Name: Tempo real Análise do Perfil metabólico em Ex Vivo Culturas mouse Intestinal Crypt organóide (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprenda a analisar o perfil metabólico em tempo real de organoides de criptas intestinais de camundongo usando o analisador de fluxo extracelular XF 24. Este método permite estudar a função metabólica de organoides primários ex vivo.

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Este estudo foi apoiado por subsídios SR1 CA 135.561, R01 CA151494, R01 CA174432 e P3013330 do National Institutes of Health. Gostaríamos de agradecer a Michele Houston, Elena Dhima e Dr. Anna Velcich por seus valiosos comentários no desenvolvimento do protocolo de isolamento cripta. Agradecemos também a Formação Diabetes e Centro do Albert Einstein College of Medicine apoiado pelo NIH P60DK20541 Research, e Dr. Michael Brownlee e Dr. Xue Liang-Du, que dirigem e operar as instalações do cavalo marinho, respectivamente.

Este estudo foi realizado de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética de Experimentação Animal do Albert Einstein College of Medicine. 1. Crypt Isolamento e Cultura <ol><li> O isolamento das criptas do intestino delgado: <ol><li> Isolar criptas intestinais de qualquer modelo de ratos de interesse. Euthanize os ratos com CO 2, seguida por deslocação cervical. </li><li> Abra o abdômen longitudinalmente e encher o intestino delgado (SI) com soro fisiológico frio gelo fosfato tamponada, PBS (-Ca 2+; Mg 2+) com 2x antibiótico-antimicótico (anti-anti). Rapidamente isolar intestino delgado. </li><li> Completamente dissecar livre de gordura mesentérica usando um bisturi. Tenha cuidado para não perfurar o tecido - em todos os momentos manter o tecido úmido com PBS gelado. Abra-se inteStine longitudinalmente e lavar cuidadosamente com PBS gelado. </li><li> Corte intestino delgado em duas seções e achatar usando uma ponta de algodão molhado, raspe fora as vilosidades usando uma lâmina pré-resfriada. Lave vigorosamente em PBS gelado várias vezes. </li><li> Incubar 3 min, em 20 ml de 1x PBS por 3 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) /0.5 mM de ditiotreitol (DTT) para a dissociação não-enzimática do tecido. </li><li> Corte o tecido em pedaços pequenos (2-4 mm), usando uma lâmina de barbear em uma lâmina pré-resfriada. Transferem-se as peças em um tubo de 50 ml contendo 20 ml de PBS gelado. </li><li> Pipeta cima e para baixo suavemente 10x utilizando uma pipeta de 10 ml descartável estéril. Vamos fragmentos de tecido sedimentar por gravidade. Retirar o sobrenadante com uma pipeta. Repita mais três vezes; certifique-se sobrenadante é clara. </li><li> Adicionar 20 ml de PBS por EDTA 2 mM. Redemoinho e incubar a 4 ° C durante 30 min com agitação suave. </li><li> Deixe sedimento de tecido e descartar o sobrenadante. Adicionar 15 ml de PBS gelado e pipetacima e para baixo de 5x com uma pipeta de 10 ml. Deixe os fragmentos de tecido de sedimentos e recolher o sobrenadante como Fração 1 (F1). Repetir recolha F2-F5, mantidas separadamente cada fracção. </li><li> Adicionar 15 ml de PBS gelado e desta vez agitar vigorosamente à mão por 15 segundos. Colete F6 e repita para F7, F8. Se pedaços de tecido começar a flutuar, toque para ajudá-los a resolver. </li><li> Inspeccionar uma aliquota de cada fracção sob o microscópio. Reunir as fracções contendo criptas. </li><li> Passar as fracções reunidas através de um filtro de células de 70 mm de nylon, recolhendo criptas em um tubo de 50 ml. </li><li> Centrifugar a 100 xg durante 5 min a 4 ° C, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 10 ml de PBS gelado com criptas anti-anti 2x e transferência para um tubo de 15 ml. Repetir a lavagem mais uma vez. </li><li> Lave as criptas uma vez com 10 ml gelada ADF, Advanced DMEM / F-12 (Dulbecco &quot;s Modified Eagle Medium / Ham&quot; s F-12) - 2x anti-anti. </li><li> Lavam-se as criptas uma vez com 10 ml UmaDF - 1x anti-anti. </li><li> Conte as criptas utilizando um hemocitômetro. Ajustar o volume da solução cripta e transferir para um tubo de 1,5 ml, de modo que a concentração final quando cripta ressuspensas será 100-500 criptas por cada 50 uL de mistura de proteína gelatinosa (Matrigel). Centrifugar a 100 xg durante 5 min a 4 ° C e colocar a mistura em criptas proteína gelatinosa. </li><li> Placa 50 ul de suspensão cripta - mistura gelatinosa proteína por poço numa placa de 24 poços (área de crescimento: 2 cm2), colocando cuidadosamente gota a suspensão no centro de cada poço. Manter a placa numa CO 2, 37 ° C incubadora durante ~ 30 min, até que a suspensão se solidifica. </li><li> Adicionar 500 ul meios de gelo frio de cultura completo (Avançada DMEM / F12 com 1x anti - anti, 10 mM ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES), GlutaMAX 1x, 1x suplemento B27, 1x suplemento N2, 1 mM N-acetil-L-cisteína (NAC), / ml de factor de crescimento epidérmico 50 ng (EGF), 100 ng / mlNoggin, 500 ng / ml de R-espondina). <ol><li> Reconstituir factores de crescimento em 0,1% de Albumina de Soro Bovino (BSA) em PBS. </li></ol></li></ol></li><li> Crypt organóide Cultura e Passage: <ol><li> Passagem Organóides criptas 14-21 dias após sementeira (ou conforme necessário) como se segue: <ol><li> Alterar mídia toda sexta-feira e segunda-feira. Às quartas-feiras, substitua metade da media com meio fresco. </li></ol></li><li> Remover o meio de cultura. Lava-se a amostra duas vezes com 500 ul de PBS a intervalos de 5 min. </li><li> Remover PBS e quebrar delicadamente até a mistura gelatinosa de proteína usando um P1000 estéril micro ponteira. </li><li> Adicionar 1 ml de meio de cultura completo para um único poço e ressuspender as Organóides em 1 ml de meio. </li><li> Gentilmente interromper as Organóides usando um P1000 por pipetagem cima e para baixo 20-30x (verifique sob o microscópio para a dissociação organóide adequada com um bom rendimento cripta até uma técnica consistente é desenvolvido). </li><li> Transferem-se as criptas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml;centrifugar a 100 xg a 4 ° C, 5 min. </li><li> Lava-se a pelete duas vezes com 1 ml de meio de cultura completo. </li><li> Dividir a uma razão de 1: 3 ou 1: 6, conforme necessário, ressuspensão criptas em 50 ul por poço de Matrigel. Proceda como descrito acima (seção 1.1.16-18). </li></ol></li><li> Crypt congelamento organóide: <ol><li> Remover o meio de cultura. Lavar a amostra em 500 mL de PBS. </li><li> Dispersa-se a mistura gelatinosa de proteína utilizando uma ponta de pipeta P1000. </li><li> Adicionar 1 ml de mídia para um único poço e voltar a suspender as Organóides em 1 ml de mídia. </li><li> Cuidadosamente, quebre os Organóides usando um P1000 por pipetagem cima e para baixo 20-30x. </li><li> Transfira os Organóides a um tubo de 1,5 ml. Centrifuga-se a 100 xg a 4 ° C, 5 min. </li><li> Lava-se a pelete duas vezes com 1 ml de meio de cultura completo. </li><li> Criptas Ressuspender em 500 mL de mídia congelamento. </li><li> Criptas transferência para um tubo criogénico, colocar o tubo em um recipiente e loja de congelação de -80 ° C congelador overnight. </li><li> Transferir para criptas N2 líquido do tanque. <ol><li> Recuperar Organóides cripta congeladas pelo rápido degelo em um banho de água a 37 ° C. Lava-se com 500 ul meios de cultura completo uma vez, centrifugar a 100 xg, 5 min e ressuspender em mistura gelatinosa de proteína, e da cultura como descrito acima. Para uma melhor recuperação, adicione inibidor ROCHA (Y-27632) para a mídia congelamento. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Crypt organóide Metabolismo Ensaio <ol><li> 24 poços Preparação Plate: <ol><li> Isolar e contar criptas de acordo com o protocolo (ver secção 1.1 para isolamento cripta e 1.2 para a passagem cripta). </li><li> Criptas Ressuspender em mistura de proteína gelatinosa (100-200 criptas por 20 l). </li><li> Placa de suspensão mistura de proteínas cripta-gelatinoso numa placa de 24 poços de ensaio (certificar-se de que há pelo menos três repetições para cada amostra) e permitir que a suspensão para solidificar a 37 ° C num CO 2incubadora; em seguida, adicione 500 mL de meios de cultura completo. </li><li> Criptas Cultura (conforme descrito na seção 1.1) e observar ao microscópio até criptas crescer em Organóides totalmente desenvolvidos. </li></ol></li><li> Extracelular Flux Ensaio: <ol><li> Hidrato de cartucho durante a noite num não-CO 2 (0% de CO2), 37 ° C incubadora. </li><li> Remover o meio de cultura e lavar Organóides duas vezes com 500 ul de DMEM (sem: glucose, L-glutamina, piruvato de sódio e bicarbonato de sódio; e com: vermelho de fenol). Espere 5 min. </li><li> Adicionar 675 ul por poço meio de ensaio (DMEM com 2 mM de L-glutamina e 5 mM de D-glicose) a cada poço. </li><li> Verificar cripta Organóides morfologia microscópica para garantir que Organóides e a mistura gelatinosa proteína estão intactos depois as lavagens. Incubar 1 hora em um não-CO 2, 37 ° C incubadora. </li><li> Preparar 10 uM compostos injectáveis ​​(oligomicina, carbonil-cianeto de p-trifluoro-metoxi-fenil-hidrazona (FCCP), rotenone) no meio de ensaio. </li><li> Set-up do cartucho através do carregamento de 75 mL de 10 mM compostos injetáveis ​​nas portas da sequencialmente cartucho: Port A - oligomicina; Porto B - FCCP; e Port C - rotenona (As concentrações finais no ensaio serão de 1? M). </li><li> Incubar cartucho 30 min - 1 hr a 37 ° C numa incubadora com CO 2 não. </li><li> Ao mesmo tempo, ligue o XF Analyzer e criar o modelo de protocolo de ensaio. </li><li> Coloque cartucho e placa utilidade em XF Analyzer e executar &quot;calibrar&quot; cartucho. </li><li> Verifique Organóides cripta microscopicamente para se certificar de que eles estão ligados à mistura de proteína gelatinosa. </li><li> Célula de carga em placa de cultura de protocolo do ensaio instrumento e correr. </li></ol></li></ol>

