Uso de MALDI-TOF Espectrometria de Massa e um banco de dados personalizado para caracterizar bactérias indígenas para uma caverna ambiente único (Kartchner Caverns, AZ, EUA)

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver, aplicar e demonstrar um procedimento detalhado para identificação bacteriana baseada em biblioteca usando MALDI para espectrometria de massa. Isso é feito adquirindo primeiro espectros de massa de bactérias usando um espectrômetro de massa maloff. Neste estudo, espectros de massa de 15 bactérias isoladas de um ambiente cáustico são coletados na forma de picos resultantes, padrões característicos ou impressões digitais das bactérias analisadas.

Esses espectros de massa são então importados para o software e um banco de dados de modelo é construído. Em seguida, os espectros de massa de referência no banco de dados do modelo são processados e analisados usando análise de cluster, correspondência de pico e análise estatística. Finalmente, espectros de massa de bactérias codificadas cegamente, que são selecionadas aleatoriamente dessas 15 bactérias, são coletados novamente e comparados com os espectros de referência no banco de dados do modelo para resultados de identificação mostram que as bactérias podem ser identificadas corretamente com base em coeficientes de similaridade ou potenciais biomarcadores e classes de pico.

Comece este procedimento com a deposição de um microlitro de extrato de proteína sem células viáveis em uma placa alvo de maldi de aço inoxidável e deixe secar. Em seguida, cubra o extrato de proteína seca com um microlitro de solução de matriz e deixe secar. Em seguida, deposite um microlitro de padrão CBR na placa alvo após a secagem, cubra o CBR com um microlitro de solução de matriz e deixe secar.

Finalmente, deposite dois microlitros de solução de matriz na placa alvo como controle negativo. Use o multi para espectrômetro de massa equipado com o laser de nitrogênio e operado usando o software de controle flexível Bruker. Colete cada espectro de massa no modo linear positivo por acúmulo de 500 disparos de laser em incrementos de 100 disparos.

Defina a fonte de íons uma tensão para 20, quilovolts a fonte de íons, duas tensões para 18.15 quilovolts e a tensão da lente para 9.05 quilovolts. Esses parâmetros são específicos do instrumento e podem exigir otimização. Defina a faixa de massa para carga para avaliação automatizada do espectro de dois a 20 quilodaltons por carga.

Em seguida, defina o limite mínimo de resolução em 100. Selecione o algoritmo de detecção de pico OID. Defina o limiar da relação sinal-ruído em dois e o limiar mínimo de intensidade em 100.

Por fim, defina o acúmulo de pico como 500 para o design do banco de dados. Crie um novo banco de dados no bionumérico 7.1 usando o novo assistente de banco de dados. Em seguida, crie um tipo de experimento de espectro, como maldi, usando comandos no painel de tipos de experimento.

Em seguida, crie os níveis usando o painel de design do banco de dados, navegue até o menu do banco de dados e adicione novos níveis usando o comando level add new level aqui. Crie nível de espécie, nível de replicação biológica e nível técnico. Para importar os espectros de massa brutos.

Primeiro, exporte os espectros de massa brutos como arquivos de texto usando a análise flex navegando no menu de arquivo e clicando no comando exportar espectro de massa. Em seguida, importe os espectros de massa brutos para o banco de dados no nível das réplicas técnicas. Pré-processe os espectros de massa brutos importando e reamostrando usando um algoritmo de ajuste quadrático.

Em seguida, execute uma subtração de linha de base usando um disco rolante com um tamanho de 50 pontos, calcule o ruído usando a transformação wavelet contínua ou CWT. Suavize os espectros usando uma janela Kaiser com um tamanho de janela de 20 pontos e um beta de 10 pontos. Em seguida, execute uma segunda subtração de linha de base usando um disco rolante com um tamanho de 200 pontos.

Finalmente, detecte os picos usando o CWT com uma relação sinal-ruído mínima de 10 após o pré-processamento de padrões característicos seguros de cada espectro de massa, como listas de picos, contendo tamanhos de pico, intensidades de pico e relação sinal-ruído. Em seguida, crie espectros de massa compostos a partir de espectros pré-processados usando o comando resumido no menu de análise. Escolha a replicação biológica como o nível de destino. Aqui.

Combine espectros de massa de 10 réplicas técnicas da mesma colônia para produzir um espectro de massa composto para essa colônia, resultando em três espectros de massa compostos para esse isolado no nível de replicação biológica. Finalmente, resuma os três espectros compostos para criar um espectro composto para esse isolado no nível da espécie. Para executar a análise de cluster baseada em similaridade e o dimensionamento multidimensional, crie grupos com cores.

Primeiro, selecione os três espectros de massa compostos biológicos e clique no comando criar novo grupo a partir da seleção no menu do grupo para criar um grupo para o isolado correspondente. Em seguida, projete uma cor usada automaticamente para esses três espectros de massa. Execute a análise de cluster navegando no menu de clustering e clicando no comando calculate cluster analysis.

Nas configurações de comparação, página um, selecione a correlação de Pearson e deixe outros parâmetros como padrão. Na página dois, selecione o método de grupo de pares não ponderados com média aritmética. Em seguida, clique em concluir.

Obtenha um gráfico de dimensionamento multidimensional usando o comando de dimensionamento multidimensional no menu de estatísticas para executar a correspondência de pico. Clique no tipo de espectro maldi no painel de experimentos. Em seguida, selecione o layout.

Mostrar imagem, picos individuais de espectros são mostrados. Em seguida, execute a correspondência de pico usando o comando do peak matching no menu de espectros para identificar classes de pico, execute o agrupamento bidirecional clicando na matriz de estatísticas. Mineração. A intensidade dos picos combinados com as classes de pico é representada como um mapa de calor para identificar bactérias usando o método baseado no coeficiente de similaridade, criar uma comparação e gerar um rogram baseado em espectros de massa no nível de replicação técnica, conforme realizado para análise de cluster, salvar o rogram para comparação de similaridade.

Selecione um espectro de massa desconhecido e clique na análise. Identifique as entradas selecionadas. A caixa de diálogo de identificação é exibida.

Selecione o tipo de classificador baseado em comparação e clique em Avançar. Na próxima página, escolha o grama salvo como uma comparação de referência e clique em Avançar. Escolha a semelhança básica como método de identificação e, novamente, clique em Avançar, escolha a semelhança máxima como método de pontuação.

Digite os valores de limite apropriados e os valores mínimos de diferença para cada parâmetro e clique em Avançar. Depois que os cálculos forem concluídos, a janela de identificação aparecerá no painel de resultados. Os membros do banco de dados que melhor correspondem ao desconhecido são listados.

Um rogram baseado na análise de agrupamento mostra uma semelhança entre cada isolado no banco de dados. O conjunto de dados contém espectros de 15 espécies diferentes com três espectros compostos para cada espécie. A análise de cluster bidirecional pode ajudar os pesquisadores a identificar potenciais biomarcadores para uma espécie ou cepas dentro de uma espécie.

Aqui, a intensidade de pico é representada por cores, verde significando baixa intensidade e vermelho significando alta intensidade. Finalmente, com base nessas análises, o espectro de massa de uma incógnita pode ser comparado ao grama e uma identificação baseada em coeficiente de similaridade é alcançada.