Name: Uso de MALDI-TOF Espectrometria de Massa e um banco de dados personalizado para caracterizar bactérias indígenas para uma caverna ambiente único (Kartchner Caverns, AZ, EUA) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Aprenda a identificar bactérias usando MALDI-TOF MS e banco de dados personalizado. Este método permite caracterizar microrganismos de ambientes únicos como cavernas com alta precisão e rapidez.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pela New College of Interdisciplinary Arts and Sciences da Arizona State University, Applied Maths NV, e pela National Science Foundation (ROA Supplement to Award No. MCB0604300). Quaisquer opiniões, descobertas e conclusões ou recomendações expressas neste material são de responsabilidade do(s) autor(es) e não refletem necessariamente as opiniões da National Science Foundation.

Cuidado: bactérias não identificados a partir de qualquer ambiente pode ser patogênica e devem ser manuseados com cuidado, utilizando protocolos de biossegurança adequadas. Trabalhar com culturas vivas deve ser realizada em uma cabine de segurança biológica Classe II utilizando Biológica nível de segurança 2 (BSL-2) procedimentos. Mais informações sobre BSL-2 procedimentos está disponível no manual do CDC / NIH intitulado, &quot;Biossegurança em microbiológicos e Biomédicas Laboratories&quot;, páginas 33-38. O documento está disponível online em <a href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf</a> . Equipamento adequado de proteção individual (EPI), incluindo jalecos / vestidos, óculos de segurança e de borracha nitrílica ou luvas de látex, deve ser usado. Práticas microbiológicos padrão e precauções devem ser seguidas, e os resíduos de risco biológico deve ser descartado de forma adequada. As bactérias usadas nesta demonstração foram isolados a partir de Kartchner,AZ, EUA, a partir de quatro ambientes, incluindo speleothem seco, pedra fluxo, espeleotemas úmido e gotejamento estalactite (Tabela 1). Todos os isolados foram identificados por sequenciação de 16S rDNA e mantidos a -80 ° C em glicerol a 25% 2-B R médio. Todas as experiências foram concluídas à TA. Nota: Recomenda-se utilizar o mesmo método de preparação da amostra para adquirir espectros de massa para a construção do banco de dados e de massa de incógnitas. Método de preparação da amostra foi mostrado anteriormente para afetar a qualidade de espectro e reprodutibilidade 3. Usando um método diferente preparação da amostra pode causar a identificação incorrecta de desconhecidos, especialmente quando maior resolução taxonómica (por exemplo, no nível de tensão) é desejado. 1. Deposição sobre o alvo de MALDI Cuidado: Vários protocolos para obter extractos de proteínas requerem a utilização de ácidos e solventes orgânicos, que deve ser utilizado de acordo com guidElines e informações contidas em suas respectivas Fichas de Dados de Segurança de Materiais (FDSP). Apropriada PPE deve ser usado e vai variar de acordo com tipo e volume de produtos químicos usados ​​(por exemplo, jalecos / batas, luvas, óculos de segurança e de proteção respiratória devem ser utilizados ao trabalhar com quantidades significativas de solventes inflamáveis, tóxicos, tais como acetonitrilo, e ácidos corrosivos, tais como os ácidos fórmico e trifluoroacético). <ol><li> Depósito 1 ml extrato de proteína não contendo células viáveis ​​(obtidos utilizando adequadas, protocolos anteriormente descritos 11-13) sobre uma chapa de aço inoxidável alvo MALDI e deixe-a secar. Overlay o extrato de proteína seca com solução de matriz 1 ml (solução de ácido α-4-hidroxi-cinâmico-ciano), e deixe-a secar. </li><li> Para cada repetição biológica, manchar um número apropriado de repetições técnicas (5 a 20 repetições técnicas). Aqui, spot 10 repetições técnicos para cada repetição biológica e 3 repetições biológicas were preparado. Nota: Recomendamos a utilização de uma placa de MALDI-alvo de aço polido ao usar o método de preparação de amostras extração de proteínas. Usando placas de aço alvo solo pode causar difusão e de mistura não intencional das diferentes amostras fora dos poços individuais da amostra. </li><li> Depósito 1 ml de calibração padrão para a placa-alvo e deixe-a secar. Overlay com solução matriz 1 ul e deixe-a secar. </li><li> Depósito de solução de matriz 2 uL para a placa de destino como um controlo negativo. </li></ol> 2. Espectros de Massa Aquisição <ol><li> Use um espectrômetro de massa MALDI-TOF equipado com um laser de nitrogênio (λ = 337 nm) e operado usando software Bruker FlexControl. </li><li> Recolha cada espectro de massa no modo linear positiva pelo acúmulo de 500 disparos de laser em incrementos de 100 tiro. Defina a fonte de íons 1 tensão de 20 kV; fonte iónica de 2 a tensão de 18,15 kV; e a tensão de lente e 9,05 kV. Note-se que estes parâmetros são instrumento-especific e pode necessitar