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<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li>
<li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li>
</ol>

Não há divulgações.

Testamos a taxa de consumo de oxigénio (OCR) e a taxa de acidificação extracelular (ECAR) de criptas isolados a partir de 8 meses de idade e ratinhos cultivadas em Organóides ex vivo. Após a medição da taxa basal, metabolismo cripta foi avaliada adicionando oligomicina, cianeto de carbonilo -p-Trifluormetoxifenilidrazona (FCCP) e rotenona, sequencialmente. Basal OCR e ECAR basal foram gravadas 0-29 min (Figura 2A e 2B). No dia 29 min, oli...

O câncer colorretal (CCR) é a terceira principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos. Câncer de cólon esporádico - ou seja, que resulta mais tarde na vida (&gt; 50 anos de idade) e sem fatores predisponentes genéticos claras - contas para ~ 80% de todos os casos, com incidência fortemente influenciada por padrões alimentares a longo prazo 1,2. Estes tumores exibem um desvio metabólico no sentido para a glicólise oxidativo, conhecido como o efeito de Warburg, que pode, em parte, tornar as concentrações mais elevadas de blocos de construção celulares e energia disponíveis (através glutaminolysis) para permitir a conduzir e, talvez, as altas taxas de proliferação de células tumorais 3-5 . Estudos de câncer de cólon, bem como outros cânceres gastrointestinais, incluindo cânceres do intestino delgado fornecer informação importante sobre a causa da formação de tumores. Investigando as diferenças metabólicas entre os estados normais, pró-tumorigênicos e tumorigênicos de sistemas de órgãos gastrointestinais podem ajudar determination de risco relativo para o desenvolvimento do tumor, bem como a detecção precoce de neoplasia. Além disso, a compreensão do metabolismo bioenergético envolvendo respiração mitocondrial e da glicólise irá fornecer informações fundamentais sobre a forma como a fisiologia celular, o envelhecimento e as doenças estado perturba a homeostase intestinal. A utilização da tecnologia de ensaio para análise bioenergética fluxo extracelular pode avaliar as taxas de respiração mitocondrial e, simultaneamente, a glicólise em células que crescem em cultura em tempo real, 6,7. Até recentemente, os estudos in vitro de intestino delgado foram limitadas a linhas celulares derivadas de tumores benignos ou malignos ou 8,9 e não representam a fisiologia do epitélio intestinal normal e a influência do microambiente em que residem. Em 2009, Sato et al. 10 introduziu um sistema de cultura ex vivo para crescer tridimensional do mouse (3D) Organóides intestinais epiteliais, ou epithElial &quot;mini-coragem&quot;, adequado para investigações experimentais, diagnósticos e terapêuticos 10,11. Além disso, criptas isolados de ratos sob restrição calórica manter suas propriedades de crescimento alterados como Organóides em tais culturas 12. Em comparação com linhas celulares transformadas, culturas organï¿½de criptas pode ser usado para gerar os dados fisiologicamente relevantes que apresentem um modelo muito melhor para compreender o estado in vivo. Nós adaptamos a tecnologia de análise bioenergética para ensaio de metabolismo energético de Organóides cripta intestinal. Rato cripta intestinal Organóides foram cultivadas ex vivo para desenvolver os estudos do metabolismo energético organóide cripta apresentados. A taxa de consumo de oxigénio (OCR) e a taxa de acidificação extracelular (ECAR) de Organóides criptas foram medidos na ausência e na presença de dois diferentes inibidores metabólicos (oligomicina, rotenona) e um transportador de iões (carbonil-cianeto de p-Trifluormetoxifenilidrazona). A cripta orgaresposta metabólica noid a estes compostos químicos foram refletidos com sucesso através da mudança ECAR e valores de OCR. Estudos bioenergéticos celulares irá elucidar as interações recíprocas entre o estado metabólico e risco de doença e fenótipo em câncer, obesidade, diabetes, distúrbios metabólicos e doenças mitocondriais e ajudar métodos de rastreio antecipadamente com implicações diretas para a medicina translacional. Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para isolar pequenas criptas intestinais e Organóides cripta cultura. Além disso, introduzimos um novo método de usar culturas organóide cripta para ensaios metabólicos.

