A estimulação optogenética do nervo auditivo
8 de outubro de 2014
O implante coclear (IC) permitem ouvir pela estimulação elétrica direta do nervo auditivo. No entanto, a má frequência e intensidade resolução limita a qualidade de ouvir com CIs. Aqui descrevemos estimulação optogenética do nervo auditivo em ratos como uma estratégia alternativa para a investigação auditiva e desenvolvimento de futuros ICs.
O objetivo geral deste procedimento é estimular opticamente o nervo auditivo de animais com neurônios do gânglio espiral optogeneticamente modificados. Isso é feito preparando primeiro um estimulador micro LED azul ou uma fibra óptica acoplada a um laser azul. O próximo passo do procedimento é avaliar a cóclea usando uma abordagem microcirúrgica retroauricular.
O terceiro passo é posicionar o estimulador óptico para registrar as respostas do tronco encefálico evocadas opticamente. A etapa final é acessar o cólus inferior para registrar a atividade evocada opticamente. Em última análise, os resultados podem mostrar a estimulação bem-sucedida do sistema auditivo por meio de registros das respostas auditivas do tronco encefálico e dos potenciais de campo locais.
No colículo inferior Estimulação optogenética do nervo auditor. Como alternativa ao elétrico, o implante coclear promete melhor resolução de frequência e intensidade. Isso é de grande interesse para a pesquisa de auditores, mas as implicações dessa técnica se estendem para uma melhor restauração da audição em surdos.
Este método pode ajudar a responder a questões-chave na pesquisa auditiva, como o papel da atividade padrão para o refinamento do desenvolvimento ortopédico, a necessidade de integração espectral na localização celular e a extensão da interação entre as projeções de quadros específicos de frequência. No sistema auditivo central, a demonstração visual do procedimento é crítica, pois o posicionamento e a orientação adequados do micro LED ou da fibra óptica são difíceis de aprender. O estimulador micro LED usa um LED azul com uma superfície ativa de 200 mícrons quadrados primeiro solda fios ao micro LED.
Em seguida, usando um epóxi encapsular o LED e sua conexão, deixe-o secar durante a noite. Uma vez curado, passe os fios por um diâmetro externo de um milímetro. Empreste capilar de vidro de silicato.
O vidro proporciona estabilidade mecânica e isolamento elétrico. Sele a junção do capilar e o LED revestido com epóxi com mais epóxi posicione o capilar para que possa ser montado em um manipulador. Agora verifique as conexões elétricas.
Primeiro, prepare três fios de cobre. Mergulhe uma extremidade de cada um em um banho de cloreto de sódio a 0,9%. Em seguida, conecte suas outras extremidades a um amplificador A BR.
Monitore o sinal com um osciloscópio. Em seguida, conecte o micro LED ao estimulador personalizado para o teste. Mergulhe o micro LED conectado ao estimulador no banho e ligue o LED por pelo menos 20 minutos.
Enquanto estimula o LED, monitore o osciloscópio em busca de artefatos. Descarte todos os LEDs defeituosos. Anestesie um camundongo de quatro a 10 semanas de idade.
Este camundongo expressa opsina de canal dois sob o promotor da coxa 1.2 10 minutos. Após a injeção dos anestésicos, verifique o reflexo de retirada dos animais para confirmar um plano cirúrgico de anestesia. Em seguida, aplique pomada nos olhos e inicie a cirurgia.
Primeiro, raspe cuidadosamente a área retroauricular para se aproximar da bula, a cavidade do ouvido médio cheia de ar. Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento no lado cirúrgico usando uma micro pinça. Disseque cuidadosamente os músculos do pescoço, ou seja, o platisma, o esternocleidomastóideo e os escalenos.
Agora exponha a bula. É uma estrutura óssea esférica com um anel na superfície onde a membrana timpânica está localizada. Usando uma agulha de insulina, faça um orifício logo abaixo do anel do orifício.
