Name: Tempo real Análise do Perfil metabólico em Ex Vivo Culturas mouse Intestinal Crypt organóide (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprenda a analisar o perfil metabólico em tempo real de organoides de criptas intestinais de camundongo usando o analisador de fluxo extracelular XF 24. Este método permite estudar a função metabólica de organoides primários ex vivo.

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Este estudo foi apoiado por subsídios SR1 CA 135.561, R01 CA151494, R01 CA174432 e P3013330 do National Institutes of Health. Gostaríamos de agradecer a Michele Houston, Elena Dhima e Dr. Anna Velcich por seus valiosos comentários no desenvolvimento do protocolo de isolamento cripta. Agradecemos também a Formação Diabetes e Centro do Albert Einstein College of Medicine apoiado pelo NIH P60DK20541 Research, e Dr. Michael Brownlee e Dr. Xue Liang-Du, que dirigem e operar as instalações do cavalo marinho, respectivamente.

Este estudo foi realizado de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética de Experimentação Animal do Albert Einstein College of Medicine. 1. Crypt Isolamento e Cultura <ol><li> O isolamento das criptas do intestino delgado: <ol><li> Isolar criptas intestinais de qualquer modelo de ratos de interesse. Euthanize os ratos com CO 2, seguida por deslocação cervical. </li><li> Abra o abdômen longitudinalmente e encher o intestino delgado (SI) com soro fisiológico frio gelo fosfato tamponada, PBS (-Ca 2+; Mg 2+) com 2x antibiótico-antimicótico (anti-anti). Rapidamente isolar intestino delgado. </li><li> Completamente dissecar livre de gordura mesentérica usando um bisturi. Tenha cuidado para não perfurar o tecido - em todos os momentos manter o tecido úmido com PBS gelado. Abra-se inteStine longitudinalmente e lavar cuidadosamente com PBS gelado. </li><li> Corte intestino delgado em duas seções e achatar usando uma ponta de algodão molhado, raspe fora as vilosidades usando uma lâmina pré-resfriada. Lave vigorosamente em PBS gelado várias vezes. </li><li> Incubar 3 min, em 20 ml de 1x PBS por 3 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) /0.5 mM de ditiotreitol (DTT) para a dissociação não-enzimática do tecido. </li><li> Corte o tecido em pedaços pequenos (2-4 mm), usando uma lâmina de barbear em uma lâmina pré-resfriada. Transferem-se as peças em um tubo de 50 ml contendo 20 ml de PBS gelado. </li><li> Pipeta cima e para baixo suavemente 10x utilizando uma pipeta de 10 ml descartável estéril. Vamos fragmentos de tecido sedimentar por gravidade. Retirar o sobrenadante com uma pipeta. Repita mais três vezes; certifique-se sobrenadante é clara. </li><li> Adicionar 20 ml de PBS por EDTA 2 mM. Redemoinho e incubar a 4 ° C durante 30 min com agitação suave. </li><li> Deixe sedimento de tecido e descartar o sobrenadante. Adicionar 15 ml de PBS gelado e pipetacima e para baixo de 5x com uma pipeta de 10 ml. Deixe os fragmentos de tecido de sedimentos e recolher o sobrenadante como Fração 1 (F1). Repetir recolha F2-F5, mantidas separadamente cada fracção. </li><li> Adicionar 15 ml de PBS gelado e desta vez agitar vigorosamente à mão por 15 segundos. Colete F6 e repita para F7, F8. Se pedaços de tecido começar a flutuar, toque para ajudá-los a resolver. </li><li> Inspeccionar uma aliquota de cada fracção sob o microscópio. Reunir as fracções contendo criptas. </li><li> Passar as fracções reunidas através de um filtro de células de 70 mm de nylon, recolhendo criptas em um tubo de 50 ml. </li><li> Centrifugar a 100 xg durante 5 min a 4 ° C, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 10 ml de PBS gelado com criptas anti-anti 2x e transferência para um tubo de 15 ml. Repetir a lavagem mais uma vez. </li><li> Lave as criptas uma vez com 10 ml gelada ADF, Advanced DMEM / F-12 (Dulbecco &quot;s Modified Eagle Medium / Ham&quot; s F-12) - 2x anti-anti. </li><li> Lavam-se as criptas uma vez com 10 ml UmaDF - 1x anti-anti. </li><li> Conte as criptas utilizando um hemocitômetro. Ajustar o volume da solução cripta e transferir para um tubo de 