = 15 rpm, temperatura SP = 37,0 ° C, pH = 7,2, DO = 100%. Aguarde até que o pARÂMETROS equilibrar. </li><li> Confirmar sensor está totalmente polarizado. Confirme DO valor presente estabilizou. </li><li> Navegue até a guia &quot;Ações&quot; e clique em &quot;calibrar&quot;. Clique em &quot;fazer um&quot; clique &quot;de um ponto&quot;. </li><li> Digite &quot;100&quot; no campo &quot;Span&quot;. Clique no botão &quot;Calibrar 1&quot;, clique em &quot;Save&quot; e clique em &quot;Fechar&quot;: </li></ol> 6 Iniciar uma execução <ol><li> Navegue até a guia Ações. Clique em &quot;Batch&quot;. Use o teclado na tela ou um teclado externo para digitar um nome de lote 16 caracteres ou menos. </li><li> Clique no botão &quot;Hide&quot; do teclado no ecrã. Clique no botão &quot;Iniciar lote&quot; confirmar clicando em &quot;Iniciar&quot; na sobreposição. </li></ol> 7 Inocular com células <ol><li> Formar uma conexão estéril entre um (1 banda de laranja) não utilizado linha além médio ea / source garrafa saco célula por meio de soldadurao tubo ou usar os acessórios Luer. </li><li> Instale a seção de silicone da tubulação na bomba de mídia para que a seta aponta para a tubulação entre a bomba eo reservatório. </li><li> Verifique braçadeira tubo é aberto e sua braçadeira de tubulação ramificada está fechado. Clique no controle deslizante para ligar a bomba de mídia on e clique em &quot;Off&quot; após a adição de células. </li><li> Navegue até a guia &quot;Ações&quot; e clique em &quot;Bombas de controle&quot;. </li></ol> 8 Amostragem <ol><li> Após inoculação e tão frequentemente quanto desejado para monitorar a cultura, retirar uma amostra a partir da cultura da seguinte forma: </li><li> Navegue até a guia &quot;ações&quot; e clique em &quot;tomar de exemplo&quot;. Coloque o tubo de amostragem na bomba de amostragem e manipular a válvula de amostragem de acordo com as instruções na tela. </li><li> Realizar pelo menos uma observação microscópica diária e contagem de células nesses exemplos. </li><li> Quando as células atingiram a densidade desejada, neste case de 1,2 x 10 6 células / ml, infectar as células com a adição de um inoculo de vírus. </li><li> Adicionar assepticamente o inoculo para uma seringa de 20 ml, e ligar a seringa para uma das portas de adição de peças no reactor. Introduzir o inoculo para o reactor por meio de pressão sobre o êmbolo da seringa. </li><li> Continuar a amostragem e análise da cultura para a concentração intracelular de partículas de adenovírus. </li></ol>

<ol><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+Animal+Cells+A+Manual+of+Basic+Techniques+and+Specialized+Applications%22">Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications</a>. , 6th edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2010).</li>
<li>Healthcare, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcarrier+Cell+Culture+Principles+and+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22GE+Healthcare+Data+File+18-1140-62%22%5BJournal%5D)">Microcarrier Cell Culture Principles and Methods.</a> GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).</li>
<li>Simaria, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+cell+therapy+bioprocess+economics+and+optimization+Single-Use+cell+expansion+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+and+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies.</a> Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).</li>
<li>Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+novel+pneumatic+mixing+for+single-use+bioreactor+application%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Proc%22%5BJournal%5D)">Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application.</a> BMC Proc. 5 (S8), O12(2011).</li>
<li>Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disposable+bioreactors+in+cell+culture-based+upstream+processing%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+Int%22%5BJournal%5D)">Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing.</a> BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).</li>
<li>Chaubard, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disposable+bioreactors+for+viral+vaccine+production+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Biopharm+Int+Supp%22%5BJournal%5D)">Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities.</a> Biopharm Int Supp. , (2010).</li>
<li>Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+Effects+on+Animal+Cells+Grown+in+Microcarrier+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+and+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures.</a> Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).</li>
<li>DePalma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-use+Equipment+on+Cusp+of+Industrialization%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Eng+Biotechnol+News%22%5BJournal%5D)">Single-use Equipment on Cusp of Industrialization.</a> Genet Eng Biotechnol News. 32 (1), (2012).</li>
<li>Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaltz%2C+RH+%22Manual+of+Industrial+Microbiology+and+Biotechnology%22">Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology</a>. , 3rd ed, ASM Press. Washington, DC. (2010).</li>
<li>Applied Technical Bioreactors, , Seminole (FL), USA. <a target="_blank" href="http://www.infors-ht.com/index.php/en/products/bioreactors/bench-top-bioreactors/minifors">http://www.infors-ht.com/index.php/en/products/bioreactors/bench-top-bioreactors/minifors</a> (2012).</li>
<li>Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSousa%2C+MF+%22Impact+of+Bioreactor+Design+on+the+Performance+of+Microcarrier+Cultures%22">Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures</a>. , 3rd ed, Abstract. Cell Culture Engineering XIII. Scottsdale, Arizona. (2012).</li>
</ol>

