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Advanced Biology

Uma Introdução à Neurobiologia do Desenvolvimento

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Neuroscience

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JoVE Science Education Neuroscience

An Introduction to Developmental Neurobiology

1.12: Neuronal Transfection Methods

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09:24 min

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April 30, 2023

Overview

A neurociência do desenvolvimento é um campo que explora como o sistema nervoso é formado, desde os estágios embrionários iniciais até a idade adulta. Embora se saiba que as células progenitoras neurais seguem estágios previsíveis de proliferação, diferenciação, migração e maturação, os mecanismos que controlam a progressão por cada estágio são incompletamente compreendidos. Estudar o desenvolvimento não é importante apenas para entender como estruturas complexas são montadas, mas também para caracterizar e tratar transtornos do desenvolvimento. Uma vez que os processos de reparação de lesões são semelhantes aos que ocorrem em desenvolvimento, este campo também é uma fonte promissora de discernimento sobre quando e como os tecidos do sistema nervoso se regeneram.

Este vídeo fornece uma breve visão geral do campo da neurociência do desenvolvimento, incluindo alguns experimentos-chave que avançaram nossa compreensão dos mecanismos que controlam a formação do tecido neural precoce e a especialização adicional dessas células em subconjuntos discretos de neurônios. A discussão se concentra em questões proeminentes que os biólogos do desenvolvimento estão fazendo e, em seguida, demonstra alguns dos métodos que eles usam para investigar essas questões. Finalmente, as aplicações das técnicas são apresentadas para fornecer uma visão do que significa ser um neurocientista do desenvolvimento hoje em dia. A gama de experimentos demonstrados inclui manipulação genética de cérebros embrionários intactos, diferenciação direcionada de células-tronco em células do sistema nervoso, e técnicas de coloração que permitem a quantificação de eventos específicos de desenvolvimento, como a formação de novas conexões entre os neurônios.

Procedure

A neurobiologia do desenvolvimento explora como algumas células embrionárias primitivas podem se transformar em um sistema nervoso intrincadamente organizado que controla um organismo inteiro.

Cientistas neste campo estão interessados em como as células assumem identidades específicas, migram para regiões definidas e se conectam para formar um sistema funcional. Esses processos são importantes para entender como funciona o sistema nervoso, bem como o diagnóstico e tratamento de uma ampla gama de doenças neurológicas enraizadas no desenvolvimento anormal.

Este vídeo irá levá-lo em um breve passeio pela história da neurobiologia do desenvolvimento, delinear questões-chave no campo e explorar métodos proeminentes usados para responder a essas perguntas. Finalmente, vamos dar uma olhada em algumas aplicações práticas de pesquisa neurodesenvolvimentar.

Vamos começar com alguns estudos marcantes da história da neurobiologia do desenvolvimento.

As primeiras pesquisas neurodesenvolvimentais datam do século XIX. Na década de 1880, Wilhelm His estabeleceu o estudo da histogênese, ou as origens embrionárias do tecido. Ele foi uma das primeiras pessoas a ver neurônios em desenvolvimento estender processos como axônios e dendritos.

Em 1924, os embriologistas Hans Spemann e Hilde Mangold estudaram a função de um aglomerado de células conhecida como organizadora de Spemann. Eles descobriram que o transplante do organizador para outro embrião induziu a formação de tecido neural secundário.

Então, na década de 1950, Rita Levi-Montalcini e Stanley Cohen observaram que o transplante de pedaços de tumores no desenvolvimento de embriões de frango levou ao rápido crescimento dos neurônios. Eles especularam que o tumor secretou uma substância que causou esse crescimento, e logo identificaram essa proteína como fator de crescimento nervoso, ou NGF, que é essencial para a sobrevivência dos neurônios.

Em outro estudo de transplante, Nicole Le Douarin substituiu partes de embriões de filhotes por as de codornas. Ao rastrear as células de codorna através do desenvolvimento, ela mostrou que um grupo altamente migratório de células, conhecidas como crista neural, dá origem a nervos periféricos maduros.

