Name: Caracterizar a composição de motores moleculares sobre Movimentação axonal Carga Utilizando Análise Mapeamento Cargo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Aprenda a caracterizar motores moleculares associados ao transporte axonal de cargas em neurônios de hipocampo de camundongo usando dispositivos microfluídicos e microscopia de imunofluorescência. Este método correlaciona a composição de proteínas motoras com a direcionalidade do movimento.

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Agradecemos a Ge Yang, Gaudenz Danuser, Khuloud Jaqaman e Daniel Whisler pela assistência na adaptação e desenvolvimento do software para quantificar as análises de mapeamento de carga, e a Emily Niederst pela ajuda na fabricação dos dispositivos microfluídicos. Este trabalho foi apoiado em parte pela AG032180 de subsídios do NIH-NIA para LSBG e para o Howard Hughes Medical Institute. LS foi apoiado em parte por uma bolsa de treinamento em bioinformática do NIH T32 GM008806, SEE foi apoiado por uma bolsa da Damon Runyon Cancer Research Foundation, NIH Neuroplasticity Training Grant AG000216 e por uma doação do The Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award, G.E.C foi apoiado por um prêmio NIH / NCATS 1 TL1 TR001114 e pela fundação Achievement Rewards for College Scientists.

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O protocolo aqui apresentado permite a correlação de direcionalidade do movimento de partículas fluorescentes de carga em movimento baseado em microtúbulos individuais com o tipo de relação e quantidade de proteínas motoras associadas em neurônios vivos. Anteriormente, a composição do motor total de cargas vesiculares axonal foi analisada em populações heterogêneas de vesículas e organelas 9,15 bioquimicamente purificados. No entanto, a caracterização composição do motor para um único</e...