de reajuste em outros instrumentos para obter os melhores resultados. </li><li> Defina o intervalo de massa-carga para avaliação automática espectro de 2 a 20 kDa por carga. Use o algoritmo de detecção de pico centroid. Defina o limite mínimo de resolução a 100 Da. Defina a relação sinal-ruído (S: N) limiar a 2. Defina o limite mínimo de intensidade em 100. </li></ol> 3. Construção de banco de dados <ol><li> Design de banco de dados <ol><li> Criar um novo banco de dados no BioNumerics 7.1 usando o &quot;assistente de banco de dados New&quot;. </li><li> Criar um tipo de experimento de espectro, por exemplo, Maldi, usando os comandos no painel &quot;Tipos Experiment&quot;. </li><li> Crie os níveis usando o &quot;painel de banco de dados de design&quot;. Adicionar novos níveis usando o &quot;Nível&gt; Adicionar novo nível ...&quot; comando no menu &quot;Banco de Dados&quot;. Aqui, criar &quot;Espécies&quot; nível, nível de &quot;replicar Biológica&quot; &quot;e&quot; repetição técnica &quot;nível, respectivEly. </li></ol></li><li> Importação e pré-processamento de espectros de massa crua <ol><li> Exportar o espectro de massa crua como arquivos .txt usando FlexAnalysis clicando no comando &quot;Export&gt; Espectro de massa&quot; no menu &quot;File&quot;. </li><li> Importar o espectro de massa crua (.txt) no banco de dados no nível das repetições técnicas. </li><li> Preprocess os espectros de massa crua. <ol><li> Importação e resample (usando um algoritmo de ajuste quadrático). </li><li> Realizar uma subtracção da linha de base (com um disco do rolamento com um tamanho de 50 pontos). </li><li> Calcule o ruído [Transformation Wavelet Contínua (CWT)], liso (Janela Kaiser com um tamanho de janela de 20 pontos e beta de 10 pontos), e realizar uma segunda subtração de base (disco rolando com tamanho de 200 pontos). </li><li> Detectar picos [CWT com um sinal mínimo de ruído (S: N) de 10]. </li></ol></li><li> Depois de pré-processamento, salvar padrões característicos de cada espectro de massa, tais como listas de pico contendo picotamanhos, as intensidades dos picos, S: N, etc, no banco de dados. </li></ol></li><li> Criação de espectro de massa compósito <ol><li> Criar espectros composta a partir de espectros pré-processados ​​usando o comando &quot;Resumir ...&quot; no menu &quot;Análise&quot;. Escolha a opção &quot;replicar Biológica&quot;, como nível de alvo. </li><li> Aqui, combinar os espectros de massa de 10 repetições técnicos da mesma colónia, para se obter um espectro de massa compósito para que colónia, resultando em três espectros de massa compósito para esse isolado no nível &quot;réplica biológica&quot;. </li><li> Aqui, resumir os três espectros combinados para criar um espectro composto para que o isolado no nível &quot;Espécies&quot;. Nota: O espectro de compósito é a média de ponto-a-ponto das repetições técnicas. Replica com uma similaridade (correlação de Pearson) com a média de 95% menor do que (configuração padrão) são excluídos do compósito. Os picos nos espectros compósito só são chamados, se estiverem presentes em 75% (configuração padrão) das repetições incluídos. Para as réplicas biológicas, estas definições foram de 90 e 60%, respectivamente. </li></ol></li></ol> 4. Massa de Análise de Dados do Espectro <ol><li> Selecione as entradas no banco de dados e criar uma comparação clicando no comando &quot;Criar nova comparação&quot; no painel &quot;As comparações&quot;. </li><li> Aqui, use o espectro de massa na &quot;repetição técnica&quot; e / ou níveis de &quot;reproduzir Biológica&quot; para mostrar comparações e análises. </li><li> Análise de cluster baseada em similaridade e de escala multi-dimensional (MDS) <ol><li> Crie grupos com cores. Selecione o espectro de massa compósito biológica três e clique no botão &quot;Criar novo grupo da seleção&quot; comando no menu &quot;Grupos&quot; para criar um grupo para o isolado correspondente. Designar uma cor automaticamente utilizado para estes três espectros de massa. </li><li> Como alternativa, definir estados de campo com as cores correspondentes, utilizando os comandos no &quot;Base de dados entradas &quot;painel de tal modo que qualquer agrupamento com base neste campo definido usa a mesma cor definida para este grupo. </li><li> Realizar análise de cluster. Clique no comando &quot;Calcular análise de cluster&quot; no menu &quot;Clustering&quot;. No configurações Comparação Page 1, selecione a opção &quot;correlação de Pearson&quot; e deixar outros parâmetros como padrão. Na página 2, selecione &quot;UPGMA&quot;. Em seguida, clique em &quot;Finish&quot;. </li><li> Obter um enredo MDS usando o &quot;dimensionamento Multi-dimensional ...