Alguns anos depois, Pasko Rakic estudou como as células do sistema nervoso central se organizam em estruturas altamente ordenadas durante o desenvolvimento. Rakic rotulou células divisórias no desenvolvimento de fetos com nucleotídeos radioativos, permitindo-lhe determinar quando as células cerebrais nasceram e onde seu destino final estava no cérebro maduro.

Durante as últimas décadas do século XX, surgiu uma nova era de pesquisas que se concentraram nos sinais celulares e moleculares que orientavam o desenvolvimento do sistema nervoso.

Por exemplo, em meados dos anos 90, Tom Jessell mostrou que certos fatores de transcrição, ou proteínas que ajudam a controlar a expressão genética, influenciaram o desenvolvimento de subtipos únicos de neurônios na medula espinhal do camundongo em desenvolvimento. Seguindo este trabalho, os pesquisadores de hoje ainda estão identificando novos genes que controlam o desenvolvimento neural.

Agora que você viu alguns destaques históricos, vamos passar por cima de algumas questões-chave na neurobiologia do desenvolvimento moderno.

Muitos pesquisadores estudam a padronização e a especificação do destino das células do sistema nervoso. Por exemplo, eles estão interessados na programação genética que orienta as células-tronco precoces a se diferenciarem em neurônios ou glia, que são as células de suporte do sistema nervoso. Eles também podem investigar sinais secretos que influenciam identidades mais especializadas dentro de uma classe de células ou em locais específicos.

Outro grande foco é como os neurônios e a glia são capazes de se organizar e se reunir no sistema nervoso maduro. Alguns pesquisadores estudam a dinâmica citoesquelélada das células que migram de sua origem para o local em que funcionam. Outros estão interessados em como os sinais do ambiente extracelular influenciam o comportamento migratório.

Neurocientistas de desenvolvimento também avaliam como as conexões entre as células são formadas e refinadas ao longo do desenvolvimento. Alguns estudos se concentram na função dos receptores de orientação do axônio, que são proteínas de superfície celular que detectam pistas externas e guiam o desenvolvimento de axônios, ou neurites, para suas células-alvo. Outro foco é o estudo das conexões físicas e químicas envolvidas na sinápgeno, que é a formação de novas conexões de sinalização, ou sinapses, entre as células.

Agora, vamos olhar para alguns métodos proeminentes usados para responder algumas dessas perguntas neurodesenvolvimentista.

Para estudar o controle genético da identidade celular e da padronização do sistema nervoso, é útil manipular a expressão de genes específicos no desenvolvimento de embriões. Um método popular está na eletroporação utepla, na qual o DNA exógeno é entregue no cérebro de roedores em desenvolvimento. Ao expor o útero de um DNA de camundongos anestêmido e gestante pode ser injetado nos cérebros embrionários e a corrente aplicada para forçar o DNA nas células circundantes. Dependendo do experimento, o material eletroporado pode ser usado para promover a expressão genética ou preveni-lo, permitindo que os pesquisadores examinem o impacto das proteínas individuais no desenvolvimento cerebral.

O tecido do sistema nervoso central explantado é comumente usado para estudar a migração celular durante o desenvolvimento. Esta técnica envolve dissecar pequenos pedaços do cérebro ou medula espinhal e esculcá-los in vitro. Uma grande vantagem para essa abordagem é que o tecido é altamente acessível para capturar movimentos celulares através de imagens de lapso de tempo. Além disso, os efeitos de moléculas específicas sobre a migração podem ser facilmente estudados em explants através da aplicação de fatores de crescimento ou inibidores farmacológicos para a mídia cultural.