Transporte intracelular é crucial em todos os tipos de células para a administração de proteínas, membranas, organelos, e moléculas de sinalização celulares a vários domínios 1. Os neurônios são células altamente especializadas, com, projeções polarizadas longos que criticamente dependem do transporte intracelular de cargas essenciais para a sua entrega de longa distância para várias microdomínios axonal. Este transporte é mediado por kinesins e dyneins - duas grandes famílias de proteínas motoras moleculares - que se ligam às cargas e acompanhar ao longo dos microtúbulos polarizados em anterógrada e retrógrada direções, respectivamente. Enquanto movimento retrógrado é mediada principalmente por dineína, o movimento na direcção anterógrada é facilitada por uma grande família, funcionalmente diversificada de motores de cinesina. Consequentemente, o transporte de cargas axonal anterógrado poderia ser mediada por vários membros da família do kinesin superfamília 1-5. Apesar de algumas cargas mover persistentemente em qualquer direção, mcargas ost mover bidirecionalmente e reverter freqüentemente em seu caminho para seus destinos finais 1,5-13. Além disso, demonstrou-se que os motores de direccionalidade associado opostas simultaneamente às cargas, levantando a questão sobre a forma como o movimento regulado de cargas é coordenado por motores de polaridade oposta 5-7. Juntos, o transporte de cargas axonais é um processo concertada que é regulada pela composição dos motores e das suas actividades bioquímicas específicas, que por sua vez são dependentes de vários adaptadores e parceiros de ligação de regulação 14. Para descrever fielmente o mecanismo de transporte axonal para uma carga específica e para descobrir a regulação subjacente de que o transporte, é fundamental para determinar a composição de proteínas a motor e seus parceiros de ligação regulamentares associadas com cargas individuais durante o seu transporte de animais vivos. Outros métodos, como por exemplo abordagens bioquímicas, fornecer estimativas de mot médiaou composições sobre as populações heterogêneas vesícula purificados, mas estas estimativas não revelam o tipo ou a quantidade de motores associados ao único vesículas móveis. Além disso, a reconstituição do transporte de vesículas ao longo dos microtúbulos pré-montados in vitro permitiu a medição da quantidade de um tipo de motor em um único nível de vesícula 15. No entanto, estas experiências não se correlacionam directamente a quantidade de motores eléctricos com as características de transporte dessas vesículas, e medido o transporte, na ausência de factores de regulação celular. Um protocolo aqui é apresentado, o qual determina a composição do motor (tipo e quantidade relativa de motores), da vesículas que se deslocam individuais a partir de imunofluorescência (IF) de dados de medição endogenamente expressa proteínas do motor, e correlaciona-se esses parâmetros para o transporte directo de exactas as mesmas vesículas em neurónios 16. Este método implica mapeamento preciso dos dados IF-to-live movimentação de cargas. Isto é conseguido por growing neurónios do hipocampo de rato em dispositivos de microfluidos de acordo com protocolos estabelecidos 17-19. Estes dispositivos permitem a identificação e correlação (&quot;mapeamento&quot;) dos axônios e cargas móveis individuais nas modalidades de microscopia de luz fixa e ao vivo (Figura 1). Neurônios cultivados são transfectadas com proteínas de carga fluorescente etiquetado cujo transporte é fotografada em alta resolução espacial e temporal para obter informações detalhadas movimento que é representada em kymographs. Durante o curso de imagiologia, os neurónios foram fixados com paraformaldeído, e subsequentemente corados com anticorpos contra as proteínas endógenas a motor. De carga e motor imagens fixas são sobrepostos kymographs movimento vivo de &quot;mapa&quot; (colocalize) los para a carga viva movimento trajetórias 16. Correlacionar o movimento vivo das cargas com a associação de proteínas motoras, co-localização é analisado usando um pacote de software MATLAB custom made chamado de &quot;Motor co-localização &quot;16,20. Cargas e motores marcados com fluorescência gerar recursos limitados puntiformes-difração que podem se sobrepõem parcialmente. Para resolver a situação de sobreposição de pontos lacrimais, o primeiro software ajusta automaticamente as funções de Gauss para cada função de dispersão, o que representa puncta fluorescente indivíduo, para determinar a sua posição exacta XY sub-pixel coordena e intensidade amplitudes 21-23. As posições dos motores e cargas são subsequentemente comparados uns com os outros para determinar colocalização 16,20. Por conseguinte, este método atribui mais precisamente entre pontos lacrimais colocalização de fluorescência em comparação com outros métodos de 24. A robustez do método é a capacidade de avaliar a co-localização dos motores com carga indivíduo em células fixas, para as quais trajectórias de movimento vivos (por exemplo, a direcção em que eles se moviam no momento da fixação) foram recorded. Com este método, cinesinas e dyneins foram encontrados para associar simultaneamente a vesículas que transportam a proteína prião normal (PrP C CELULARES), uma carga que se move neuronalmente enriquecido bidireccionalmente ou permanece estacionário em 16 axónios. Esta análise permitiu a formulação de um modelo de trabalho para a regulamentação da PrP C movimento vesícula em que anterógrada (kinesin) e (dineína) motores retrógradas coordenar suas atividades, a fim de mover as vesículas em qualquer direção ou permanecer parado enquanto associada à carga . Outra força deste método é a sua potencial aplicabilidade ampla para a caracterização de uma co-localização / associação de muitas cargas marcadas com fluorescência que se movem em virtualmente qualquer tipo de célula, com qualquer outra proteína (s) de interesse. Assim, a correlação vivo / fixo poderia potencialmente permitir a detecção de interacções proteína-transientes de carga, como muitos fluorescentemente marcado indivíduo partículas em movimento pode ser analisado ao longo de um p desejareríodo de tempo. Dada a aplicabilidade ampla e do tipo de questões que este método pode resolver, este protocolo vai ser de interesse para um grande público de biólogos celulares, incluindo aqueles que estudam o tráfico eo transporte em neurônios ou em outros tipos de células.