Autores D. Giroux e Y. Hashimura são funcionários da PBS Biotech que produz reagentes e instrumentos utilizados neste artigo.

Este sistema de biorreatores de uso único é relativamente simples de usar e oferece análises em tempo real para o acompanhamento e análise do reator. É extremamente bem adequado para a cultura de células de mamíferos e insetos com densidades celulares atingindo mais de 30 milhões de células / ml. Além de células A549 descrito neste relatório 11, que cresceram células SF-9 de insecto em bioreactor bem. A mistura suave fornecido pela roda pneumática reduz os danos celulares. Vários passos são fundamentais quando configurou este reator. Primeiro calibração, adequado do pH e DO sensores é importante para a monitorização óptima da cultura e para a adição de reagentes para ajustar o pH, ou o oxigénio no sistema. Em segundo lugar, as garrafas de reagente e de sementes devem ser preenchidos e os acessórios luer feito num ambiente estéril, tal como um BSC. Uma vez que os frascos de reagentes são movidos para fora do ambiente estéril, as conexões com as linhas de alimentação de biorreatores deve ser feita com cuidado para evitar a contaminação microbiana. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Embora este sistema biorreator funciona bem para linhas celulares de mamíferos e insetos, não é projetado para culturas bacterianas. O sistema não pode fornecer a mistura rápida e oxigenação, que é necessária para as células bacterianas. O crescimento bacteriano é melhor realizado em um biorreator de tanque agitado. Em comparação com outros bio-reactores de utilização única para a cultura de células de mamífero ou de insecto, o sistema é fácil de usar, que fornece dados suficientes para análise de pistas, e tem um crescimento celular semelhante ou melhor do que o outro sistema de uso único, nós avaliamos. O uso único sistema biorreator pneumático tem o potencial de atender a muitas das pesquisas e aplicações clínicas nas áreas de biotherapeutics, vacinas, células-tronco e medicina personalizada 4. Além disso, a flexibilidade do sistema permite Batch, Fed-batch, Perfusão, e transfecção aplicações baseadas biorreator 5. Finalmente, de uso único sistemas de biorreatores descartáveis ​​têm o potencial para atender às necessidades da produção industrial em grande escala e para aderir às diretrizes e recomendações dos órgãos reguladores nacionais e internacionais 6-10.