Para estudar as moléculas essenciais para a formação de redes neuronais, a imunohistoquímica pode ser usada. Esta técnica aproveita a especificidade dos anticorpos para marcar a localização de proteínas específicas em células e tecidos. A visualização da localização de proteínas usando microscopia fluorescente pode ajudar os pesquisadores a fazer hipóteses sobre como essas moléculas influenciam a formação e função de estruturas como a sinapse.

Agora que você está familiarizado com algumas abordagens para estudar neurociência de desenvolvimento, vamos olhar para aplicações desta pesquisa em laboratórios hoje.

Um dos principais objetivos do estudo do neurodesenvolvimento é descobrir como a identidade celular e a morfologia são determinadas. Para estudar o controle genético do desenvolvimento de neurônios, esses pesquisadores entregaram construções de knockdown genético no sistema nervoso de filhotes em desenvolvimento através da eletroporação. Os neurônios eletroporados dentro do tubo neural também foram rotulados por injeção de corante, de modo que a morfologia do axônio poderia ser comparada entre o controle e células geneticamente alteradas.

Para estudar como os neurônios estabelecem conexões, esses pesquisadores cultivaram neurônios extraídos de filhotes de ratos jovens. Após vários dias na cultura, as células foram fixadas e manchadas com anticorpos específicos de proteínas sinápticas, permitindo quantificação da formação de sinapse em múltiplas condições experimentais, como superexpressão genética, ou cultura em meio de crescimento modificado.

Usando seu conhecimento do programa que impulsiona o desenvolvimento neural, os pesquisadores de hoje podem agora forçar células embrionárias precoces, como células-tronco, para baixo caminhos específicos de diferenciação in vitro. Esses pesquisadores trataram células-tronco humanas com o derivado de vitamina A, ácido retinóico, que resultou em redução da expressão de fatores de transcrição que mantêm a identidade das células-tronco e a expressão aprimorada dos marcadores neuronais. Essa técnica fornece aos pesquisadores uma valiosa fonte de neurônios humanos para investigar os mecanismos por trás da doença neurológica.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à neurociência do desenvolvimento. Este vídeo analisou destaques históricos, perguntas-chave feitas por neurocientistas do desenvolvimento e algumas das técnicas que eles usam.

Obrigado por assistir!

Transcript

Developmental neurobiology explores how a few early embryonic cells can transform into an intricately organized nervous system that controls an entire organism.

Scientists in this field are interested in how cells take on specific identities, migrate to defined regions, and connect to form a functional system. These processes are important for understanding how the nervous system functions as well as the diagnosis and treatment of a broad range of neurological diseases rooted in abnormal development.

This video will take you on a brief tour of the history of developmental neurobiology, outline key questions in the field, and explore prominent methods used to answer those questions. Finally, we’ll have a look at some practical applications of neurodevelopmental research.

Let’s begin with some landmark studies from the history of developmental neurobiology.

Early neurodevelopmental research dates back to the 19th century. In the 1880s, Wilhelm His established the study of histogenesis, or the embryonic origins of tissue. He was one of the first people to watch developing neurons extend processes like axons and dendrites.

In 1924, embryologists Hans Spemann and Hilde Mangold studied the function of a cluster of cells known as the Spemann organizer. They found that the transplantation of the organizer to another embryo induced the formation of secondary neural tissue.

Then in the 1950’s, Rita Levi-Montalcini and Stanley Cohen observed that transplanting pieces of tumors onto developing chicken embryos led to rapid neuron growth. They speculated that the tumor secreted a substance that caused this growth, and soon identified that protein as nerve growth factor, or NGF, which is essential to neuron survival.

In another transplant study, Nicole Le Douarin replaced parts of chick embryos with those from quails. By tracking the quail cells through development, she showed that a highly migratory group of cells, known as the neural crest, gives rise to mature peripheral nerves.

A few years later, Pasko Rakic studied how cells of the central nervous system arrange themselves into highly ordered structures during development. Rakic labeled dividing cells in developing fetuses with radioactive nucleotides, allowing him to determine when brain cells were born and where their final destination was in the mature brain.