&quot; comando no menu &quot;Estatísticas&quot;. </li></ol></li><li> Coincidindo Peak <ol><li> Clique no tipo de espectro &quot;Maldi&quot; no painel &quot;Experiências&quot;. Em seguida, selecione &quot;Layout&gt; Mostrar imagem&quot;. Os espectros são apresentados como bandas de gel. </li><li> Executar a correspondência de pico usando o comando &quot;Faça a correspondência de pico&quot; no menu &quot;Spectra&quot;. </li></ol></li><li> Identificação de classes de pico <ol><li> Realizar análise de componentes principais (PCA). Realce o &quot;Maldi &quot;tipo de experimento no&quot; Experimental &quot;painel e use a&quot; Análise de Componentes Principais ... &quot;comando no menu&quot; Estatística &quot;para realizar PCA. </li><li> Execute bidirecional clustering. Clique no botão &quot;Estatísticas&gt; mineração Matrix&quot; ... na janela &quot;Comparação&quot;. A intensidade dos picos correspondentes às classes de pico é representado usando cores diferentes (mapa de calor). </li></ol></li></ol> 5. As bactérias Identificação com um banco de dados personalizada <ol><li> Método baseado em coeficiente de similaridade <ol><li> Criar uma comparação e gerar um dendrograma baseado no espectro de massa no nível &quot;replicar técnicos&quot;, como descrito no passo 4.3.3. Salve o dendrograma para comparação da similaridade. </li><li> Selecione um espectro de massa desconhecida, e clique no botão &quot;Análise&gt; Identificar as entradas selecionadas&quot;. A caixa de diálogo identificação aparece. </li><li> Selecione a opção &quot;Comparação baseada&quot; tipo de classificador (ou um classif armazenadoier) e clique em &quot;next&quot;. Na página seguinte, escolha o dendrograma salvo como uma comparação de referência e, em seguida, clique em &quot;next&quot;. </li><li> Escolha a opção &quot;semelhança Basic&quot; como um método de identificação e clique em &quot;next&quot;. </li><li> Escolha a opção &quot;semelhança máxima&quot; como método de pontuação. Escreva em valores limiares adequados e os valores mínimos de diferença para cada parâmetro e clique em &quot;next&quot;. </li><li> Uma vez que os cálculos são concluídas, aparece a janela de identificação. No &quot;Resultados&quot; do painel, os membros do banco de dados que melhor combinam com o desconhecido são listados. </li><li> Salve o projeto de identificação e validar a identificação usando o comando &quot;de validação cruzada análise&quot; no painel &quot;projeto de Identificação&quot;. </li></ol></li><li> Método baseado biomarcador potencial <ol><li> Definir classes de pico. Na janela &quot;Matrix Mining&quot;, selecionar os conjuntos de picos com características comuns e definir esses picos como especiaulas fic de pico (de potenciais biomarcadores) usando &quot;Spectra&gt; Gerenciar tipos de classe de pico ...&quot; na &quot;janela de comparação&quot;. </li><li> Aqui, definir classes específicas de pico de cada isolado para todos os 15 isolados. </li><li> Escolher os espectros de massa de desconhecidos e combinar os picos destes espectros para as classes de pico definidos como descrito anteriormente. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+TOF+MS+profiling+of+bacteria+at+the+strain+level%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review.</a> Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).</li>
<li>Siegrist, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+and+characterization+of+environmental+strains+of+Escherichia+coli+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry+%28MALDI-TOF-MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Meth%22%5BJournal%5D)">Discrimination and characterization of environmental strains of Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS).</a> J Microbiol Meth. 68 (3), 554-562 (2007).</li>
<li>Goldstein, J. E., Zhang, L., Borror, C. M., Rago, J. V., Sandrin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+conditions+and+sample+preparation+methods+affect+spectrum+quality+and+reproducibility+during+profiling+of+Staphylococcus+aureus+with+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Culture conditions and sample preparation methods affect spectrum quality and reproducibility during profiling of Staphylococcus aureus with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Lett Appl Microbiol. 57 (2), 144-150 (2013).</li>
<li>Benagli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+MALDI-TOF+MS+identification+database+at+genospecies+level+for+clinical+and+environmental+Aeromonas+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A rapid MALDI-TOF MS identification database at genospecies level for clinical and environmental Aeromonas strains.</a> Plos One. 7 (10), (2012).</li>
<li>Sauer, S., Kliem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+tools+for+the+classification+and+identification+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (1), 74-82 (2010).</li>