Linhagens de células de mamíferos podem ser classificados em uma das três categorias com base em suas características de crescimento: as células que crescem em suspensão, as células que crescem como agregados, e as células que crescem ancorados a um substrato. Embora o biorreactor ar rodas demonstrado neste vídeo é capaz de crescer todos os três tipos de células, este vídeo vai demonstrar a utilização do biorreactor de cultivo de células dependentes de ancoragem em micro-transportadores. Células de mamíferos dependentes de ancoragem podem ser cultivadas para fins de produção de mais células - onde as próprias células são o produto. Por exemplo, derivadas da medula óssea as células estaminais mesenquimais humanas estão actualmente a ser cultivadas com a finalidade de recolher as células e injectando-os em tecido doente. O bioreactor pneumático demonstrado neste vídeo provou adequado para a produção de tais células estaminais mesenquimais para esta aplicação (Serra et al., Comunicação pessoal, 2013). Anchorage depAs células de mamíferos são geralmente cultivadas endent pequena escala em recipientes de cultura em 2D, como placas de cultura de células, frascos de cultura de células, ou garrafas de rolo, onde eles aderem a uma superfície de crescimento especialmente tratado 1. Quando as células são mais desejado, as placas ou frascos pode ser expandida através da utilização de mais ou maiores navios. No entanto, para o cultivo mais eficaz em termos de custos de grandes quantidades de células dependentes de ancoragem, aumentando a área de superfície para a fixação das células pode ser conseguida pela utilização de pequenas esferas sólidas chamados micro-transportadores. Dependendo das características de ligação da célula, vários tipos diferentes de micro-transportadores estão disponíveis comercialmente, tais como dextrano, péptido, ou colagénio revestido. Os micro-transportadores têm uma grande área de superfície em relação ao volume proporcionando uma maior área de superfície para o crescimento celular; e os micro-transportadores podem ser mantidas em suspensão, com agitação, o que permite que as células a ser cultivadas a elevadas densidades em sistemas de biorreactor 2. Atualmente, os tipos de bioreactors onde as células aderentes são cultivadas em micro-veículos incluem frascos spinner e sistemas de tanque agitado, que utilizam rotores axiais para manter uma suspensão de células revestidas micro-portadores. Vários fatores são importantes para o cultivo bem sucedido de células, incluindo a tensão de oxigênio, tensão de cisalhamento, matriz de superfície, e de nutrientes e as concentrações do metabolito. O uso de biorreatores permite o monitoramento em tempo real das condições de crescimento e potencial para significativamente mais baixos custos de produção 1. Existem vários modelos de biorreatores comum para o cultivo in vitro de células, incluindo, suspensão agitada, girando navio parede, de fibra oca, saco de biorreator em uma plataforma central, e sistemas de leito fluidizado 3. Muitos destes sistemas apresentam problemas específicos para o cultivo de células e escalar -up, como alto custo, gradientes de concentração de nutrientes, cisalhamento hidrodinâmico, agregação celular, e dificuldade de amostragem, monitoramento e controle cell scale-up. Várias linhas de células aderentes são utilizados na produção de vírus, quer na produção de vacinas virais ou para a produção de vectores virais para as aplicações de terapia génica. Neste vídeo, utilizando o uso único pneumático (Ar-roda) do sistema biorreactor, que demonstram a cultura de células de carcinoma de pulmão humano (A549) em células de micro-transportadores para a produção de um adenovírus oncolítico. O desenho biorreator pneumático usa uma roda de agitação vertical que é alimentado pela flutuabilidade de gás aspergido na parte inferior do bioreactor. Este método suave agitação limita as forças de cisalhamento hidrodinâmicos, mas ainda garante ótima médio e célula de mistura 4. Em comparação com o reactor de tanque com agitação, o reactor de pneumático tem uma baixa tensão de corte na parede, mesmo com grandes volumes de sistemas de reactores biológicos de ar-roda (Figura 1). Em contraste com o bio-reactores de tanque agitado, o rotor vertical de uso único, este reactor é ligado por uma corrente de bolhas de gás dentroo recipiente, o que permite uma suave e uniforme de mistura média (Figura 2).

<table><tbody><tr><td>PBS 3&nbsp;</td><td></td> Conjunto de uso único PBS <td></td><td></td></tr><tr><td>Células de carcinoma de pulmão humano PBS</td><td></td><td></td> (A549) ATCC CCL-185 <td></td></tr><tr><td>DMEM Tripsina</td> de soro <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>bovino fetal</tr> médio de alta glicose <tr><td>EDTA, 0,25%</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Cytodex 1 Microcarriers</td><td>GE</td><td>3781</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antiespumante C</td><td>Sigma</td><td>A8011</td><td></td></tr></tbody></table>

o cultivo de células de mamíferos utilizando um uso único sistema pneumático bioreactor

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Avanços recentes no cultivo e aumento de escala de mamíferos, insetos e células-tronco criaram enormes oportunidades para novas inovações terapêuticas e de medicina personalizada. No entanto, traduzir esses avanços em aplicações terapêuticas exigirá sistemas in vitro que permitam sistemas de biorreatores robustos, flexíveis e econômicos. Existem vários sistemas de biorreatores atualmente utilizados em ambientes comerciais e de pesquisa; no entanto, muitos desses sistemas não são ideais para estabelecer, expandir e monitorar o crescimento de diferentes tipos de células. Os parâmetros de cultura mais difíceis de controlar nesses sistemas incluem minimizar o cisalhamento hidrodinâmico, prevenir a formação de gradiente de nutrientes, estabelecer aeração uniforme do meio de cultura, prevenir a contaminação microbiana e monitorar e ajustar as condições de cultura em tempo real. Usando um sistema pneumático de biorreator de uso único, demonstramos a montagem e operação deste novo biorreator para células de mamíferos cultivadas em microtransportadores. Este sistema de biorreator elimina muitos dos desafios associados aos sistemas atualmente disponíveis, minimizando o cisalhamento hidrodinâmico e a formação de gradiente de nutrientes e permitindo a aeração uniforme do meio de cultura. Além disso, o software do biorreator permite o monitoramento remoto em tempo real e o ajuste dos parâmetros de funcionamento do biorreator. Este sistema de biorreator também tem um tremendo potencial de aumento de escala de células de mamíferos aderentes e em suspensão para a produção de uma variedade de proteínas terapêuticas, anticorpos monoclonais, células-tronco, biossimilares e vacinas.