1,5 ml, de modo que a concentração final quando cripta ressuspensas será 100-500 criptas por cada 50 uL de mistura de proteína gelatinosa (Matrigel). Centrifugar a 100 xg durante 5 min a 4 ° C e colocar a mistura em criptas proteína gelatinosa. </li><li> Placa 50 ul de suspensão cripta - mistura gelatinosa proteína por poço numa placa de 24 poços (área de crescimento: 2 cm2), colocando cuidadosamente gota a suspensão no centro de cada poço. Manter a placa numa CO 2, 37 ° C incubadora durante ~ 30 min, até que a suspensão se solidifica. </li><li> Adicionar 500 ul meios de gelo frio de cultura completo (Avançada DMEM / F12 com 1x anti - anti, 10 mM ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES), GlutaMAX 1x, 1x suplemento B27, 1x suplemento N2, 1 mM N-acetil-L-cisteína (NAC), / ml de factor de crescimento epidérmico 50 ng (EGF), 100 ng / mlNoggin, 500 ng / ml de R-espondina). <ol><li> Reconstituir factores de crescimento em 0,1% de Albumina de Soro Bovino (BSA) em PBS. </li></ol></li></ol></li><li> Crypt organóide Cultura e Passage: <ol><li> Passagem Organóides criptas 14-21 dias após sementeira (ou conforme necessário) como se segue: <ol><li> Alterar mídia toda sexta-feira e segunda-feira. Às quartas-feiras, substitua metade da media com meio fresco. </li></ol></li><li> Remover o meio de cultura. Lava-se a amostra duas vezes com 500 ul de PBS a intervalos de 5 min. </li><li> Remover PBS e quebrar delicadamente até a mistura gelatinosa de proteína usando um P1000 estéril micro ponteira. </li><li> Adicionar 1 ml de meio de cultura completo para um único poço e ressuspender as Organóides em 1 ml de meio. </li><li> Gentilmente interromper as Organóides usando um P1000 por pipetagem cima e para baixo 20-30x (verifique sob o microscópio para a dissociação organóide adequada com um bom rendimento cripta até uma técnica consistente é desenvolvido). </li><li> Transferem-se as criptas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml;centrifugar a 100 xg a 4 ° C, 5 min. </li><li> Lava-se a pelete duas vezes com 1 ml de meio de cultura completo. </li><li> Dividir a uma razão de 1: 3 ou 1: 6, conforme necessário, ressuspensão criptas em 50 ul por poço de Matrigel. Proceda como descrito acima (seção 1.1.16-18). </li></ol></li><li> Crypt congelamento organóide: <ol><li> Remover o meio de cultura. Lavar a amostra em 500 mL de PBS. </li><li> Dispersa-se a mistura gelatinosa de proteína utilizando uma ponta de pipeta P1000. </li><li> Adicionar 1 ml de mídia para um único poço e voltar a suspender as Organóides em 1 ml de mídia. </li><li> Cuidadosamente, quebre os Organóides usando um P1000 por pipetagem cima e para baixo 20-30x. </li><li> Transfira os Organóides a um tubo de 1,5 ml. Centrifuga-se a 100 xg a 4 ° C, 5 min. </li><li> Lava-se a pelete duas vezes com 1 ml de meio de cultura completo. </li><li> Criptas Ressuspender em 500 mL de mídia congelamento. </li><li> Criptas transferência para um tubo criogénico, colocar o tubo em um recipiente e loja de congelação de -80 ° C congelador overnight. </li><li> Transferir para criptas N2 líquido do tanque. <ol><li> Recuperar Organóides cripta congeladas pelo rápido degelo em um banho de água a 37 ° C. Lava-se com 500 ul meios de cultura completo uma vez, centrifugar a 100 xg, 5 min e ressuspender em mistura gelatinosa de proteína, e da cultura como descrito acima. Para uma melhor recuperação, adicione inibidor ROCHA (Y-27632) para a mídia congelamento. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Crypt organóide Metabolismo Ensaio <ol><li> 24 poços Preparação Plate: <ol><li> Isolar e contar criptas de acordo com o protocolo (ver secção 1.1 para isolamento cripta e 1.2 para a passagem cripta). </li><li> Criptas Ressuspender em mistura de proteína gelatinosa (100-200 criptas por 20 l). </li><li> Placa de suspensão mistura de proteínas cripta-gelatinoso numa placa de 24 poços de ensaio (certificar-se de que há pelo menos três repetições para cada amostra) e permitir que a suspensão para solidificar a 37 ° C num CO 2incubadora; em seguida, adicione 