<li>Bohme, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpectraBank%3A+An+open+access+tool+for+rapid+microbial+identification+by+MALDI-TOF+MS+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">SpectraBank: An open access tool for rapid microbial identification by MALDI-TOF MS fingerprinting.</a> Electrophoresis. 33 (14), 2138-2142 (2012).</li>
<li>Walker, J., Fox, A. J., Edwards-Jones, V., Gordon, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+cell+mass+spectrometry+%28ICMS%29+used+to+type+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%3A+media+effects+and+inter-laboratory+reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Meth%22%5BJournal%5D)">Intact cell mass spectrometry (ICMS) used to type methicillin-resistant Staphylococcus aureus: media effects and inter-laboratory reproducibility.</a> J Microbiol Meth. 48 (2-3), 117-126 (2002).</li>
<li>Ruelle, V., El Moualij, B., Zorzi, W., Ledent, P., De Pauw, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+environmental+bacterial+strains+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of environmental bacterial strains by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Sp. 18 (18), 2013-2019 (2004).</li>
<li>Sedo, O., Sedlacek, I., Zdrahal, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+Preparation+Methods+for+Maldi-MS+Profiling+of+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Sample Preparation Methods for Maldi-MS Profiling of Bacteria.</a> Mass Spectrom Rev. 30 (3), 417-434 (2011).</li>
<li>Swatkoski, S., Russell, S., Edwards, N., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+a+model+virus+using+residue-specific+chemical+cleavage+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of a model virus using residue-specific chemical cleavage and MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Anal Chem. 79 (2), 654-658 (2007).</li>
<li>Freiwald, A., Sauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+classification+and+identification+of+bacteria+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 4 (5), 732-742 (2009).</li>
<li>Drevinek, M., Dresler, J., Klimentova, J., Pisa, L., Hubalek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+sample+preparation+methods+for+MALDI-TOF+MS+identification+of+highly+dangerous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of sample preparation methods for MALDI-TOF MS identification of highly dangerous bacteria.</a> Lett Appl Microbiol. 55 (1), 40-46 (2012).</li>
<li>Lasch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+mass+spectrometry+compatible+inactivation+method+for+highly+pathogenic+microbial+cells+and+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF mass spectrometry compatible inactivation method for highly pathogenic microbial cells and spores.</a> Anal Chem. 80 (6), 2026-2034 (2008).</li>
<li>Usbeck, J. C., Kern, C. C., Vogel, R. F., Behr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+experimental+and+modelling+parameters+for+the+differentiation+of+beverage+spoiling+yeasts+by+Matrix-Assisted-Laser-Desorption%2FIonization+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry+%28MALDI-TOF+MS%29+in+response+to+varying+growth+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimization of experimental and modelling parameters for the differentiation of beverage spoiling yeasts by Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) in response to varying growth conditions.</a> Food Microbiol. 36 (2), 379-387 (2013).</li>
<li>Del Chierico, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+MS+proteomic+phenotyping+of+filamentous+and+other+fungi+from+clinical+origin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF MS proteomic phenotyping of filamentous and other fungi from clinical origin.</a> J Proteomics. 75 (11), 3314-3330 (2012).</li>
<li>Vitale, R., Roine, E., Bamford, D. H., Corcelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+fingerprints+of+intact+viruses+by+MALDI-TOF%2Fmass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Bba-Mol+Cell+Biol+L%22%5BJournal%5D)">Lipid fingerprints of intact viruses by MALDI-TOF/mass spectrometry.</a> Bba-Mol Cell Biol L. 1831 (4), 872-879 (2013).</li>
<li>Zhang, L., Borror, C. M., Sandrin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+designed+experiments+approach+to+optimization+of+automated+data+acquisition+during+characterization+of+bacteria+with+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A designed experiments approach to optimization of automated data acquisition during characterization of bacteria with MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Plos One. 9 (3), (2014).</li>
<li>Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+bacteria+from+positive+blood+culture+bottles+by+use+of+matrix-assisted+laser+desorption-ionization+time+of+flight+mass+spectrometry+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22J+ClinMicrobiol%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting.</a> J ClinMicrobiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).</li>
</ol>