Remova o osso que cobre a bula. Use Rons finos e microfórceps expondo o pró-auditório da cóclea no processo. Em seguida, inicie a cóclea. Ostomia.
Primeiro raspe a cápsula óssea sem interromper o labirinto membranoso. Agora abra uma pequena janela de 500 a 800 mícrons na segunda curva coclear longe da artéria estaiada e da abertura do ápice. O ápice pode romper a cóclea e fraturar o modis.
Prepare-se para medir as respostas auditivas optogenéticas do tronco encefálico ou OABR. Primeiro, insira os eletrodos de agulha nos seguintes locais embaixo do pavilhão auricular, no vértice e na parte de trás perto das pernas com os eletrodos conectados a um amplificador. Amplifique o potencial de diferença entre o vértice e as agulhas subdérmicas da mastóide.
Amostrar a 50 kilohertz e filtrar as respostas entre um e 10.000 hertz para estimulação transcoclear. Monte um micro LED ou fibra, acoplado ao micro LED agarrado por um manipulador mecânico. Posicione-o cuidadosamente no lugar.
Visualize o potencial de diferença em um osciloscópio. Coloque-o próximo à configuração de gravação para que seja fácil otimizar a posição do estimulador óptico. Use a média do sinal e armazene os dados em um computador para análise offline.
Agora otimize a posição e a orientação do micro LED usando respostas a pulsos de corrente de três a 10 milissegundos de um a cinco hertz. Outra opção é a estimulação a laser por um laser de onda contínua de 473 nanômetros conectado a uma fibra óptica de 250 micrômetros. Isso requer controle analógico rápido da potência do laser ou um dispositivo óptico al.
Com um obturador rápido, posicione a fibra com um micro manipulador diretamente na ostomia da cóclea e fixe-a com cimento dentário para estimulação intracoclear. Insira a fibra através da janela redonda no s Scala.Tempe. Otimize a posição e a orientação da fibra provocando respostas com pulsos de três a 10 milissegundos de 10 a 30 miliwatts a um a cinco hertz.
O posicionamento do estimulador é a etapa mais crítica do protocolo. O micro ED ou a fibra óptica devem ser realocados pacientemente até que o OABR seja evidente. Uma vez que boas respostas optogenéticas e auditivas do tronco encefálico sejam feitas, fixe a fibra com cola de cianoacrilato ou cimento dentário.
Para este protocolo, use uma estrutura estereotáxica e prepare um mouse abrindo o crânio sobre o cólus inferior. Usando um microscópio, posicione uma sonda de registro sobre o cólus inferior e insira-a de forma que o canal superior fique visível apenas na superfície. Agora, amplifique o potencial de diferença entre os canais individuais da matriz de gravação e o parafuso de referência e o osso parietal.
Use uma taxa de amostragem de 32 kilohertz, um filtro passa-baixo de 300 hertz e salve os dados. Uma ostomia ideal da cóclea é crítica e aumenta a probabilidade de um experimento bem-sucedido. Isso significa que a janela é pequena, regular e não há lesão das estruturas cocleares internas.
Por exemplo, o sangramento indica dano do STR ssis usando camundongos transgênicos do canal Rodin dois. O canal Rodin dois é expresso nos neurônios do grupo espiral dentro da iluminação de luz azul da cóclea, seja por micro LED ou por laser, provocando grandes A BR optogenéticos, que diferem do acústico A BR em amplitude e forma de onda optogenética. Um BR tem amplitudes maiores do que o acústico A BR optogenético.
Um BR é, portanto, mais comparável ao elétrico A BR. Ambos podem recrutar mais neurônios do gânglio espiral ou provocar uma ativação mais sincronizada dos neurônios do gânglio espiral. A propagação da atividade pela via auditiva foi verificada por meio de registros extracelulares no sistema auditivo central. Por exemplo, a estimulação optogenética da cóclea provocou atividade neural no mesencéfalo auditivo.