500 mL de meios de cultura completo. </li><li> Criptas Cultura (conforme descrito na seção 1.1) e observar ao microscópio até criptas crescer em Organóides totalmente desenvolvidos. </li></ol></li><li> Extracelular Flux Ensaio: <ol><li> Hidrato de cartucho durante a noite num não-CO 2 (0% de CO2), 37 ° C incubadora. </li><li> Remover o meio de cultura e lavar Organóides duas vezes com 500 ul de DMEM (sem: glucose, L-glutamina, piruvato de sódio e bicarbonato de sódio; e com: vermelho de fenol). Espere 5 min. </li><li> Adicionar 675 ul por poço meio de ensaio (DMEM com 2 mM de L-glutamina e 5 mM de D-glicose) a cada poço. </li><li> Verificar cripta Organóides morfologia microscópica para garantir que Organóides e a mistura gelatinosa proteína estão intactos depois as lavagens. Incubar 1 hora em um não-CO 2, 37 ° C incubadora. </li><li> Preparar 10 uM compostos injectáveis ​​(oligomicina, carbonil-cianeto de p-trifluoro-metoxi-fenil-hidrazona (FCCP), rotenone) no meio de ensaio. </li><li> Set-up do cartucho através do carregamento de 75 mL de 10 mM compostos injetáveis ​​nas portas da sequencialmente cartucho: Port A - oligomicina; Porto B - FCCP; e Port C - rotenona (As concentrações finais no ensaio serão de 1? M). </li><li> Incubar cartucho 30 min - 1 hr a 37 ° C numa incubadora com CO 2 não. </li><li> Ao mesmo tempo, ligue o XF Analyzer e criar o modelo de protocolo de ensaio. </li><li> Coloque cartucho e placa utilidade em XF Analyzer e executar &quot;calibrar&quot; cartucho. </li><li> Verifique Organóides cripta microscopicamente para se certificar de que eles estão ligados à mistura de proteína gelatinosa. </li><li> Célula de carga em placa de cultura de protocolo do ensaio instrumento e correr. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Jemal, A., et al. CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).</li>
<li>Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eating+patterns+and+risk+of+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Eating patterns and risk of colon cancer.</a> Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).</li>
<li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li>
<li>Coles, N. W., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+metabolism+in+Ehrlich+ascites-carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Glutamine metabolism in Ehrlich ascites-carcinoma cells.</a> Biochem J. 83, 284-291 (1962).</li>
<li>Medina, M. A., Castro I, N. unezde <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutaminolysis+and+glycolysis+interactions+in+proliferant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glutaminolysis and glycolysis interactions in proliferant cells.</a> Int J Biochem. 22, 681-683 (1990).</li>
<li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+changes+in+cancer+cells+upon+suppression+of+MYC%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metab%22%5BJournal%5D)">Metabolic changes in cancer cells upon suppression of MYC.</a> Cancer Metab. 1, 7(2013).</li>
<li>Malmgren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+changes+in+histone+modifications%2C+mRNA+levels%2C+and+metabolite+profiles+in+clonal+INS-1+832%2F13+%CE%B2-cells+accompany+functional+adaptations+to+lipotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Coordinate changes in histone modifications, mRNA levels, and metabolite profiles in clonal INS-1 832/13 β-cells accompany functional adaptations to lipotoxicity.</a> J Biol Chem. 288 (17), 11973-11987 (2013).</li>
<li>Whitehead, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li>
<li>Roig, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+epithelial+cells+derived+from+human+colon+biopsies+express+stem+cell+markers+and+differentiate+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro.</a> Gastroenterology. 138 (3), 1012-1021 (2010).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+LGR5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single LGR5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li>
<li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li>
</ol>