Na Figura 3, os parâmetros para o início de funcionamento do bioreactor são mostrados. Esta figura mostra a tela antes de definir os parâmetros de temperatura, oxigênio dissolvido, pH e agitação. Uma vez que os parâmetros são definidos, os parâmetros de execução são continuamente monitoradas e ajustes podem ser feitos para manter as condições exigidas. O software produz uma leitura contínua, que permite a fácil identificação de problemas. Neste experimento usando 2,5 L de DMEM contendo 10% de FBS, 250 ppm de RdC Anti-espuma C, 2 mm, L-glutamina e 3 g / L de micro-transportadores, o sistema é estabilizado assim a percentagem de oxigénio é de 50%, o temperatura é de 37 ° C, e o pH é 7,2. O reactor é inoculado com células A549 a uma concentração de 7 x 10 4 células / ml (ou 10 células / micro-transportador). Os parâmetros escolhidos para esta corrida resultaram na maioria das células que aderiram às micro-transportadores dentro de 2 horas (Figura 4). Após 12 horas, as células são demôniostrating sinais de achatamento e espalhando sobre a superfície da micro-transportador (Figura 5). Por 24 horas, micro-portadores têm uma distribuição relativamente uniforme de células, sem micro-operadoras sem células e sem grandes aglomerados de células no micro-transportadoras (Figura 6). A percentagem de colonização de micro-transportador de células A549 é de 75% em 24 horas e 90% em seguida (Figura 7). As células continuou a crescer exponencialmente a ~ 1 milhão de células / ml, após 48 horas (Figura 8). Após a infecção por uma dose de adenovírus oncolítico (2 x 10 8 viriões / ml) a 50 h, o aumento da densidade de 1,2 milhões de células / ml e depois começou a diminuir à medida que a infecção progrediu lítico. Houve ~ 10000 vezes amplificação do inoculo virai. Em experiências anteriores, verificou-se que a monitorização e ajuste de fluxo de gás é crítico para a maximização do crescimento de células (dados não publicados). Rapidamente células de crescimento pode esgotar o sistema de oxigênio com o nível de OD de cair para zero. Enquanto as células continuaram a crescer, foi a uma taxa muito mais lenta. É fundamental para monitorar e ajustar o fluxo de oxigênio para atender as demandas de células durante a fase logarítmica de crescimento. Cada corrida pode ser analisado para o crescimento ideal comparando o pH, OD e temperatura com a contagem de células diárias. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig1highres.jpg"> Figura 1: Dinâmica dos fluidos do biorreator sistema pneumático (PBS) em comparação com um biorreator tanque agitador medir forças de cisalhamento de parede em vários volumes de reatores. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig2highres.jpg"> Figura 2 impulsor reator pneumático Air-Wheel. 52008 / 52008fig3highres.jpg "/&gt; Figura 3 Pneumático Roda screen shot de parâmetros de software para iniciar o biorreator prazo. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg"> Figura 4 colonização Micro-portadora com células A549 2 horas após a inoculação. (Média de diâmetro micro-carrier ~ 180 m.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig5highres.jpg"> Figura 5 12 h após o início da cultura, as células A549 são anexando, achatamento, e espalhando sobre os micro-transportadores."Target =" 5highres.jpg _blank "&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg"> Figura 6. Micro-portadores revestidas com células após 24 horas de cultura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig7highres.jpg"> Figura 7 Percentagem de colonização de micro-transportador de células A549 após a inoculação. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig8highres.jpg"> Figura 8 O número de células A549 viáveis ​​em cultura de pré e pós-infecção com adenovirnos. Note-se que o passo de infecção virai ocorreu em 50 horas.