<table><tbody><tr><td>Matriz de Membrana Embasável BD Matrigel, TFR, Sem Vermelho de Fenol, Sem LDEV</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>PBS (solução salina tamponada com fosfato), sem magnésio, sem cálcio, pH 7.2</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12 (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Águia Modificada&prime; s Meio sem glicose, L-glutamina, vermelho de fenol, piruvato de sódio e bicarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>Sal de sódio vermelho de fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4758</td><td>Concentração final 15 mg/l em DMEM (D5030) - <forte>etapa 2.2.2</forte></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico, 100x, 100 ml</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Concentração final 1x ou 2x</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina, liquid</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Concentração final 1x</td></tr><tr><td>Gibco&reg; GlutaMAX&trade; suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>Concentração final 1x</td></tr><tr><td>Gibco&reg; HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano sulfônico), 1 M</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>Concentração final 10 mM</td></tr><tr><td>N-acetil-L-cisteína, 25 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-25G</td><td>Concentração final 1 mM</td></tr><tr><td>100x suplemento N-2, líquido</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Concentração final 1x</td></tr><tr><td>50x B-27&reg; suplemento menos Vitamina A, líquido</td><td>Invitrogen</td><td>12587-010</td><td>Concentração final 1x</td></tr><tr><td>R-Espondina 1 de camundongo recombinante, CF, 50 &mu; g</td><td>R& D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>Concentração final 500 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF murino recombinante, 100 &mu; g</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>Concentração final 50 ng/ml</td></tr><tr><td>Recombinante Murine Noggin, 20 &mu; g</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>Concentração final 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Gibco&reg; L-glutamina, 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Concentração final 2 mM</td></tr><tr><td>Gibco&reg; glicose em pó</td><td>Life Technologies</td><td>15023-021</td><td>Concentração final 5 mM</td></tr><tr><td>Ambion&reg; 0.5 M EDTA (ácido etilenodiaminotetracético), pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>AM9260G</td><td>Concentração final 3 mM para <forte>passo 1.1.5</forte>; 2 mM para <forte>passo 1.1.8</forte></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>DTT (dithiothreitol), 1M</td><td>Life Technologies</td><td>P2325</td><td>Concentração final 3 mM</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td>0.1% em PBS</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>1% em PBS</td></tr><tr><td>Recovery&trade; Meio de congelamento</td> de cultura celular <td>Life Technologies</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>inibidor de ROCK (Y-27632)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>Concentração final 10 &mu; </td></tr><tr><td>M Oligomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td>Concentração final 1 &mu; M</td></tr><tr><td>Carbonilo cianeto-p-trifluoro-metoxi-fenil-hidrazona (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>Concentração final 1 &mu; M</td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>Concentração final 1 &mu; M</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>Concentração final 0,1 N em PBS</td></tr><tr><td>XF24 Analisador de Fluxo Extracelular (Analisador XF)</td><td>Biociência</td><td></td><td></td> do Cavalo-marinho</tr></tbody></table>