Não há divulgações.

Testamos a taxa de consumo de oxigénio (OCR) e a taxa de acidificação extracelular (ECAR) de criptas isolados a partir de 8 meses de idade e ratinhos cultivadas em Organóides ex vivo. Após a medição da taxa basal, metabolismo cripta foi avaliada adicionando oligomicina, cianeto de carbonilo -p-Trifluormetoxifenilidrazona (FCCP) e rotenona, sequencialmente. Basal OCR e ECAR basal foram gravadas 0-29 min (Figura 2A e 2B). No dia 29 min, oli...

O câncer colorretal (CCR) é a terceira principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos. Câncer de cólon esporádico - ou seja, que resulta mais tarde na vida (&gt; 50 anos de idade) e sem fatores predisponentes genéticos claras - contas para ~ 80% de todos os casos, com incidência fortemente influenciada por padrões alimentares a longo prazo 1,2. Estes tumores exibem um desvio metabólico no sentido para a glicólise oxidativo, conhecido como o efeito de Warburg, que pode, em parte, tornar as concentrações mais elevadas de blocos de construção celulares e energia disponíveis (através glutaminolysis) para permitir a conduzir e, talvez, as altas taxas de proliferação de células tumorais 3-5 . Estudos de câncer de cólon, bem como outros cânceres gastrointestinais, incluindo cânceres do intestino delgado fornecer informação importante sobre a causa da formação de tumores. Investigando as diferenças metabólicas entre os estados normais, pró-tumorigênicos e tumorigênicos de sistemas de órgãos gastrointestinais podem ajudar determination de risco relativo para o desenvolvimento do tumor, bem como a detecção precoce de neoplasia. Além disso, a compreensão do metabolismo bioenergético envolvendo respiração mitocondrial e da glicólise irá fornecer informações fundamentais sobre a forma como a fisiologia celular, o envelhecimento e as doenças estado perturba a homeostase intestinal. A utilização da tecnologia de ensaio para análise bioenergética fluxo extracelular pode avaliar as taxas de respiração mitocondrial e, simultaneamente, a glicólise em células que crescem em cultura em tempo real, 6,7. Até recentemente, os estudos in vitro de intestino delgado foram limitadas a linhas celulares derivadas de tumores benignos ou malignos ou 8,9 e não representam a fisiologia do epitélio intestinal normal e a influência do microambiente em que residem. Em 2009, Sato et al. 10 introduziu um sistema de cultura ex vivo para crescer tridimensional do mouse (3D) Organóides intestinais epiteliais, ou epithElial &quot;mini-coragem&quot;, adequado para investigações experimentais, diagnósticos e terapêuticos 10,11. Além disso, criptas isolados de ratos sob restrição calórica manter suas propriedades de crescimento alterados como Organóides em tais culturas 12. Em comparação com linhas celulares transformadas, culturas organï¿½de criptas pode ser usado para gerar os dados fisiologicamente relevantes que apresentem um modelo muito melhor para compreender o estado in vivo. Nós adaptamos a tecnologia de análise bioenergética para ensaio de metabolismo energético de Organóides cripta intestinal. Rato cripta intestinal Organóides foram cultivadas ex vivo para desenvolver os estudos do metabolismo energético organóide cripta apresentados. A taxa de consumo de oxigénio (OCR) e a taxa de acidificação extracelular (ECAR) de Organóides criptas foram medidos na ausência e na presença de dois diferentes inibidores metabólicos (oligomicina, rotenona) e um transportador de iões (carbonil-cianeto de p-Trifluormetoxifenilidrazona). A cripta orgaresposta metabólica noid a estes compostos químicos foram refletidos com sucesso através da mudança ECAR e valores de OCR. Estudos bioenergéticos celulares irá elucidar as interações recíprocas entre o estado metabólico e risco de doença e fenótipo em câncer, obesidade, diabetes, distúrbios metabólicos e doenças mitocondriais e ajudar métodos de rastreio antecipadamente com implicações diretas para a medicina translacional. Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para isolar pequenas criptas intestinais e Organóides cripta cultura. Além disso, introduzimos um novo método de usar culturas organóide cripta para ensaios metabólicos.