Os autores Vranckx e Janssens são funcionários da Applied Maths NV, fabricante do software de análise de dados usado neste vídeo. A Applied Maths NV forneceu módulos de software selecionados destacados neste vídeo, bem como uma parte dos custos de publicação associados a este vídeo.

Esta demonstração mostrou procedimentos detalhados de caracterização e identificação de bactérias que utilizam MALDI-TOF MS e um banco de dados personalizado. Em comparação com os métodos tradicionais moleculares, por exemplo, métodos de impressão digital de 16S rDNA, baseados em MS MALDI-TOF facilitar a identificação mais rápida de diversas bactérias. Devido à sua robustez, esta técnica é muito utilizada para caracterizar bactérias, vírus, fungos e leveduras do ambiente e em ambientes clínicos 1,14-16. Além ...

A espectrometria de massa (MS) de tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF) demonstrou ser uma ferramenta rápida e confiável para a identificação de bactérias no gênero, espécie e, em alguns casos, níveis de cepa1-4. MALDI-TOF MS ioniza moléculas biológicas (tipicamente proteínas) que se originam de superfícies celulares, membranas intracelulares e ribossomos de células bacterianas inteiras ou extratos de proteínas1,5. Os picos resultantes formam padrões característicos ou "impressões digitais" das bactérias analisadas1. A identificação de bactérias é baseada nessas "impressões digitais" de massa para carga. 
Duas das estratégias de identificação mais comumente usadas são estratégias baseadas em bibliotecas e bioinformática1. As abordagens baseadas em bibliotecas envolvem a comparação dos espectros de massa de desconhecidos com espectros de massa coletados anteriormente de bactérias conhecidas em bancos de dados / bibliotecas para identificação. Softwares disponíveis comercialmente, como os pacotes de software BioNumerics, Biotyper e SARAMIS, bem como ferramentas de software de código aberto, como o SpectraBank6, estão disponíveis para facilitar a comparação e quantificação da semelhança entre espectros de massa de bactérias desconhecidas e de referência. As abordagens baseadas em bioinformática geralmente dependem de genomas de bactérias totalmente sequenciados para identificação. Em contraste com as abordagens baseadas em bibliotecas que não envolvem a identificação da natureza biológica de picos específicos, as abordagens baseadas em bioinformática envolvem a identificação de proteínas1. 
A maioria dos estudos recentes baseados em impressões digitais MALDI usou abordagens baseadas em bibliotecas para identificar bactérias1. Abordagens baseadas em bibliotecas requerem a construção de bancos de dados e a comparação da semelhança entre os espectros de massa. Estudos mostram que muitos procedimentos experimentais, como meio3,7, tempo de cultivo8, método de preparo de amostras3 e matriz utilizada9, afetam os espectros de massa obtidos. Além disso, algumas espécies e cepas intimamente relacionadas geram espectros com apenas diferenças sutis. Assim, as abordagens baseadas em bibliotecas requerem procedimentos rigorosamente padronizados para gerar espectros de massa altamente reprodutíveis entre as réplicas. Pequenas variações nos protocolos podem comprometer a eficácia da identificação, especialmente nos níveis de subespécies e cepas1,3,10. No entanto, nem os bancos de dados de referência fornecidos pelo fabricante nem os bancos de dados personalizados relatados incluem procedimentos visualmente documentados para a construção do banco de dados e/ou aplicação de um pipeline de análise de dados. Por esse motivo, o objetivo deste trabalho foi desenvolver, aplicar e demonstrar um procedimento abrangente e detalhado para identificação bacteriana baseada em biblioteca usando MALDI-TOF MS. 
Nesta demonstração, espectros de massa de 15 bactérias isoladas de um ambiente cárstico (Kartchner Cavern, AZ, EUA) foram coletados e importados para o software para construir um banco de dados modelo. O processamento dos dados e o pipeline de análise foram detalhados usando o banco de dados do modelo. Finalmente, espectros de massa de bactérias codificadas cegamente que foram selecionadas aleatoriamente dessas 15 bactérias foram coletados novamente e comparados com os espectros de referência no banco de dados do modelo para identificação. Os resultados mostram que as bactérias podem ser identificadas corretamente com base em coeficientes de similaridade ou potenciais biomarcadores/classes de pico.

<table><tbody><tr><td>&alfa;-ciano-4-hidroxi-cinâmico ácido</td><td>ACROS Organics</td><td>163440050</td><td>&ge; 97%, CAS 28168-41-8</td></tr><tr><td>Software Bruker FlexControl</td><td>Versão 3.0</td><td>Bruker</td><td></td></tr><tr><td>Software FlexAnalysis Versão</td> 3.0 Software <td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>Versão 3.0</td></tr><tr><td>Software Bionumerics</td><td>Matemática Aplicada</td><td></td><td>versão 7.1</td></tr></tbody></table>

uso de maldi-tof espectrometria de massa e um banco de dados personalizado para caracterizar bactérias indígenas para uma caverna ambiente único (kartchner caverns, az, eua)

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment (Kartchner Caverns, AZ, USA)

