Name: Procedimento para safenas humanas Veias Ex Vivo Perfusão e reforço externo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Aprenda a perfusão ex vivo de veias humanas para estudar hiperplasia intimal e avaliar o reforço externo com malha. Este método reduz significativamente a hiperplasia após sete dias de perfusão.

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Este trabalho foi apoiado por doações do SNF [31003A-138528], da Octav e da Fundação Marcella Botnar, da Fundação Novartis e da Fundação Emma Muschamp. Agradecemos a Martine Lambelet e Jean-Christophe Stehle por sua excelente assistência técnica.

O Comitê de Ética da Universidade de Lausanne aprovou os experimentos, que estão de acordo com os princípios delineados na Declaração de Helsinque de 1975, revisada em 1983 para o uso de tecidos humanos.
1. Colheita da Veia Safena Grande Humana
<ol>
	<li>Obter segmentos excedentes de veias safenas humanas não varicosas de pacientes submetidos à cirurgia de revascularização do miocárdio para isquemia. Na sala de cirurgia, desinfete toda a perna com uma solução de iodo e cubra o paciente para expor a perna da virilha ao pé.</li>
	<li>Faça uma incisão mediana da virilha até o joelho (deixando a parte da pele interrompida).</li>
	<li>Colha a veia safena magna com um pedículo de tecido circundante (técnica sem toque). Prenda os ramos laterais das veias com laços de seda 4-0. Armazene imediatamente um segmento excedente mínimo de 9 cm de comprimento da veia safena magna, com um diâmetro externo de 2,5-4 mm a 4 ° C em um meio RPMI-1640 Glutamax, suplementado com 12,5% de soro fetal de bezerro e leve-o ao laboratório.</li>
</ol>
2. Design EVPS
<ol>
	<li>Monte o equipamento geral mostrado na Figura 1. Autoclave todos os equipamentos e mantenha todos os componentes em condições estéreis. Além disso, certifique-se de que o sistema seja à prova d'água e não vaze produtos químicos no meio. Use polimetacrilato de metila (PMMA-GS) para a capa. Aço (X5 Cr Ni 18 10) e plástico de polioximetileno (POM) como suporte de veio.</li>
	<li>Projete a câmara de perfusão para a geometria desejada para permitir a colocação da veia e sua conexão. Certifique-se de que a profundidade (ou raio se estiver usando construção cilíndrica) seja de pelo menos 2,5 cm para permitir flexão e dilatação mínimas do vaso, juntamente com cobertura constante pelos meios de cultura (Figura 1). A vedação é um problema importante e é a razão pela qual a construção retangular PMMA-GS é usada.</li>
	<li>Projete o suporte do veio para a geometria desejada. Para evitar dobras ou distensão excessiva, permita o ajuste do comprimento empurrando ou puxando (o parafuso não pode ser usado para esse fim, pois a veia seria torcida junto com o parafuso). 
	NOTA: Uma haste de aço completa conectada por 2 peças deslizantes em forma de L que suportam os 2 cilindros de veia (5 mm de diâmetro para encaixar no vaso) e a veia (Figura 1B e Figura 2) é usada aqui.</li>
	<li>Projete a coluna de pressão, de modo que a "pressão de repouso" aplicada ao sistema seja: p = 0-10 = h x ρ x g, onde p = pressão (N / m2, Pa) h = altura da coluna de fluido (m) ρ = densidade do líquido (kg / m3) e g = a constante gravitacional (9,81 m / seg2). Projete quatro dutos de conexão, de cima para baixo: para aplicar pressão, para a vazão (da veia), a entrada (para a veia) e para permitir a troca do meio.</li>
	<li>Prepare o meio. Com base em estudos anteriores5,11-14, escolha RPMI-1640, suplementado com Glutamax, soro fetal de bezerro a 12,5% e solução antibiótico-antimicótica a 1% (10.000 U/ml de penicilina G, mais 10 mg/ml de sulfato de estreptomicina, mais 25 mg/ml de anfotericina B, mais 0,5 μg/ml: gentamicina). A tensão de cisalhamento (SS) é dada por SS= 4 μQ/π*r3Q é a taxa de fluxo (ml/seg), é o raio (cm) do segmento da veia e μ é a viscosidade do meio de perfusão.
	<ol>
		<li>Modular o SS ajustando a viscosidade através da adição de 70 kDa dextrana. Meça a viscosidade com um viscosímetro. Aqui, adicione 8% de dextrano a 70 kDa para definir SS para 9-15 dyn / cm2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ajuste a bomba de engrenagem para induzir um sinal cardióide pulsátil de 60 pulsos/min e amplitude constante gerando um fluxo unidirecional de 150 ± 15 ml/min, independente da pressão aplicada no sistema e controlado por um computador. Certifique-se de que o software de acionamento integre a aquisição e o monitoramento constantes de pressões, velocidade do fluxo, taxa de pulso e sinal. Se desejar, use uma segunda bomba (não sincronizada) para produzir um fluxo turbulento não laminar.</li>
</ol>
3. Montagem EVPS (Figura 1)
<ol>
	<li>Antes de começar, certifique-se de que todo o equipamento seja estéril. Execute todas as etapas a seguir sob assepsia em uma capela de fluxo laminar.</li>
	<li>Coloque a veia em uma placa de Petri cheia de meio. Use uma lâmina cirúrgica e divida a veia em 3 segmentos iguais.</li>
	<li>Enxágue imediatamente um segmento em PBS. Divida o segmento em 3 partes, fixe uma em formalina para morfometria. Congele os outros dois para análise quantitativa de transcrição (RT-PCR) e proteína (western blot). Considere esses segmentos como uma veia de controle e não perfundida.</li>
	<li>Use os 2 segmentos restantes para perfusão.