<table><tbody><tr><td>poli-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>P5899-20mg</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM (Dulbecco' s Modified Eagle Medium) High Glucose, c/ L-Glutamina, s/ Sodium Pyruvate (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Serum Free Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX I Suplemento (100x)</td><td>Life Tecnologias</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1x) (Hank' s Solução salina balanceada)</td><td>Life Technologies</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco' s Phosphate Buffered Saline, sem Magnésio, sem Cálcio (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Corning cellgro Water para Cultura de Células&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT46000CM</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>USB Corporation</td><td>19925</td><td></td></tr><tr><td>DL-cisteína HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9768</td><td></td></tr><tr><td>BSA (albumina de soro bovino)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I grau II</td><td>Roche Applied Sciences</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp; </td><td></td>11668027</tr><tr><td>Solução de Formaldeído 16% EM Grau Fisher</td><td>Scientific</td><td>50980487</td><td>Cuidado: Nocivo por inalação, em contato com a pele e se ingerido. Irritante para os olhos, sistema respiratório e pele. Descarte de acordo com os regulamentos oficiais.</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H-3375</td><td></td></tr><tr><td>Soro de burro normal</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>017-000-0121</td><td></td></tr><tr><td>BSA livre de ácidos graxos e IgG Jackson</td><td>Immuno Research</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2403-4</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td></td></tr><tr><td>Reagente antidesvanecimento ProLong Gold</td> Life <td>Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de Vidro 1 1/2. Dispositivo microfluídico de 24 x 40 mm</td><td>Corning</td><td>2980-244</td><td></td></tr><tr><td>Eixo, 450 &micro; m</td><td>Millipore</td><td>AX450</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U&nbsp;</td><td>Câmera Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coolsnap HQ&nbsp;</td>Prato de cultura de células <td>Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-95</td><td></td></tr><tr><td>Prato de cultura de células de 150 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-100</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos Usados:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Cadeia leve anti-cinesina, V-17</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>especificidade sc-13362</td><td>verificada usando neurônios KLC1-/- (Ref. 16), diluição recomendada 1:100.</td></tr><tr><td>Corrente Pesada Anti Dineína 1, R-325</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>especificidade sc-9115</td><td>verificada usando shRNA contra DYN1HC1 (Ref. 16), diluição recomendada 1:100</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Anticorpo IgG Anti-Coelho para Burros</td><td>Life Technologies</td><td>A10042</td><td>&nbsp; Diluição recomendada 1:200.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Anti-Coelho IgG (H+L) Anticorpo para Burro</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td>&nbsp; Diluição recomendada 1:200.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Anticorpo Anti-Cabra IgG (H+L) para Burro Life</td><td>Technologies</td><td>A11057</td><td>&nbsp; Diluição recomendada 1:200.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Anticorpo</td><td>Life Technologies</td><td>A21447</td><td>&nbsp; Diluição recomendada 1:200.</td></tr><tr><td colspan="4">Plugins e Macros</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td><a href="http://imagej.nih.gov/ij/index.html">&nbsp; http://imagej.nih.gov/ij/index.html.&nbsp; </a></td></tr><tr><td>ImageJ Kymograph Plugin</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html">http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html.</a></td></tr></tbody></table>

caracterizar a composição de motores moleculares sobre movimentação axonal carga utilizando análise &quot;mapeamento cargo&quot;