A espectrometria de massa MALDI-TOF demonstrou ser uma ferramenta rápida e confiável para a identificação de bactérias no gênero e na espécie e, em alguns casos, nos níveis de cepa. Ferramentas de software disponíveis comercialmente e de código aberto foram desenvolvidas para facilitar a identificação; no entanto, nenhum pipeline de análise de dados universal/padronizado foi descrito na literatura. Aqui, fornecemos uma demonstração abrangente e detalhada dos procedimentos de identificação bacteriana usando um espectrômetro de massa MALDI-TOF. Espectros de massa foram coletados de 15 bactérias diversas isoladas de Kartchner Caverns, AZ, EUA, e identificados por sequenciamento de rDNA 16S. Os bancos de dados foram construídos no BioNumerics 7.1. Análises de acompanhamento dos espectros de massa foram realizadas, incluindo análises de agrupamento, correspondência de pico e análises estatísticas. A identificação foi realizada usando amostras codificadas cegamente selecionadas aleatoriamente dessas 15 bactérias. Dois métodos de identificação são apresentados: métodos baseados em coeficiente de similaridade e baseados em biomarcadores. Os resultados mostram que ambos os métodos de identificação podem identificar as bactérias em nível de espécie.

As bases de dados construídos desta manifestação teve quatro níveis, maior para o menor nível, incluindo "todos os níveis", "Espécies", "repetição Biológica" e "repetição técnica", respectivamente (Figura 1A). O nível "técnico replicar" continha todos os espectros pré-processado de repetições técnicas. A "repetição Biológica" e os níveis de "espécies" continha o (resumo) espectros composto. "Todos os níveis" continha todos os espectros de repetição técnica, bem como todos os espectros de composto. <...

Este trabalho detalha procedimentos para identificação rápida de bactérias usando MALDI-TOF MS. Os procedimentos de identificação incluem aquisição de espectro, construção de banco de dados e análises de acompanhamento. Dois métodos de identificação, baseados em coeficiente de similaridade e métodos baseados em biomarcadores, são apresentados.

Uso de MALDI-TOF Espectrometria de Massa e um banco de dados personalizado para caracterizar bactérias indígenas para uma caverna ambiente único (Kartchner Caverns, AZ, EUA)

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, ...