<table><tbody><tr><td>Matriz de Membrana Embasável BD Matrigel, TFR, Sem Vermelho de Fenol, Sem LDEV</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>PBS (solução salina tamponada com fosfato), sem magnésio, sem cálcio, pH 7.2</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12 (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Águia Modificada&prime; s Meio sem glicose, L-glutamina, vermelho de fenol, piruvato de sódio e bicarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>Sal de sódio vermelho de fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4758</td><td>Concentração final 15 mg/l em DMEM (D5030) - <forte>etapa 2.2.2</forte></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico, 100x, 100 ml</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Concentração final 1x ou 2x</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina, liquid</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Concentração final 1x</td></tr><tr><td>Gibco&reg; GlutaMAX&trade; suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>Concentração final 1x</td></tr><tr><td>Gibco&reg; HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano sulfônico), 1 M</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>Concentração final 10 mM</td></tr><tr><td>N-acetil-L-cisteína, 25 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-25G</td><td>Concentração final 1 mM</td></tr><tr><td>100x suplemento N-2, líquido</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Concentração final 1x</td></tr><tr><td>50x B-27&reg; suplemento menos Vitamina A, líquido</td><td>Invitrogen</td><td>12587-010</td><td>Concentração final 1x</td></tr><tr><td>R-Espondina 1 de camundongo recombinante, CF, 50 &mu; g</td><td>R& D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>Concentração final 500 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF murino recombinante, 100 &mu; g</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>Concentração final 50 ng/ml</td></tr><tr><td>Recombinante Murine Noggin, 20 &mu; g</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>Concentração final 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Gibco&reg; L-glutamina, 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Concentração final 2 mM</td></tr><tr><td>Gibco&reg; glicose em pó</td><td>Life Technologies</td><td>15023-021</td><td>Concentração final 5 mM</td></tr><tr><td>Ambion&reg; 0.5 M EDTA (ácido etilenodiaminotetracético), pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>AM9260G</td><td>Concentração final 3 mM para <forte>passo 1.1.5</forte>; 2 mM para <forte>passo 1.1.8</forte></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>DTT (dithiothreitol), 1M</td><td>Life Technologies</td><td>P2325</td><td>Concentração final 3 mM</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td>0.1% em PBS</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>1% em PBS</td></tr><tr><td>Recovery&trade; Meio de congelamento</td> de cultura celular <td>Life Technologies</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>inibidor de ROCK (Y-27632)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>Concentração final 10 &mu; </td></tr><tr><td>M Oligomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td>Concentração final 1 &mu; M</td></tr><tr><td>Carbonilo cianeto-p-trifluoro-metoxi-fenil-hidrazona (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>Concentração final 1 &mu; M</td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>Concentração final 1 &mu; M</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>Concentração final 0,1 N em PBS</td></tr><tr><td>XF24 Analisador de Fluxo Extracelular (Analisador XF)</td><td>Biociência</td><td></td><td></td> do Cavalo-marinho</tr></tbody></table>

tempo real análise do perfil metabólico em ex vivo culturas mouse intestinal crypt organóide

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

A mucosa do intestino delgado apresenta uma arquitetura repetitivo organizado em duas estruturas fundamentais: vilosidades, projetando para o lúmen intestinal e composto por enterócitos maduros, células caliciformes e células enteroendócrinas; e criptas, residentes proximal para a submucosa e muscularis, abrigando estaminais adultas e nas células progenitoras e células de Paneth madura, bem como do estroma e as células imunes do microambiente cripta. Até aos últimos anos, estudos in vitro do intestino delgado foi limitado a linhas celulares derivadas de tumores benignos ou malignos, e não representam a fisiologia do epitélio intestinal normal e a influência do microambiente em que residem. Aqui, demonstramos um método adaptado de Sato et al. (2009) para a cultura de Organóides das criptas intestinais do rato primárias derivadas de ratinhos C57BL / 6. Além disso, apresentamos a utilização de culturas organóide cripta para analisar o perfil metabólico cripta em tempo real por medidamento do consumo basal de oxigênio, a taxa glicolítica, a produção de ATP e da capacidade respiratória. Organóides manter as propriedades definidas por sua origem e reter os aspectos de sua adaptação metabólica refletido pelo consumo de oxigênio e taxas de acidificação extracelular. Estudos metabólicos em tempo real no presente cripta organï¿½de sistema de cultura são uma ferramenta poderosa para estudar o metabolismo da energia organï¿½de cripta, e como ela pode ser modulado por factores nutricionais e farmacológicas.

