Caracterizar a composição de motores moleculares sobre Movimentação axonal Carga Utilizando Análise "Mapeamento Cargo"

O objetivo geral do mapeamento de carga é determinar a quantidade relativa e o tipo de proteínas motoras moleculares que se associam e movem cargas vesiculares e correlacionar essa composição de motores com uma direcionalidade do movimento de carga viva. Isso é feito primeiro crescendo neurônios primários do hipocampo de camundongos em dispositivos microfluídicos, de modo que os axônios cresçam relativamente retos e registrando o movimento intracelular vivo de proteínas de carga marcadas com fluorescência nos axônios de neurônios transitoriamente transfectados. O segundo passo é fixar os neurônios durante o curso da imagem de carga viva e, posteriormente, corar os axônios com anticorpos contra proteínas motoras moleculares, como cinesina e dines, seguido de imagem de microscopia de imunofluorescência.

Em seguida, as imagens de carga fixa e motor são alinhadas aos gráficos de movimentação de carga ao longo do tempo, também chamados de krafts, a fim de correlacionar o movimento de carga viva com os motores associados corados, conforme determinado pela coloração imunofluorescente. A etapa final é determinar as posições dos subpixels das proteínas de carga e motor usando um pacote de software MATLAB desenvolvido sob medida chamado colocalização do motor. Este software fornece as coordenadas XY precisas de cada carga e posição do motor, bem como a quantidade relativa de intensidades de fluorescência associadas a cargas e motores.

Em última análise, a correlação da microscopia de fluorescência de cargas vivas e fixas e motores no nível de resolução de subpixel fornece informações sobre os tipos de motores associados a cargas específicas para as quais a direcionalidade do movimento é conhecida. Portanto, esse método fornece informações sobre o mecanismo de transporte de exons. Pode ser aplicado a outros estudos que correlacionam a microscopia de vida com a coloração imunofluorescente, como a Associação de Proteínas a microtubiais durante a dinâmica tubária de micrótamos ou o recrutamento de proteínas durante a endocitose.

A demonstração visual desse método ajudará a realizar as etapas de fixação e análise de imagens, que de outra forma poderiam ser difíceis de aprender, pois exigem uma configuração especializada. Os neurônios primários do hipocampo de camundongos para este procedimento são preparados conforme atribuído no texto do protocolo e ressuspensos no crescimento neurobasal do ovo. Meio para colocar os neurônios no dispositivo microfluídico.

Remova o meio do reservatório microfluídico um e um prime. Aplique 20 microlitros de células no reservatório microfluídico e deixe-as fluir. Coloque o dispositivo em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5%CO2 por 20 minutos.

Olhe ao microscópio para garantir que as células tenham aderido ao vidro coberto. Adicione neuro basal, um meio de crescimento para completar todos os reservatórios. Devolva o dispositivo com células para a incubadora no nono dia.

Em cultura, os neurônios estendem os axônios através dos microcanais e estão prontos para a transfecção para a expressão de proteínas fluorescentes. A imagem ao vivo dos neurônios primários do hipocampo de camundongo transfectado é realizada em um microscópio de luz de epifluorescência invertida, equipado com uma incubadora de 37 graus Celsius e uma câmara de controle de CO2. Para iniciar este procedimento, selecione a objetiva de óleo 100 x.

Aplique óleo na objetiva e monte a lamínula com os neurônios do hipocampo cultivados em um dispositivo microfluídico no microscópio. Para evitar a morte neuronal, trabalhe rapidamente para manter as amostras no microscópio por não mais de uma hora. Encontre axônios de células transfectadas que se estendem pelos canais da câmara microfluídica.

Registre o número de canais nos quais o axônio transfectado foi encontrado. Conte o número de canais usando um contador de contagem manual para gravação ideal do movimento ao vivo e subsequente análise de colocalização. Escolha axônios que cresçam relativamente planos através dos canais para que a imagem da maioria das vesículas possa ser realizada em foco.

Para facilitar o alinhamento subsequente de imagens fixas com trajetórias de movimento no enxerto de chm. Alinhe a borda direita dos microcanais com o campo de visão durante a imagem. Para fixar com sucesso as células durante a imagem ao vivo, o procedimento é melhor realizado com duas pessoas, uma pessoa para adicionar o fixador e outra pessoa para ajustar o foco.

Também é importante ter todos os reagentes prontos e ao seu alcance. Usando uma pipeta de transferência de plástico de um mililitro. Remova a maior parte do meio dos reservatórios dois e dois Prime Start com imagens de movimento de carga ao vivo com especificações de lapso de tempo específicas para a dinâmica de transporte da carga que está sendo analisada.