tempo real análise do perfil metabólico em ex vivo culturas mouse intestinal crypt organóide

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

A mucosa do intestino delgado apresenta uma arquitetura repetitivo organizado em duas estruturas fundamentais: vilosidades, projetando para o lúmen intestinal e composto por enterócitos maduros, células caliciformes e células enteroendócrinas; e criptas, residentes proximal para a submucosa e muscularis, abrigando estaminais adultas e nas células progenitoras e células de Paneth madura, bem como do estroma e as células imunes do microambiente cripta. Até aos últimos anos, estudos in vitro do intestino delgado foi limitado a linhas celulares derivadas de tumores benignos ou malignos, e não representam a fisiologia do epitélio intestinal normal e a influência do microambiente em que residem. Aqui, demonstramos um método adaptado de Sato et al. (2009) para a cultura de Organóides das criptas intestinais do rato primárias derivadas de ratinhos C57BL / 6. Além disso, apresentamos a utilização de culturas organóide cripta para analisar o perfil metabólico cripta em tempo real por medidamento do consumo basal de oxigênio, a taxa glicolítica, a produção de ATP e da capacidade respiratória. Organóides manter as propriedades definidas por sua origem e reter os aspectos de sua adaptação metabólica refletido pelo consumo de oxigênio e taxas de acidificação extracelular. Estudos metabólicos em tempo real no presente cripta organï¿½de sistema de cultura são uma ferramenta poderosa para estudar o metabolismo da energia organï¿½de cripta, e como ela pode ser modulado por factores nutricionais e farmacológicas.

Organóides da cripta foram estabelecidos a partir de oito meses de idade camundongos C57BL / 6 alimentados com dieta purificada roedor Instituto Americano de Nutrição 76A (AIN76A). Organóides criptas intestinais podem ser cultivadas em cultura durante longos períodos de tempo a partir de um único cripta (Figura 1A, única seta vermelha). Organóides crescer para fora da cripta estruturas semelhantes em 18-20 dias em cultura (Figura 1B, setas vermelhas). Criptas foram passadas a cada 3 sem...

Pequenas Organóides cripta intestinal cultivadas ex vivo, proporcionam um sistema de cultura de tecidos que recapitula o crescimento das criptas dependentes de células-tronco e seu nicho. Foi estabelecido um método para ensaiar o perfil metabólico em tempo real em Organóides das criptas do rato primária. Encontramos Organóides manter as propriedades fisiológicas definidas por sua origem.

Tempo real Análise do Perfil metabólico em Ex Vivo Culturas mouse Intestinal Crypt organóide

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

O objetivo deste procedimento é testar o perfil metabólico de organoides primários de cripta de camundongo em tempo real. Isso é feito primeiro coletando o intestino delgado do camundongo, seguido pelo isolamento das criptas intestinais que Andre dobra em matrigel. O segundo passo é cultivar as criptas até que formem organoides de cripta totalmente crescidos.O próximo passo é a preparação de um ensaio de cartucho para estudos metabólicos. A etapa final é carregar o cartucho e a placa de utilidade no analisador de fluxo extracelular XF 24 e executar a análise de fluxo extracelular para medir a taxa de consumo de oxigênio e a taxa de acidificação extracelular dos organoides da cripta K. Em última análise, este procedimento permite o estudo do perfil metabólico de organoides primários de criptas intestinais de camundongos em tempo real.A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o uso de cultura de células para ensaios metabólicos, é que ela nos permite avaliar o metabolismo de órgãos criptográficos intestinais em tempo real. As culturas organoides imitam o estado imunológico com mais precisão, e isso ajuda a gerar dados mais relevantes fisiológicos. A técnica

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Biologia

Neste vídeo, demonstramos uma técnica para isolar criptas inteiras do intestino delgado de um camundongo. As criptas inteiras isoladas podem ser usadas para propagar organoides 3D de longa duração e auto-renovação in vitro.