Organóides da cripta foram estabelecidos a partir de oito meses de idade camundongos C57BL / 6 alimentados com dieta purificada roedor Instituto Americano de Nutrição 76A (AIN76A). Organóides criptas intestinais podem ser cultivadas em cultura durante longos períodos de tempo a partir de um único cripta (Figura 1A, única seta vermelha). Organóides crescer para fora da cripta estruturas semelhantes em 18-20 dias em cultura (Figura 1B, setas vermelhas). Criptas foram passadas a cada 3 sem...

Pequenas Organóides cripta intestinal cultivadas ex vivo, proporcionam um sistema de cultura de tecidos que recapitula o crescimento das criptas dependentes de células-tronco e seu nicho. Foi estabelecido um método para ensaiar o perfil metabólico em tempo real em Organóides das criptas do rato primária. Encontramos Organóides manter as propriedades fisiológicas definidas por sua origem.

Tempo real Análise do Perfil metabólico em Ex Vivo Culturas mouse Intestinal Crypt organóide

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

O objetivo deste procedimento é testar o perfil metabólico de organoides primários de cripta de camundongo em tempo real. Isso é feito primeiro coletando o intestino delgado do camundongo, seguido pelo isolamento das criptas intestinais que Andre dobra em matrigel. O segundo passo é cultivar as criptas até que formem organoides de cripta totalmente crescidos.O próximo passo é a preparação de um ensaio de cartucho para estudos metabólicos. A etapa final é carregar o cartucho e a placa de utilidade no analisador de fluxo extracelular XF 24 e executar a análise de fluxo extracelular para medir a taxa de consumo de oxigênio e a taxa de acidificação extracelular dos organoides da cripta K. Em última análise, este procedimento permite o estudo do perfil metabólico de organoides primários de criptas intestinais de camundongos em tempo real.A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o uso de cultura de células para ensaios metabólicos, é que ela nos permite avaliar o metabolismo de órgãos criptográficos intestinais em tempo real. As culturas organoides imitam o estado imunológico com mais precisão, e isso ajuda a gerar dados mais relevantes fisiológicos. A técnica também pode ser estendida para analisar outras culturas organoides XI 3D.Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do câncer, como caracterizar alterações metabólicas no intestino delgado durante a tumorgênese e na pesquisa de diabetes e metabolismo, como comparar o metabolismo de estados normais e de doença. Para iniciar este procedimento, abra o abdômen de um camundongo sacrificado longitudinalmente. Encha o intestino delgado com PBS sem cálcio e magnésio gelado e dois antibióticos antimicóticos.Em seguida, isole rapidamente o intestino delgado. Remova a gordura mesentérica com um bisturi. Tenha cuidado para não perfurar o tecido e mantenha o tecido úmido com PBS gelado durante todo o procedimento.Abra o intestino e lave-o bem com PBS gelado. Depois disso, corte o intestino delgado em duas seções. Alise-os usando uma ponta de algodão molhada.Em seguida, raspe suavemente o VII usando uma lâmina de pré-suficiência. Lave os lenços vigorosamente em PBS gelado várias vezes. Em seguida, incube-os em 20 mililitros de um XPBS com três EDTA milimolar e 0,5Depois, corte os tecidos em pedaços de dois a quatro milímetros em uma lâmina de pré-corte. Usando uma lâmina de barbear, transfira as peças para um tubo de 50 mililitros contendo 20 mililitros de PBS gelado. Em seguida, pipete suavemente para cima e para baixo 10 vezes usando uma pipeta descartável estéril de 10 mililitros.Depois que os fragmentos de tecido se assentarem por gravidade, remova o SUP natum com uma pipeta. Repita o procedimento mais três vezes e certifique-se de que o sobrenadante esteja limpo. Agora, transfira os pedaços de tecido para um tubo de 50 mililitros contendo 20 mililitros de PBS com dois mili molares EDTA SW e incube a mistura a quatro graus Celsius por 30 minutos com um balanço suave.Depois disso, deixe o tecido assentar e descarte o supinado. Adicione 15 mililitros de PBS de carvão gelado e suba e desça cinco vezes. Deixe