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

Compreender os mecanismos pelos quais motores moleculares coordenam suas atividades para o transporte de cargas vesiculares dentro dos neurônios requer a análise quantitativa de associações motor / carga ao nível da vesícula única. O objetivo deste protocolo é a utilização de microscopia de fluorescência quantitativa correlacionar (&quot;mapa&quot;) a posição e direcionalidade do movimento de cargas vivas à composição e relativas quantidades de motores associados com a mesma carga. &quot;Mapeamento Cargo&quot; consiste em imagens ao vivo de cargas marcados com fluorescência que se deslocam em axônios cultivadas em dispositivos microfluídicos, seguido de fixação química durante a gravação de movimento ao vivo, e posterior imunofluorescência (IF) coloração das mesmas regiões axonal exatas com anticorpos contra motores. Co-localização entre cargas e seus motores é avaliada através da atribuição de posição sub-pixel coordena a canais de motor e de carga, por funções de Gauss de montagem para a difração-liMITED funções ponto de propagação representam fontes pontuais fluorescentes individuais. De carga e motor imagens fixas são posteriormente sobreposta a parcelas de movimentação de cargas, para &quot;mapear&quot; os a suas trajetórias de rastos. A força deste protocolo é a combinação de viver e se os dados para gravar tanto o transporte de cargas vesicular em células vivas e para determinar os motores associados a essas mesmas vesículas exatas. Esta técnica ultrapassa os desafios anteriores que utilizam métodos bioquímicos para determinar a composição média do motor de populações heterogéneas de vesículas granel purificados, uma vez que estes métodos não revelam composições em cargas móveis individuais. Além disso, este protocolo pode ser adaptado para a análise de outras vias de transporte e / ou de tráfico em outros tipos de células para correlacionar o movimento das estruturas intracelulares individuais com a sua composição proteica. As limitações deste protocolo são a relativamente baixa taxa de transferência devido à baixa eficiência de transfecção de culturaneurônios primários e um campo de visão limitado disponível para imagens de alta resolução. As aplicações futuras poderão incluir métodos para aumentar o número de neurónios que expressam cargas marcados com fluorescência.

A Figura 1 mostra uma vista geral do dispositivo de microfluidos usadas para crescer neurónios do hipocampo (Figura 1A, B). Os neurónios são banhados no reservatório 1. O tamanho dos microcanais impede a difusão dos corpos celulares (soma) no compartimento axonal enquanto que o comprimento dos canais evita projecções dendríticas a partir de atravessar todo o caminho para o compartimento axonal. Depois de ~ 2-3 dias em cultura, os neurônios começam a estender seus axônios através de micr...

O transporte intracelular de cargas, como vesículas ou organelas, é realizado por proteínas motoras moleculares que rastreiam microtúbulos polarizados. Este protocolo descreve a correlação da direcionalidade do transporte de partículas de carga individuais que se movem dentro dos neurônios, com a quantidade relativa e o tipo de proteínas motoras associadas.

Caracterizar a composição de motores moleculares sobre Movimentação axonal Carga Utilizando Análise &quot;Mapeamento Cargo&quot;

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

O objetivo geral do mapeamento de carga é determinar a quantidade relativa e o tipo de proteínas motoras moleculares que se associam e movem cargas vesiculares e correlacionar essa composição de motores com uma direcionalidade do movimento de carga viva. Isso é feito primeiro crescendo neurônios primários do hipocampo de camundongos em dispositivos microfluídicos, de modo que os axônios cresçam relativamente retos e registrando o movimento intracelular vivo de proteínas de carga marcadas com fluorescência nos axônios de neurônios transitoriamente transfectados. O segundo passo é fixar os neurônios durante o curso da imagem de carga viva e, posteriormente, corar os axônios com anticorpos contra proteínas motoras moleculares, como cinesina e dines, seguido de imagem de microscopia de imunofluorescência.Em seguida, as imagens de carga fixa e motor são alinhadas aos gráficos de movimentação de carga ao longo do tempo, também chamados de krafts, a fim de correlacionar o movimento de carga viva com os motores associados corados, conforme determinado pela coloração imunofluorescente. A etapa final é determinar as posições dos subpixels das proteínas de carga e motor usando um pacote de so

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Neuroscience

Neurociência

Shuttles molecular composta por microtúbulos funcionalizados deslizando na superfície, aderiram proteínas cinesina motor pode servir como um sistema de transporte em nanoescala. Aqui, a montagem de um sistema de transporte típico é descrito.

