O cultivo de células de mamíferos utilizando um uso único sistema pneumático Bioreactor

O objetivo geral deste procedimento é cultivar grandes quantidades de células de mamíferos. Isso é feito calibrando primeiro o pH e o oxigênio dissolvido ou as sondas de alimentação e, em seguida, autoclavando o pH, as sondas de alimentação e a manga da sonda de temperatura. O segundo passo é inserir as sondas e a luva no vaso e posicionar o vaso no biorreator e conectar o escapamento, o filtro, as linhas de gás e a sonda de temperatura.

O próximo passo é conectar os cabos de OD e pH e conectar assepticamente os transportadores médios e micro que são bombeados para o biorreator. A etapa final é iniciar os controladores para garantir que o biorreator atinja a velocidade, temperatura e saturação de oxigênio desejadas do impulsor. Por fim, após a inoculação e monitoramento por computador, a cultura pode ser processada para extração e purificação do produto desejado.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o biorreator de tanque de agitação reutilizável, é que o biorreator de roda de ar é fácil de usar e minimiza as chances de contaminação microbiana. Vamos começar. Para iniciar o protocolo, faça login na tela de saudação.

Em seguida, inspecione o sensor de pH e confirme se a ponta do sensor está cheia de solução eletrolítica. Obter um copo com uma solução de pH quatro, outro copo com uma solução de pH sete e um frasco de lavagem com água destilada. Em seguida, conecte o cabo de pH ao sensor de pH.

Navegue até a guia de ações na interface hello e selecione calibrar. Em seguida, selecione a guia PHA e a calibração de dois pontos. Insira a temperatura do buffer no campo de temperatura da solução de calibração.

Coloque o sensor na solução de pH quatro para calibrar Insira o valor no campo zero. Assim que o gráfico se estabilizar, empurre, calibre e enxágue o sensor de pH com água destilada. Repita a calibração para pH sete e salve as configurações.

Insira o valor do buffer no campo span e aguarde até que o enxerto se estabilize. Para iniciar o oxigênio dissolvido ou fazer a calibração. Certifique-se de que o sensor de OD esteja conectado ao sistema por várias horas e tenha sido polarizado na guia de calibração, selecione DOA e calibração de dois pontos.

Desconecte o sensor de OD. Insira zero na guia zero e aguarde até que o gráfico se estabilize. Antes de selecionar calibrar um, reconecte o sensor do e digite 100 no campo span

Quando o gráfico estabilizar, clique em calibrar dois. Em seguida, salve as configurações e feche o programa. Após a calibração, coloque os sensores e o poço térmico em bolsas de autoclave e autoclave-os por 30 minutos a 121 graus Celsius e 15 PSI.

Após o término da autoclave, higienize as bolsas da autoclave com álcool isopropílico 70% e transfira as bolsas para um gabinete de segurança biológica ou BSC. Higienize e introduza o recipiente de reagente no BSC. Remova a embalagem interna e inspecione o recipiente e a tubulação quanto a danos.

Em seguida, instale o sensor de OD na porta frontal esquerda do recipiente de reagente e o poço térmico na porta traseira esquerda. Instale o sensor de pH na porta frontal direita para instalar. Abra a tampa do sensor e rosqueie-o levemente na porta na parte superior do recipiente.

Em seguida, transfira o recipiente para fora do BSC. Certifique-se de que os cabos do sensor de pH e OD estejam fora da luva do recipiente e que nada esteja localizado dentro da luva. Segure o recipiente de forma que fique voltado para a frente e deslize os pés do vaso primeiro na manga.

Certifique-se de que o fundo do recipiente esteja apoiado nos aquecedores. Em seguida, encaixe cuidadosamente o sensor de temperatura no recipiente térmico. Poço. Em seguida, remova os conjuntos de tubos da bolsa.