os fragmentos de tecido assentarem e colete o supinado como fração um.Repita os procedimentos para coletar a fração dois à fração cinco e mantenha as frações separadas. Em seguida, adicione 15 mililitros de gelo chamado PBS e agite vigorosamente com a mão por 15 segundos. Colete a fração seis e repita os procedimentos para a fração sete e a fração oito.Se os pedaços de tecido começarem a flutuar, bata no tubo para ajudá-los a assentar. Em seguida, inspecione uma alíquota de cada fração para crips ao microscópio. Este é um exemplo de uma fração ruim, e este é um exemplo de uma fração boa.Junte os que contêm Crips. Depois disso, passe as frações puxadas por um filtro de células de náilon de 70 mícrons e colete os Crips em um tubo de 50 mililitros. Em seguida, centrifugar a amostra a 100 vezes G por cinco minutos, quatro graus Celsius, descartar o supinato e suspender novamente o PT em 10 mililitros de PBS gelado com dois antibióticos antimicóticos.Em seguida, transfira os Crips para um tubo de 15 mililitros e repita a lavagem mais uma vez. Em seguida, lave as criptas uma vez com 10 mililitros de gelo frio, A DF avançado D-M-E-M-F 12 contendo dois antibióticos antimicóticos. Posteriormente, lave as criptas uma vez com 10 mililitros de um DF contendo um antibiótico antimicótico.Depois disso, conte as criptas usando um hemocitômetro. Ajuste o volume da solução de cripta e transfira-o para um tubo de 1,5 mililitro de modo que a concentração final de cripta quando ressuspensa seja de 100 a 200 criptas por 20 microlitros de mistura de proteínas gelatinosas. Em seguida, centrifugue a solução da cripta a 100 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.Remova o Sene e ressuspenda as criptas na mistura de proteínas gelatinosas. Em seguida, coloque 20 microlitros da suspensão da mistura de proteínas gelatinosas cripta por poço em uma placa de utilidade de 24 poços. Mantenha a placa em uma incubadora de CO2 a 37 graus Celsius por 30 minutos até que a suspensão solidifique.Em seguida, adicione 500 microlitros de meio de cultura completo e gelado a cada poço e cultive os Crips até que cresçam nos organoides totalmente desenvolvidos Neste procedimento, hidrate o cartucho durante a noite em uma incubadora sem dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Em seguida, remova o meio de cultura e lave os organoides duas vezes com 500 microlitros de DMEM. Após cinco minutos, adicione 675 microlitros de meio de ensaio a cada um.Bem, então verifique a morfologia microscópica dos organoides da cripta para incubá-los em uma incubadora sem dióxido de carbono a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, preparar 10 compostos injetáveis micromolares no meio de ensaio. Configure o cartucho carregando 75 microlitros de compostos injetáveis de 10 micromolares nas portas do cartucho sequencialmente.Em seguida, incube o cartucho por 30 minutos a uma hora em uma incubadora sem dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Simultaneamente, ligue o analisador XF e crie o modelo de protocolo de ensaio. Coloque o cartucho e a placa de utilidade no analisador XF e execute o cartucho de calibração Depois disso, carregue a placa de cultura de células no instrumento e execute o ensaio.O protocolo mostrado aqui são os organoides de cripta derivados de um camundongo C 57 preto de oito meses em dois dias ou 18 dias. Cultura. Esta figura mostra o ensaio metabólico utilizando organoides derivados de camundongos C 57 pretos de oito meses de idade, nos quais a taxa de consumo de oxigênio e a taxa de acidificação extracelular são apresentadas. As criptas são indicadas em vermelho e o controle é indicado em azul.Os reagentes pré-carregados no cartucho foram injetados sequencialmente como oligomicina, BFCCP e C rotenona. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do câncer e do metabolismo explorarem as mudanças metabólicas em organoides de cripta derivados de pacientes. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir o metabolismo organoide da cripta intestinal em tempo real.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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