Isolamento de criptas intestinais: um método para isolar criptas inteiras do intestino delgado do modelo murino

Neste vídeo, descrevemos a metodologia para configurar um sistema de cultura de órgãos intestinais ex vivo para estudar as interações entre fragmentos de tecido intestinal de camundongos e bactérias intestinais específicas. O dispositivo consiste em dois pares de portas de entrada e saída, a primeira conectando o lúmen do tecido intestinal e fornecendo a suspensão bacteriana específica a ele, e a segunda fornecendo continuamente meios aos poços do dispositivo para manter a viabilidade do tecido...

Um sistema de cultura de órgãos intestinais ex vivo para estudar as interações hospedeiro-microbiota

A tecnologia de imagem aprimorada está permitindo imagens tridimensionais de órgãos durante o desenvolvimento. Aqui descrevemos todo um sistema de cultura de órgãos que permite imagens ao vivo das vilosidades em desenvolvimento no intestino fetal de camundongo.

Rato Fetal Whole Intestino Sistema de Cultura para Ex Vivo Manipulação de vias de sinalização e tridimensional Imagens ao vivo de Desenvolvimento Villus

Neste protocolo de vídeo, damos uma explicação passo a passo da transdução lentiviral em organoides do epitélio intestinal primário e do processamento e análise a jusante dessas culturas por RT-PCR quantitativo, RNA-microarray e imuno-histoquímica.

Um Protocolo de Transdução Lentivirus e Análise de Downstream da Intestinal Organóides

Aqui, um protocolo para a colheita, manter, e tratar rato pequenas Organóides intestinais com padrões de agentes patogénicos associados moleculares (PAMPs) e Listeria monocytogenes é descrito, bem como a ênfase na expressão de genes e técnicas de normalização adequada para a proteína.

o<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura e Reconhecimento de Padrões Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organóides

Este protocolo descreve a medição da permeabilidade da barreira epitelial em tempo real seguir tratamento farmacológico em organoids intestinal humana, usando microscopia fluorescente e vive microscopia de célula.

Medição em tempo real da permeabilidade da barreira epitelial no Organoids Intestinal humana

Nós descrevemos instruções passo a passo para: 1) eficientemente projetar organóides intestinais usando nanopartículas magnéticas para Lenti-ou transdução retroviral, e, 2) gerar seções congeladas a partir de organóides projetados. Esta abordagem fornece uma poderosa ferramenta para alterar eficientemente a expressão gênica em organóides para investigação de efeitos a jusante.

Engenharia genética de organóides intestinais do camundongo primário usando vetores virais de transdução de nanopartículas magnéticas para seccionamento congelado

Este artigo apresenta um método único para analisar as interações hospedeiro-microbioma usando um novo sistema de cultura de órgãos intestinais para experimentos ex vivo.

Um sistema de cultura de órgãos intestinais para analisar interações hospedeira-microbiota

O presente protocolo descreve um método para detectar espécies reativas de oxigênio (ROS) nos organoides murinas intestinais utilizando imagens qualitativas e ensaios quantitativos de citometria. Este trabalho pode ser potencialmente estendido a outras sondas fluorescentes para testar o efeito de compostos selecionados em ROS.

Analisando o estresse oxidativo em organoides intestinais murinos usando sonda fluorogênica sensível à espécie de oxigênio reativa

O presente protocolo descreve o estabelecimento de um sistema organoide colônico murino para estudar a atividade e o funcionamento das células-tronco colônicas em um modelo knockout de claudina-7.

Cultura tridimensional de criptas colônicas murinas para estudar a função das células-tronco intestinais ex vivo

Descrevemos um protocolo para isolar criptas murinas do intestino delgado e cultura de organoides intestinais 3D das criptas. Adicionalmente, descrevemos um método para gerar organoides a partir de uma única célula-tronco intestinal na ausência de um nicho celular subepitelial.

A Cultura 3D de Organoides de Criptas Intestinais Murinas e uma Única Célula-Tronco para Pesquisa de Organoides

Aprenda a analisar o perfil metabólico em tempo real de organoides de criptas intestinais de camundongo usando o analisador de fluxo extracelular XF 24. Este método permite estudar a função metabólica de organoides primários ex vivo.

Tempo real Análise do Perfil metabólico em Ex Vivo Culturas mouse Intestinal Crypt organóide

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