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver, aplicar e demonstrar um procedimento detalhado para identificação bacteriana baseada em biblioteca usando MALDI para espectrometria de massa. Isso é feito adquirindo primeiro espectros de massa de bactérias usando um espectrômetro de massa maloff. Neste estudo, espectros de massa de 15 bactérias isoladas de um ambiente cáustico são coletados na forma de picos resultantes, padrões característicos ou impressões digitais das bactérias analisadas.Esses espectros de massa são então importados para o software e um banco de dados de modelo é construído. Em seguida, os espectros de massa de referência no banco de dados do modelo são processados e analisados usando análise de cluster, correspondência de pico e análise estatística. Finalmente, espectros de massa de bactérias codificadas cegamente, que são selecionadas aleatoriamente dessas 15 bactérias, são coletados novamente e comparados com os espectros de referência no banco de dados do modelo para resultados de identificação mostram que as bactérias podem ser identificadas corretamente com base em coeficientes de similaridade ou potenciais biomarcadores e classes de pico.Comece este procedimento com a deposição de um microlitro de extrato de proteína sem células viáveis em uma placa alvo de maldi de aço inoxidável e deixe secar. Em seguida, cubra o extrato de proteína seca com um microlitro de solução de matriz e deixe secar. Em seguida, deposite um microlitro de padrão CBR na placa alvo após a secagem, cubra o CBR com um microlitro de solução de matriz e deixe secar.Finalmente, deposite dois microlitros de solução de matriz na placa alvo como controle negativo. Use o multi para espectrômetro de massa equipado com o laser de nitrogênio e operado usando o software de controle flexível Bruker. Colete cada espectro de massa no modo linear positivo por acúmulo de 500 disparos de laser em incrementos de 100 disparos.Defina a fonte de íons uma tensão para 20, quilovolts a fonte de íons, duas tensões para 18.15 quilovolts e a tensão da lente para 9.05 quilovolts. Esses parâmetros são específicos do instrumento e podem exigir otimização. Defina a faixa de massa para carga para avaliação automatizada do espectro de dois a 20 quilodaltons por carga.Em seguida, defina o limite mínimo de resolução em 100. Selecione o algoritmo de detecção de pico OID. Defina o limiar da relação sinal-ruído em dois e o limiar mínimo de intensidade em 100.Por fim, defina o acúmulo de pico como 500 para o design do banco de dados. Crie um novo banco de dados no bionumérico 7.1 usando o novo assistente de banco de dados. Em seguida, crie um tipo de experimento de espectro, como maldi, usando comandos no painel de tipos de experimento.Em seguida, crie os níveis usando o painel de design do banco de dados, navegue até o menu do banco de dados e adicione novos níveis usando o comando level add new level aqui. Crie nível de espécie, nível de replicação biológica e nível técnico. Para importar os espectros de massa brutos.Primeiro, exporte os espectros de massa brutos como arquivos de texto usando a análise flex navegando no menu de arquivo e clicando no comando exportar espectro de massa. Em seguida, importe os espectros de massa brutos para o banco de dados no nível das réplicas técnicas. Pré-processe os espectros de massa brutos importando e reamostrando usando um algoritmo de ajuste quadrático.Em seguida, execute uma subtração de linha de base usando um disco rolante com um tamanho de 50 pontos, calcule o ruído usando a transformação wavelet contínua ou CWT. Suavize os espectros usando uma janela Kaiser com um tamanho de janela de 20 pontos e um beta de 10 pontos. Em seguida, execute uma segunda subtração de linha de base usando um disco rolante com um tamanho de 200 pontos.Finalmente, detecte os picos usando o CWT com uma relação sinal-ruído mínima de 10 após o pré-processamento de padrões característicos seguros de cada espectro de massa, como listas de picos, contendo tamanhos de pico, intensidades de pico e relação sinal-ruído. Em seguida, crie espectros de massa compostos a partir de espectros pré-processados usando o comando resumido no menu de análise. Escolha a replicação biológica como o nível de destino. Aqui.Combine espectros de massa de 10 réplicas técnicas da mesma colônia para produzir um espectro de massa composto para essa colônia, resultando em três espectros de massa compostos para esse isolado no nível de replicação biológica. Finalmente, resuma os três espectros compostos para criar um espectro composto para esse isolado no nível da espécie. Para executar a análise de cluster baseada em similaridade e o dimensionamento multidimensional, crie grupos com cores.Primeiro, selecione os três espectros de massa compostos biológicos e clique no comando criar novo grupo a partir da seleção no menu do grupo para criar um grupo para o isolado correspondente. Em seguida, projete uma cor usada automaticamente para esses três espectros de massa. Execute a análise de cluster navegando no menu de clustering e clicando no comando calculate cluster analysis.Nas configurações de comparação, página um, selecione a correlação de Pearson e deixe outros parâmetros como padrão. Na página dois, selecione o método de grupo de pares não ponderados com média aritmética. Em seguida, clique em concluir.Obtenha um gráfico de dimensionamento multidimensional usando o comando de dimensionamento multidimensional no menu de estatísticas para executar a correspondência de pico. Clique no tipo de espectro maldi no painel de experimentos. Em seguida, selecione o layout.Mostrar imagem, picos individuais de espectros são mostrados. Em seguida, execute a correspondência de pico usando o comando do peak matching no menu de espectros para identificar classes de pico, execute o agrupamento bidirecional clicando na matriz de estatísticas. Mineração. A intensidade dos picos combinados com as classes de pico é representada como um mapa de calor para identificar bactérias usando o método baseado no coeficiente de similaridade, criar uma comparação e gerar um rogram baseado em espectros de massa no nível de replicação técnica, conforme realizado para análise de cluster, salvar o rogram para comparação de similaridade.Selecione um espectro de massa desconhecido e clique na análise. Identifique as entradas selecionadas. A caixa de diálogo de identificação é exibida.Selecione o tipo de classificador baseado em comparação e clique em Avançar. Na próxima página, escolha o grama salvo como uma comparação de referência e clique em Avançar. Escolha a semelhança básica como método de identificação e, novamente, clique em Avançar, escolha a semelhança máxima como método de pontuação.Digite os valores de limite apropriados e os valores mínimos de diferença para cada parâmetro e clique em Avançar. Depois que os cálculos forem concluídos, a janela de identificação aparecerá no painel de resultados. Os membros do banco de dados que melhor correspondem ao desconhecido são listados.Um rogram baseado na análise de agrupamento mostra uma semelhança entre cada isolado no banco de dados. O conjunto de dados contém espectros de 15 espécies diferentes com três espectros compostos para cada espécie. A análise de cluster bidirecional pode ajudar os pesquisadores a identificar potenciais biomarcadores para uma espécie ou cepas dentro de uma espécie.Aqui, a intensidade de pico é representada por cores, verde significando baixa intensidade e vermelho significando alta intensidade. Finalmente, com base nessas análises, o espectro de massa de uma incógnita pode ser comparado ao grama e uma identificação baseada em coeficiente de similaridade é alcançada.

use-maldi-tof-mass-spectrometry-custom-database-to-characterize

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A aplicação de matriz assistida por laser de dessorção / ionização por tempo de voo (MALDI-TOF), espectrometria de massa (MS) directamente ao caldo de cultura do sangue acelera a identificação de bactérias. O método apresentado é um método rápido e fiável para a identificação de bactérias Gram-negativas directamente do caldo de cultura do sangue.