Usando um biorreator pneumático, demonstramos a montagem, operação e desempenho deste sistema de biorreator de uso único para o crescimento de células de mamíferos.

O cultivo de células de mamíferos utilizando um uso único sistema pneumático Bioreactor

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

O objetivo geral deste procedimento é cultivar grandes quantidades de células de mamíferos. Isso é feito calibrando primeiro o pH e o oxigênio dissolvido ou as sondas de alimentação e, em seguida, autoclavando o pH, as sondas de alimentação e a manga da sonda de temperatura. O segundo passo é inserir as sondas e a luva no vaso e posicionar o vaso no biorreator e conectar o escapamento, o filtro, as linhas de gás e a sonda de temperatura.O próximo passo é conectar os cabos de OD e pH e conectar assepticamente os transportadores médios e micro que são bombeados para o biorreator. A etapa final é iniciar os controladores para garantir que o biorreator atinja a velocidade, temperatura e saturação de oxigênio desejadas do impulsor. Por fim, após a inoculação e monitoramento por computador, a cultura pode ser processada para extração e purificação do produto desejado.A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o biorreator de tanque de agitação reutilizável, é que o biorreator de roda de ar é fácil de usar e minimiza as chances de contaminação microbiana. Vamos começar. Para iniciar o protocolo, faça login na tela de saudação.Em seguida, inspecione o sensor de pH e confirme se a ponta do sensor está cheia de solução eletrolítica. Obter um copo com uma solução de pH quatro, outro copo com uma solução de pH sete e um frasco de lavagem com água destilada. Em seguida, conecte o cabo de pH ao sensor de pH.Navegue até a guia de ações na interface hello e selecione calibrar. Em seguida, selecione a guia PHA e a calibração de dois pontos. Insira a temperatura do buffer no campo de temperatura da solução de calibração.Coloque o sensor na solução de pH quatro para calibrar Insira o valor no campo zero. Assim que o gráfico se estabilizar, empurre, calibre e enxágue o sensor de pH com água destilada. Repita a calibração para pH sete e salve as configurações.Insira o valor do buffer no campo span e aguarde até que o enxerto se estabilize. Para iniciar o oxigênio dissolvido ou fazer a calibração. Certifique-se de que o sensor de OD esteja conectado ao sistema por várias horas e tenha sido polarizado na guia de calibração, selecione DOA e calibração de dois pontos.Desconecte o sensor de OD. Insira zero na guia zero e aguarde até que o gráfico se estabilize. Antes de selecionar calibrar um, reconecte o sensor do e digite 100 no campo span.Quando o gráfico estabilizar, clique em calibrar dois. Em seguida, salve as configurações e feche o programa. Após a calibração, coloque os sensores e o poço térmico em bolsas de autoclave e autoclave-os por 30 minutos a 121 graus Celsius e 15 PSI.Após o término da autoclave, higienize as bolsas da autoclave com álcool isopropílico 70% e transfira as bolsas para um gabinete de segurança biológica ou BSC. Higienize e introduza o recipiente de reagente no BSC. Remova a embalagem interna e inspecione o recipiente e a tubulação quanto a danos.Em seguida, instale o sensor de OD na porta frontal esquerda do recipiente de reagente e o poço térmico na porta traseira esquerda. Instale o sensor de pH na porta frontal direita para instalar. Abra a tampa do sensor e rosqueie-o levemente na porta na parte superior do recipiente.Em seguida, transfira o recipiente para fora do BSC. Certifique-se de que os cabos do sensor de pH e OD estejam fora da luva do recipiente e que nada esteja localizado dentro da luva. Segure o recipiente de forma que fique voltado para a frente e deslize os pés do vaso primeiro na manga.Certifique-se de que o fundo do recipiente esteja apoiado nos aquecedores. Em seguida, encaixe cuidadosamente o sensor de temperatura no recipiente térmico. Poço. Em seguida, remova os conjuntos de tubos da bolsa.Combine o código de cores na tubulação com os conectores e bombas correspondentes na unidade de controle do biorreator. Encaminhe a