Depois que dados suficientes de movimento ao vivo forem coletados, peça a uma pessoa que encha os reservatórios dois e dois com fixador de pré-aquecimento. Evite tocar no dispositivo microfluídico, pois isso interromperá o foco da imagem ao vivo. Peça à outra pessoa que ajuste o foco enquanto o fixador é adicionado.

Da mesma forma, encher os reservatórios um e um prime com a fixação fixadora é bem-sucedido quando a cessação imediata do movimento é observada. Posteriormente, os neurônios fixados são corados com anticorpos contra proteínas motoras endógenas e fotografados conforme descrito no texto do protocolo. Para iniciar o mapeamento da carga, gere um cromógrafo da movimentação da carga usando um software de análise de imagens.

O plug-in Image J desenvolvido pela Rich Dorf Insights é recomendado para gerar Kraft usando software gráfico disponível comercialmente, alinhar manualmente a imagem de imunofluorescência da carga ao gráfico CHM de movimentação de carga, sobrepondo os pontos de carga à posição das trajetórias no gráfico chm no ponto de fixação, de modo que cada ponto de carga corresponda a uma trajetória específica no gráfico CHM. Para obter melhores resultados de alinhamento, use a fatia Z que está em melhor foco para a carga mapeada. Várias fatias Z podem ser usadas para cada imagem na pilha Z.

Determine as coordenadas XY e as amplitudes de intensidade para cada ponto fluorescente usando um algoritmo estabelecido para ajustar gaussianos 2D à função de propagação de pontos que representa as fontes pontuais em cada um dos três canais. Para obter as coordenadas XY, foi desenvolvido um pacote de software MATLAB personalizado chamado colocalização do motor, que incorpora um algoritmo de ajuste gaussiano desenvolvido por Yakima DONA e colegas para cada um dos pontos de carga individuais que foram mapeados nas trajetórias móveis ou estacionárias. No gráfico Kog, selecione as coordenadas XY e as amplitudes de intensidade dos resultados do programa de colocalização motora.

Use várias imagens Zack para mapear mais cargas encontradas em diferentes planos focais. Compare as coordenadas XY individuais para a carga mapeada com as obtidas para cada um dos canais do motor na fatia Z correspondente. Determine e selecione as coordenadas do motor XY que estão dentro de um raio de 300 nanômetros da carga para cargas e motores que sinalizaram dentro do mesmo plano focal.

Use o pacote de software de colocalização do motor para determinar os pontos localizados dentro do raio de 300 nanômetros. O mapeamento de carga foi usado para correlacionar o transporte de vesículas carregando proteína príon normal marcada com proteína fluorescente amarela ou Y-F-P-P-R-P-C com quantidades relativas de cinesina e motores dine nos axônios. Este gráfico mostra o movimento da vesícula F-P-P-R-P-C e a linha pontilhada indica o tempo de fixação durante a imagem ao vivo.

As imagens de fluorescência das vesículas fixas Y-F-P-P-P-R-P-C, bem como as imagens de imunofluorescência correspondentes da cadeia leve de cinesina um e din, estão alinhadas ao cromógrafo. Essa ampliação mostra sinais imunofluorescentes de cada um dos três canais com atribuições de função 2D gian. Este gráfico representa a quantificação da COLOCALIZAÇÃO entre vesículas Y-F-P-P-R-P-C, cadeia leve de cinesina um e dine em neurônios selvagens e em neurônios sem cadeia pesada de CINESIN.

A quantidade relativa de cadeia leve de cinesina um e dine associada às vesículas Y-F-P-P-P-R-P-C é obtida a partir das amplitudes gaussianas e plotada para examinar possíveis correlações entre quantidades motoras relativas e direcionalidade do movimento. Este exemplo de neurônios do tipo selvagem indica que as vesículas YFP, que estão em movimento ou estacionárias, associam-se a uma cadeia leve de KINESIN ou a um ou a ambos Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três dias. Além de aproximadamente 10 dias de preparação de imagens pré-EM dos dispositivos microfílicos e do neurônio primário, em três dias, você poderá realizar imagens de imagem ao vivo de coloração imunofluorescente e análise de dados.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como registrar o movimento ao vivo de cargas e neurônios marcados com fluorescência que foram cultivados em dispositivos microfluídicos. Como corrigir células C durante a imagem, como analisar a colocalização como resolução de subpixel e como correlacionar a colocalização de cargas e proteínas motoras moleculares com o movimento da carga.