Rápida identificação de bactérias gram-negativas de Sangue Cultura Caldo Usando MALDI-TOF Espectrometria de Massa

A espectrometria de massa de tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS) e as técnicas moleculares (sequenciamento do gene 16S rRNA) permitem a identificação de patógenos bacterianos raros em diagnósticos de rotina. O objetivo deste protocolo reside na combinação de ambas as técnicas, o que leva a dados mais precisos e confiáveis.

Identificação de patógenos bacterianos raras, seqüência do gene 16rRNA e MALDI-TOF MS

IDBac é um pipeline de Bioinformática baseado em espectrometria de massas de código aberto que integra dados de proteínas intactas e espectros metabólito especializados, coletados em material celular raspado de colônias bacterianas. O pipeline permite que os pesquisadores organizem rapidamente centenas a milhares de colônias bacterianas em grupos taxonômicos putativos e diferenciem-se ainda mais com base na produção de metabólito especializado.

Usando o pipeline de código aberto MALDI TOF-MS IDBac para análise de proteína microbiana e dados metabólito especializados

Um protocolo de mineração de genoma guiado por espectrometria em massa é estabelecido e descrito aqui. Baseia-se em informações de seqüência de genomas e análise sustal e tem como objetivo facilitar a identificação de moléculas de extratos microbianos e vegetais complexos.

Mineração de genoma guiada por espectrometria em massa como ferramenta para descobrir novos produtos naturais

Aqui apresentamos um protocolo para a identificação rápida de proteínas produzidas por bactérias patogênicas genomicamente sequenciadas usando espectrometria de massa maldi-TOF-TOF e análise proteômica de cima para baixo com software desenvolvido internamente. Íons proteicos metastáveis fragmentom por causa do efeito ácido aspartic e essa especificidade é explorada para identificação de proteínas.

Identificação de Proteínas de Imunidade Antibacteriana em Escherichia coli usando MALDI-TOF-TOF-MS/MS e Análise Proteômica De Cima Para Baixo

Um novo método de preparação de amostras é demonstrado para a análise de macrocolônias bacterianas à base de ágar por meio de espectrometria de massa por imagem de dessorção/ionização a laser assistida por matriz.

Investigação da Cooperação Microbiana via Análise de Espectrometria de Massa por Imagem de Colônias Bacterianas Cultivadas em Ágar e em Tecido Durante a Infecção

Este protocolo permite uma avaliação rápida e econômica da composição microbiana em produtos lácteos, combinando culturomics com MALDI-TOF MS. Ele fornece resultados de taxonomia comparáveis ao sequenciamento de rRNA 16S com um tempo de resposta mais curto do que os métodos tradicionais de cultura.

Avaliação da segurança microbiana de laticínios usando perfil proteômico bacteriano via abordagem MALDI

Este vídeo demonstra a preparação de uma ultra-fina camada de matriz / analito para a análise de peptídeos e proteínas por Matrix Assisted Laser-ionização dessorção Espectrometria de Massa (MALDI-MS).

MALDI preparação da amostra: o método de Camada Ultra Thin

Expressão reduzida / ausente de PMS2 e / ou ERCC1 em criptas inteiro é um evento freqüente dentro de 10 centímetros em cada lado do adenocarcinomas do cólon, provavelmente a base de um defeito de campo com alta mutabilidade ea progressão para o câncer. Deficiência em Ku86 ou CCOI é muito menos freqüente nesses defeitos de campo.

PMS2 deficiente, ERCC1, Ku86, CCOI Defeitos em campo durante a progressão para cancro do cólon

Padrões de Isótopos estáveis ​​e Captura de Anticorpos Anti-Peptide (SISCAPA) casais enriquecimento afinidade de peptídeos com isótopos estáveis ​​de diluição espectrometria de massa (MRM-MS) para fornecer a medição quantitativa de peptídeos como substitutos para suas respectivas proteínas. Aqui nós descrevemos o protocolo usando partículas magnéticas em um formato parcialmente automatizados.

Quantificação de Proteínas Usando Enriquecimento imunoafinidade Peptide Acoplado com Espectrometria de Massa

Aprenda a identificar bactérias usando MALDI-TOF MS e banco de dados personalizado. Este método permite caracterizar microrganismos de ambientes únicos como cavernas com alta precisão e rapidez.

Uso de MALDI-TOF Espectrometria de Massa e um banco de dados personalizado para caracterizar bactérias indígenas para uma caverna ambiente único (Kartchner Caverns, AZ, EUA) (Vídeo) | JoVE Journal

Uso de MALDI-TOF Espectrometria de Massa e um banco de dados personalizado para caracterizar bactérias indígenas para uma caverna ambiente único (Kartchner Caverns, AZ, EUA)

Explorar mais vídeos