adição de mídia e as linhas de amostragem atrás do sensor de OD e da térmica. Bem, insira a tubulação na bomba codificada por cores no lado esquerdo do biorreator.Conecte as linhas de gás principal e micro. Pressione o conector da linha de gás principal em sua saída de gás para instalar a linha de gás principal. Em seguida, gire o conector da micro linha de gás no sentido horário em sua saída de gás Para instalar a micro linha de gás.Para instalar a tubulação do forno com filtro, abra o forno com filtro e prenda a tubulação do filtro de exaustão ao uan. Certifique-se de que o tubo passe pelos dois ganchos até o filtro e saia do forno. Passe a linha inferior pelo gancho na parte inferior do forno com filtro e feche a porta.Em seguida, conecte os cabos aos sensores de OD e pH. Após a conclusão da instalação, forme uma conexão estéril usando acessórios de isca entre uma linha de edição média não utilizada e a fonte de saco de garrafa média. Navegue até a guia de ações na interface Hello.Clique em bombas de controle, selecione bomba de mídia e clique no controle deslizante para ligar a bomba de mídia. Em seguida, adicione 1,5 a 3,0 litros de mídia e clique no controle deslizante para desligar a bomba. O sistema agora está pronto para bombear microtransportadores previamente preparados para o reator.Eles podem ser adicionados usando uma linha de adição. Prenda a garrafa MICROCAR à linha de adição apropriada usando uma trava de isca estéril. Ligue a bomba de adição na tela da bomba de controle.Após a adição das micro transportadoras, desligue a bomba usando o controle deslizante, navegue de volta para a tela principal na interface hello, selecione as ações e depois avançado. Selecione o controlador apropriado para editar as configurações. Defina os controladores para automático e insira os pontos de ajuste.Depois de configurar os controladores, ligue a bomba de ar. Olhe dentro do recipiente de reagente para garantir que a roda de ar esteja girando. Certifique-se de que o sensor de OD esteja totalmente polarizado e que o valor de OD tenha se estabilizado.Em seguida, calibre a forma do sensor, uma conexão estéril entre uma linha de adição de meio não utilizada identificada por uma faixa laranja e a fonte do saco de garrafa de célula usando acessórios de isca. Em seguida, instale a seção de silicone da tubulação na bomba de mídia. Certifique-se de que a braçadeira da tubulação esteja aberta e que a braçadeira da tubulação ramificada esteja fechada.Navegue até a guia da bomba de controle e ligue a bomba de mídia. Adicione as células e desligue a bomba de mídia. Após a inoculação, navegue até a guia de ações e selecione coletar amostra.Certifique-se de que o sample tubo está no sample bomba e manipule o sample torneira de parada de acordo com as instruções na tela. Remova a seringa com a amostra para contagem de células e outras aplicações a jusante realizam contagens de células. Finalmente, quando as células atingirem a densidade desejada de 1,2 vezes 10 elevado a seis células por mililitro, adicione septicamente o inóculo do vírus a uma seringa de 20 mililitros.Conecte a seringa a uma porta de adição sobressalente no reator. Use a tela da bomba de controle para ligar a bomba de adição e adicionar o inóculo do vírus. A maioria das células A 5 49 aderiu aos microtransportadores em duas horas.Após 12 horas, as células demonstraram sinais de achatamento e disseminação na superfície do microcarro. Em 24 horas, os microtransportadores exibiram uma distribuição uniforme de células. A colonização de microcarros acontece rapidamente, como demonstrado aqui.A porcentagem de colonização de microcarros por 54 9 células é de 75% em 24 horas. Este gráfico mostra o número de células viáveis a 54 9 em cultura pré e pós-infecção por adenovírus. As células continuam a crescer exponencialmente para 1 milhão de células por mililitro após 48 horas.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como montar e operar um biorreator de roda pneumática para cultivar células de mamíferos em alta densidade para produção celular ou de proteínas. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