During the last decades of the 20th century, a new era of research emerged that focused on the cell and molecular signals guiding nervous system development.

For example, in the mid ‘90s, Tom Jessell showed that certain transcription factors, or proteins that help control gene expression, influenced the development of unique subtypes of neurons in the developing mouse spinal cord. Following on this work, today’s researchers are still identifying new genes that control neural development.

Now that you’ve seen a few historical highlights, let’s go over some key questions in modern developmental neurobiology.

Many researchers study patterning and fate specification of nervous system cells. For example, they are interested in the genetic programming that guides early stem cells to differentiate into either neurons or glia, which are the support cells of the nervous system. They may also investigate secreted signals that influence more specialized identities within a class of cells or in specific locations.

Another major focus is how developing neurons and glia are able to organize themselves and assemble into the mature nervous system. Some researchers study cytoskeletal dynamics of cells migrating from their origin to the site at which they function. Others are interested in how signals from the extracellular environment influence migratory behavior.

Developmental neuroscientists also evaluate how connections between cells are formed and refined over the course of development. Some studies focus on the function of axon guidance receptors, which are cell surface proteins that detect external cues and guide developing axons, or neurites, to their target cells. Another focus is the study of the physical and chemical connections involved in synaptogenesis, which is the formation of new signaling connections, or synapses, between cells.

Now, let’s look at a few prominent methods used to answer some of these neurodevelopmental questions.

To study the genetic control of cell identity and nervous system patterning, it is helpful to manipulate the expression of specific genes in developing embryos. One popular method is in utero electroporation, in which exogenous DNA is delivered into the brain of developing rodents. By exposing the uterus of an anesthetized, pregnant mouse DNA can be injected into the embryonic brains and current applied to force the DNA into surrounding cells. Depending on the experiment, electroporated material can be used to either promote gene expression or prevent it, allowing researchers to examine the impact of individual proteins on brain development.

Explanted central nervous system tissue is commonly used to study cell migration during development. This technique involves dissecting small pieces of brain or spinal cord and culturing them in vitro. A major advantage to this approach is that the tissue is highly accessible for capturing cell movements via time-lapse imaging. Additionally, the effects of specific molecules on migration can easily be studied in explants through application of growth factors or pharmacological inhibitors to the culture media.

To study the molecules that are essential to the formation of neuronal networks, immunohistochemistry can be used. This technique takes advantage of the specificity of antibodies to mark the location of specific proteins in cells and tissues. Visualization of protein localization using fluorescent microscopy can help researchers make hypotheses regarding how these molecules influence the formation and function of structures like the synapse.

Now that you’re familiar with some approaches to studying developmental neuroscience let’s look at applications of this research in labs today.

A major goal of the study of neurodevelopment is to figure out how cell identity and morphology are determined. To study the genetic control of neuron development, these researchers delivered gene knockdown constructs into the developing chick nervous system via electroporation. Electroporated neurons within the neural tube were also labeled by dye injection, so that axon morphology could be compared between control and genetically altered cells.

To study how neurons establish connections, these researchers cultured neurons extracted from young rat pups. After several days in culture, cells were fixed and stained with antibodies specific to synaptic proteins, allowing for quantification of synapse formation under multiple experimental conditions, such as gene overexpression, or culture in modified growth medium.

Using their knowledge of the program driving neural development, today’s researchers can now force early embryonic cells, like stem cells, down specific differentiation pathways in vitro. These researchers treated human stem cells with the vitamin A derivative, retinoic acid, which resulted in reduced expression of transcription factors that maintain stem cell identity and enhanced expression of neuronal markers. This technique provides researchers with a valuable source of human neurons for investigating the mechanisms behind neurological disease.

You’ve just watched JoVE’s introduction to developmental neuroscience. This video reviewed historical highlights, key questions asked by developmental neuroscientists and some of the techniques they use.

Thanks for watching!

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