A estabilidade mecânica e os isolamentos elétricos seguros dos estimuladores micro LED, bem como a prevenção do fluxo excessivo de carbono, são fatores críticos para o uso bem-sucedido da optogenética da cóclea. Ao tentar este profissional, é importante lembrar de evitar ferir a artéria distro no Ebola. Uma vez masterizadas, as gravações do colículo inferior podem ser feitas em cerca de três horas, se executadas corretamente.
Seguindo este procedimento a, um método como gravações de unidade única no colículo inferior pode ser realizado. A estimulação optogenética da via auditiva abrirá caminho para que pesquisas em neurociência auditiva façam perguntas que antes não poderiam ser abordadas com estimulação acústica ou elétrica. Esperamos também que esta técnica se traduza em reabilitação clínica da deficiência auditiva.
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Visão Geral
Este artigo discute o uso da estimulação optogenética do nervo auditivo em camundongos como uma abordagem inovadora para a pesquisa auditiva. O método tem como objetivo superar as limitações dos implantes cocleares, proporcionando melhor resolução de frequência e intensidade.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Pesquisa Auditiva
- Optogenética
Antecedentes
- Implantes cocleares estimulam o nervo auditivo, mas apresentam limitações.
- A optogenética permite o controle preciso da atividade neuronal.
- Este estudo explora um novo método para estimulação auditiva.
- Modelos animais, especificamente camundongos, são utilizados para experimentação.
Objetivo do Estudo
- Estimular opticamente o nervo auditivo utilizando neurônios modificados.
- Avaliar a eficácia das técnicas optogenéticas na pesquisa auditiva.
- Melhorar a qualidade da estimulação auditiva em comparação com métodos tradicionais.
Métodos Utilizados
- Preparação de um estimulador de micro LED azul ou de uma fibra óptica com laser azul.
- Avaliação da cóclea por meio de uma abordagem microcirúrgica retroauricular.
- Posicionamento do estimulador óptico para registrar respostas do tronco encefálico.
- Acesso ao colículo inferior para registro de atividade evocada opticamente.
Resultados Principais
- Estimulação óptica bem-sucedida do sistema auditivo foi alcançada.
- Foram obtidos registros de respostas auditivas do tronco encefálico.
- Potenciais de campo locais foram registrados, indicando estimulação eficaz.
- O método mostra potencial para pesquisas futuras na área auditiva e para o desenvolvimento de ICs.
Conclusões
- A estimulação optogenética pode aprimorar as metodologias de pesquisa auditiva.
- Essa abordagem pode levar a tecnologias aprimoradas de implante coclear.
- São necessários estudos adicionais para explorar seu potencial completo.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A estimulação optogenética do nervo auditivo aborda uma limitação fundamental dos implantes cocleares—baixa resolução de frequência e intensidade devido à ampla dispersão da corrente—ao permitir a ativação espacialmente confinada dos neurônios do gânglio espiral. Essa abordagem auxilia na desmistificação mecanicista na neurociência auditiva, possibilitando a investigação precisa dos padrões de codificação neural e das contribuições específicas das vias para a percepção auditiva. Para a pesquisa e desenvolvimento em biofármacos, fornece um sistema relevante à doença para avaliar o engajamento de alvos e os resultados funcionais em modelos pré-clínicos de perda auditiva, aumentando a confiança preditiva no desenvolvimento terapêutico.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao isolar o papel de populações neuronais específicas na ativação e refinamento da via auditiva.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos por meio do controle específico de tipos celulares de neurônios do gânglio espiral, reduzindo efeitos fora do alvo em estudos de validação de alvos.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança no alvo ao associar a ativação optogenética a respostas mensuráveis downstream no colículo inferior, orientando decisões de prosseguimento ou interrupção.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão para ensaio: Gera respostas auditivas do tronco encefálico optogenéticas (oABR) e potenciais de campo locais como saídas padronizadas para triagem de compostos ou genética.