Combine o código de cores na tubulação com os conectores e bombas correspondentes na unidade de controle do biorreator. Encaminhe a adição de mídia e as linhas de amostragem atrás do sensor de OD e da térmica. Bem, insira a tubulação na bomba codificada por cores no lado esquerdo do biorreator.

Conecte as linhas de gás principal e micro. Pressione o conector da linha de gás principal em sua saída de gás para instalar a linha de gás principal. Em seguida, gire o conector da micro linha de gás no sentido horário em sua saída de gás Para instalar a micro linha de gás.

Para instalar a tubulação do forno com filtro, abra o forno com filtro e prenda a tubulação do filtro de exaustão ao uan. Certifique-se de que o tubo passe pelos dois ganchos até o filtro e saia do forno. Passe a linha inferior pelo gancho na parte inferior do forno com filtro e feche a porta.

Em seguida, conecte os cabos aos sensores de OD e pH. Após a conclusão da instalação, forme uma conexão estéril usando acessórios de isca entre uma linha de edição média não utilizada e a fonte de saco de garrafa média. Navegue até a guia de ações na interface Hello.

Clique em bombas de controle, selecione bomba de mídia e clique no controle deslizante para ligar a bomba de mídia. Em seguida, adicione 1,5 a 3,0 litros de mídia e clique no controle deslizante para desligar a bomba. O sistema agora está pronto para bombear microtransportadores previamente preparados para o reator.

Eles podem ser adicionados usando uma linha de adição. Prenda a garrafa MICROCAR à linha de adição apropriada usando uma trava de isca estéril. Ligue a bomba de adição na tela da bomba de controle.

Após a adição das micro transportadoras, desligue a bomba usando o controle deslizante, navegue de volta para a tela principal na interface hello, selecione as ações e depois avançado. Selecione o controlador apropriado para editar as configurações. Defina os controladores para automático e insira os pontos de ajuste.

Depois de configurar os controladores, ligue a bomba de ar. Olhe dentro do recipiente de reagente para garantir que a roda de ar esteja girando. Certifique-se de que o sensor de OD esteja totalmente polarizado e que o valor de OD tenha se estabilizado.

Em seguida, calibre a forma do sensor, uma conexão estéril entre uma linha de adição de meio não utilizada identificada por uma faixa laranja e a fonte do saco de garrafa de célula usando acessórios de isca. Em seguida, instale a seção de silicone da tubulação na bomba de mídia. Certifique-se de que a braçadeira da tubulação esteja aberta e que a braçadeira da tubulação ramificada esteja fechada.

Navegue até a guia da bomba de controle e ligue a bomba de mídia. Adicione as células e desligue a bomba de mídia. Após a inoculação, navegue até a guia de ações e selecione coletar amostra.

Certifique-se de que o sample tubo está no sample bomba e manipule o sample torneira de parada de acordo com as instruções na tela. Remova a seringa com a amostra para contagem de células e outras aplicações a jusante realizam contagens de células. Finalmente, quando as células atingirem a densidade desejada de 1,2 vezes 10 elevado a seis células por mililitro, adicione septicamente o inóculo do vírus a uma seringa de 20 mililitros.

Conecte a seringa a uma porta de adição sobressalente no reator. Use a tela da bomba de controle para ligar a bomba de adição e adicionar o inóculo do vírus. A maioria das células A 5 49 aderiu aos microtransportadores em duas horas.

Após 12 horas, as células demonstraram sinais de achatamento e disseminação na superfície do microcarro. Em 24 horas, os microtransportadores exibiram uma distribuição uniforme de células. A colonização de microcarros acontece rapidamente, como demonstrado aqui.

A porcentagem de colonização de microcarros por 54 9 células é de 75% em 24 horas. Este gráfico mostra o número de células viáveis a 54 9 em cultura pré e pós-infecção por adenovírus. As células continuam a crescer exponencialmente para 1 milhão de células por mililitro após 48 horas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como montar e operar um biorreator de roda pneumática para cultivar células de mamíferos em alta densidade para produção celular ou de proteínas. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.