Embarque de carga para cinesina Produzido Shuttles Molecular

Aqui, um protocolo é apresentada para identificar cinesina-1 cargas. Um mutante motorless da cinesina-1 de cadeia pesada (KIF5B) agrega no citoplasma e induz a agregação de suas cargas. Ambos os agregados são detectados por microscopia de fluorescência. Uma estratégia semelhante pode ser empregue para identificar cargas de outras proteínas do motor.

Identificação de cinesina-1 Cargas Utilizando microscopia de fluorescência

O objetivo deste protocolo é formar conjuntos de motores moleculares em nanoestruturas de DNA origami e observar a motilidade do conjunto usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total.

Produção de conjuntos de motor de dynein e de Kinesin em nanostructures do ADN origami para a única observação da molécula

Transporte mitocondrial prejudicado e morfologia estão envolvidos em várias doenças neurodegenerativas. O protocolo apresentado usa neurônios cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas para avaliar o transporte mitocondrial e a morfologia em paraplegia espástica hereditária. Este protocolo permite a caracterização do tráfico mitocondrial ao longo de axônios e análise de sua morfologia, o que facilitará o estudo de doenças neurodegenerativas.

Analisando o Transporte Mitocondrial e a Morfologia em neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos em Paraplegia Espástica Hereditária

O transporte axonal é um mecanismo crucial para a saúde dos neurônios motores. Neste protocolo fornecemos um método detalhado para rastrear o transporte axonal de compartimentos ácidos e mitocôndrias em axônios de neurônios motores usando câmaras microfluidas.

Transporte Axonal de Organelas em Culturas de Neurônios Motores usando sistema de câmaras microfluidas

Descrevemos métodos de fotoativação de fluorescência para analisar o transporte axonal de neurofilamentos em axônios mieliados únicos de nervos periféricos de camundongos transgênicos que expressam uma proteína de neurofilamento fotoativavel.

Imagem e Análise do Transporte de Neurofilamento em Nervo Tibial de Camundongo Excised

A cinesinismo mitostática bi-direcional-5 Cin8 acumula-se em aglomerados que se dividem e se fundem durante sua motilidade. O acúmulo em clusters também altera a velocidade e a direcionalidade do Cin8. Aqui, é descrito um protocolo de ensaios de motilidade com Cin8-GFP purificado e análise de propriedades motile de moléculas únicas e aglomerados de Cin8.

Motilidade de Moléculas Únicas e Aglomerados de Kinesin-5 Cin8 Bidiso

Usando camundongos fluorescentes transgênicos, protocolos detalhados são descritos para avaliar o transporte in vivo axonal de endosários e mitocôndrias dentro de axônios motores e sensoriais do nervo ciático intacto em animais vivos.

Expansão do Kit de Ferramentas para Imagens In Vivo do Transporte Axonal

Este estudo detalha a purificação do KIF1A(1-393LZ), membro da família das cinesinas-3, utilizando o sistema de expressão do Sf9-baculovírus. A análise in vitro de deslizamento de molécula única e multimotor desses motores purificados exibiu propriedades de motilidade robustas comparáveis aos motores do lisado de células de mamíferos. Assim, o sistema Sf9-baculovírus é passível de expressar e purificar a proteína motora de interesse.

Análise de molécula única de motores da família Sf9 superprocessiva superprocessiva cinesina-3

O artigo descreve a otimização dos parâmetros de aquisição da microscopia de fluorescência para visualizar o transporte axonal de cargas marcadas endógenas com resolução de neurônio único em um nematóide vivo.

Otimizando a visualização do transporte axonal de carga endógena por microscopia de fluorescência em Caenorhabditis elegans vivos

Aprenda a caracterizar motores moleculares associados ao transporte axonal de cargas em neurônios de hipocampo de camundongo usando dispositivos microfluídicos e microscopia de imunofluorescência. Este método correlaciona a composição de proteínas motoras com a direcionalidade do movimento.

Caracterizar a composição de motores moleculares sobre Movimentação axonal Carga Utilizando Análise "Mapeamento Cargo"

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