- Reprodutibilidade: Permite estimulação confiável e repetível por meio de sistemas micro-LED ou a laser com acoplamento por fibra, com parâmetros de pulso definidos (3–10 ms, 1–5 Hz), para aquisição consistente de dados.
- Escalabilidade: Compatível com métodos de entrega por coqueostomia e pela janela redonda, permitindo adaptação entre modelos experimentais e integração ao fluxo de trabalho.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Utiliza camundongos transgênicos que expressam a canalrodrapsina-2 em neurônios do gânglio espiral, criando um modelo que reflete o alvo celular da terapia com implante coclear.
- Continuidade Tradutiva: Conecta a descoberta científica à validação pré-clínica ao demonstrar a propagação da atividade evocada optogeneticamente ao longo da via auditiva até o colículo inferior.
- Avanço com Ajuste de Risco: Fornece subsídios mecanicistas sobre a sincronização e o recrutamento de populações neuronais, contribuindo para a redução de riscos em estratégias de próteses auditivas e neuromodulação.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líder e a avaliação pré-clínica, oferecendo uma plataforma para avaliar o envolvimento da via auditiva com precisão celular.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir o controle preciso no tempo e no espaço da atividade dos neurônios do gânglio espiral, possibilitando a análise dos mecanismos de codificação no sistema auditivo.
- Triagem: Fornece leituras neurofisiológicas quantitativas prontas para ensaios (amplitude, forma de onda e latência do ARO), que permitem comparações entre diferentes modalidades de estimulação e condições genéticas.
- Análises: Gera sinais eletrofisiológicos (respostas auditivas do tronco encefálico, potenciais de campo local) adequados para análise estatística e comparação entre grupos em estudos pré-clínicos.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao verificar a propagação da atividade até estruturas auditivas centrais, alinhando-se a medidas de desfecho baseadas em biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável em neurociência auditiva, aplicável em diversos estudos sobre restauração da audição, plasticidade neural e processamento sensorial.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista na codificação neural auditiva por meio da estimulação específica por tipo celular.
- Valor Operacional: Promove a padronização por meio de parâmetros definidos de estimulação óptica e rotas de acesso cirúrgico (cochleostomia, janela redonda) para resultados reprodutíveis.
- Valor Estratégico: Orienta decisões mais precisas de avançar ou não ao fornecer dados funcionais de alta resolução que superam as limitações da estimulação elétrica na codificação de frequência e intensidade.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos a terapias auditivas ao validar o engajamento do alvo e os efeitos específicos da via logo nas fases iniciais da descoberta.
Considerações sobre a Implementação
- Exige especialização em optogenética, microcirurgia e eletrofisiologia para o direcionamento viral ou transgênico de neurônios do gânglio espiral e acesso à cóclea.
- Depende de instrumentação incluindo micro-LEDs, lasers acoplados por fibra, estruturas estereotáxicas e amplificadores capazes de detectar sinais em nível de microvolts.
- Necessita padronização entre equipes das técnicas cirúrgicas (por exemplo, tamanho da coileostomia, posicionamento) e dos protocolos de estimulação óptica para garantir a reprodutibilidade entre laboratórios.
- Envolve considerações de adaptação ao se traduzir de modelos em camundongos para espécies maiores, particularmente em relação à eficiência de entrega de luz e dispersão nos tecidos.
- É limitado pela necessidade de acesso genético aos neurônios do gânglio espiral, o que pode exigir entrega viral ou linhagens transgênicas não universalmente disponíveis entre cepas ou espécies.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:54
Preparing the μLED Stimulator
3:31
Cochleostomy for Transcochlear Stimulation
5:12
Implanting the Stimulator and Recording Optogenetic Auditory Brainstem Responses (oABR)
7:40
Recording Optically Evoked Local Field Potentials
8:21
Results: Comapring Auditory Brainstem Response and Signal Propagation from oABR
9:46
Conclusion