cultivation-mammalian-cells-using-single-use-pneumatic-bioreactor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Descrevemos uma plataforma baseada em chip para o cultivo tridimensional de células em micro-biorreatores. Um chip pode abrigar até 10 milhões. células que podem ser cultivadas sob condições estritamente definidas em relação ao fluxo de fluidos, etc tensão de oxigênio em um circuito de circulação estéril, fechado.

Chip baseado em Cultura de Células tridimensional em perfundidos Micro-biorreatores

Nosso grupo desenvolveu um sistema de cultura biorreator que imita as tensões pulsátil fisiológica do sistema cardiovascular para regenerar implantáveis ​​de pequeno diâmetro enxertos vasculares.

Engenharia Biológica Baseado em enxertos vasculares Usando um biorreator pulsátil

Neste protocolo, é introduzida a fabricação, configuração e operação básica de um biorreator picoliter microfluídico (PLBR) para análise de célula única de microrganismos procarióticos. Microrganismos industrialmente relevantes foram analisados como prova de princípio, permitindo insights sobre taxa de crescimento, morfologia e heterogeneidade fenotípica ao longo de certos períodos de tempo, dificilmente possíveis com métodos convencionais.

Biorreator Picoliter Microfluídico para Análise Microbiana de Célula Única: Fabricação, Configuração do Sistema e Operação

Nós desenvolvemos uma cultura de células automatizado e uma plataforma de interrogação para experiências de estimulação de células micro-escala. A plataforma oferece um controle simples, versátil e preciso para cultivar e estimular pequenas populações de células e recuperar lisados ​​para análises moleculares. A plataforma é bem adequado para os estudos que utilizam células preciosos e / ou reagentes.

A plataforma automatizada versátil para experiências de estimulação Micro escala celulares

A regulação de nutrientes usando alimentação ajustada ao crescimento contínuo melhora as taxas de crescimento de esferoides de células de mamíferos em comparação com a alimentação em lote intermitente para culturas em biorreatores de suspensão agitada.  Este estudo demonstra os métodos necessários para estabelecer culturas alimentadas com taxa ajustada simples.

Nutrient regulamento, a alimentação contínua de Expansão em grande escala de células de mamíferos em Spheroids

O comportamento funcional de células em cultura pode ser melhorada por cultura em mais in vivo -like ambientes de cultura 3-dimensionais 16-21. Este manuscrito descreve o set-up e operação de um sistema de fibra biorreator oco para in vivo -como mamíferos cultura de tecidos.

Biorreactores de fibras ocas para<em&gt; In Vivo</em&gt; -como Cultura tecidos de mamíferos

É apresentado um protocolo detalhado para a operação simultânea de 48 culturas de pilha paralela em variadas condições em um sistema de microbioreactor. Processo de cultura de células, colheita e análise de título de anticorpos subsequentes são descritos.

Uso do elevado-Throughput Microbioreactor sistema automatizado para produção de IgG1 modelo em células CHO

Aqui, apresentamos um procedimento detalhado para executar um Projeto de Experimento em um micro-bioreator automatizado seguido de colheita celular e quantificação de proteínas usando uma coluna de Proteína A.

Otimização de processos usando micro-bioreatores automatizados de alto throughput no cultivo de células de ovário de hamster chinês

Apresentamos aqui um método que combina o uso de apagamento epigenético químico com pistas relacionadas à mecanosensagem para gerar eficientemente células pluripotentes de mamíferos, sem a necessidade de transfecção genética ou vetores retrovirais. Essa estratégia é, portanto, promissora para a medicina translacional e representa um notável avanço na tecnologia organoide de células-tronco.

Uma estratégia de duas etapas que combina modificação epigenética e sinais biomecânicos para gerar células pluripotentes mamíferas

Aqui, apresentamos um protocolo para alcançar a fabricação em larga escala de células aderentes através de um sistema totalmente fechado baseado em microcarreadores dissolvidos grau GMP. O cultivo de células-tronco mesenquimais humanas, células HEK293T e células Vero foi validado e atendeu tanto às exigências de quantidade quanto aos critérios de qualidade para a indústria de terapia celular e gênica.

Produção de células em larga escala com base em microtransportadores porosos solúveis de grau GMP

Este protocolo descreve como usar o Sistema Ômico de Cultura de Microlitros de Célula Única (célula MISS) para realizar isolamento, cultivo e colheita monoclonal microbiana. A célula MISS alcança um fluxo de trabalho integrado baseado na tecnologia microfluídica de gotículas, que oferece excelente monodispersão de gotículas, alto cultivo paralelo e detecção de biomassa de alto rendimento.

Cultivo e colheita monoclonal microbiana automatizada e de alto rendimento usando o sistema ômico de cultura de gotículas de microlitro de célula única

Aprenda a cultivar células de mamíferos em grande escala utilizando um biorreator pneumático de uso único. Este método minimiza a contaminação microbiana e otimiza o crescimento celular em ambiente controlado.

O cultivo de células de mamíferos utilizando um uso único sistema pneumático Bioreactor

Explorar mais vídeos