	<ol>
		<li>Injete muito suavemente o meio na veia e determine a direção normal do fluxo; na presença de válvulas, a veia é invertida.</li>
		<li>A vedação das veias é de extrema importância para o sucesso experimental. Verifique se há vazamentos nas garantias. Proteja qualquer vazamento com suturas de seda 6-0.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Conecte o segmento da veia entre os dois cilindros metálicos, uma extremidade de cada vez (2.3, Figura 1). Fixe os cilindros com Ethibon 3-0 ao redor das reentrâncias (Figura 1A e B).
	<ol>
		<li>Coloque todo o segmento venoso na câmara de perfusão previamente preenchida com meio. Repita o mesmo procedimento para o segundo segmento. 
		NOTA: A falha em vedar adequadamente a veia do cilindro será uma fonte de vazamento, exigirá reintervenção e aumentará significativamente o risco de infecção e falha experimental.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Para reforçar (malhar) o segundo segmento, solte os dois cilindros (com o veio anexado) das peças em forma de L (2.3 e Figura 1).
	<ol>
		<li>Seja gentil e não toque na veia com nenhum instrumento. Deslize a malha primeiro no cilindro e depois na veia. Um empurrão / puxão fará com que a malha fique na veia.</li>
		<li>Uma vez que a malha cubra toda a superfície da veia, prenda a veia revestida aos cilindros com Ethibon 3-0.</li>
		<li>Remonte o composto veia/cilindro no suporte em forma de L e transfira-o para a câmara de perfusão, previamente preenchida com meio.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Conecte cada cilindro metálico (entrada e saída) a um divisor em Y usando tubos de silicone tratados com peróxido com diâmetro interno de 3.2 mm.</li>
	<li>Conecte o divisor de saída a um segundo divisor em Y usando o mesmo tipo de tubulação. A partir deste divisor em Y, use um tubo para medir a pressão de perfusão através de ambos os vasos. Conecte o outro de volta à coluna para formar um sistema de circuito fechado (Figura 2).</li>
	<li>Dentro da incubadora, use um tubo longo (um metro de comprimento) para conectar a coluna de pressão ao cabeçote da bomba.</li>
	<li>Complete a configuração conectando o cabeçote da bomba ao divisor em Y de entrada com outro tubo de comprimento longo (Figura 1).</li>
</ol>
4. Perfusão de veias
<ol>
	<li>Após a conclusão da montagem do EVPS, encha a coluna com meio (fique abaixo do duto de saída da veia para permitir o reabastecimento). Adicione mais mídia à coluna até que o sistema esteja cheio. Mova todo o sistema para a incubadora mantida a 37 ± 0,1 °C com um pH mantido constante em 7,40 ± 0,01 (usando um algoritmo de CO2/pH baseado na equação de Henderson-Hasselbach).</li>
	<li>Traga a cabeça da bomba de engrenagem para fora da incubadora e conecte-a ao acionamento da bomba de engrenagem. Aparafuse as hastes para prender o conjunto.</li>
	<li>Ligue a potência da bomba, certifique-se de que está ativada no software de condução e aguarde 5 minutos para que o meio seja distribuído igualmente em todos os compartimentos.</li>
	<li>Para monitorar a pressão, use um monitoramento da linha arterial. Conecte a saída de pressão EVPS (corresponde ao cateter arterial) ao transdutor de pressão conectado ao computador.
	<ol>
		<li>Certifique-se de que o tubo esteja totalmente cheio de meio e não contenha bolhas. Retire a bolha do sistema de cultura através do tubo de "linha arterial" (Figura 2). Preste atenção ao display e procure um sinal cardióide pulsátil de 60 pulsos/min de amplitude constante. Neste ponto, a pressão média está entre 0-10 mm Hg. Se a pressão for < 0 e a coluna esvaziar progressivamente, procure um vazamento (colateral da veia ou vedação inadequada entre a veia e o tubo).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Defina a pressão mínima para 6 mm Hg para um teste venoso ou 90 mm Hg para um teste arterial. Nessas condições, um injetor de ar aplica a pressão necessária à coluna e ao sistema.</li>
	<li>Troque o meio a cada 2 dias usando o tubo conectado à coluna de pressão. Para evitar danos por mudança de pressão, abra primeiro o plugue da coluna.</li>
</ol>
5. Conclusão da Perfusão
<ol>
	<li>Após 3 ou 7 dias de perfusão: retire a EVPS da incubadora e desmonte as veias. Descarte as extremidades das veias proximal e distal de 5 mm fixadas ao equipamento. Corte um anel central de 5 mm de espessura do segmento restante e fixe em formalina (morfometria). Congelar os fragmentos restantes e reduzi-los a pó para análises moleculares posteriores.</li>
</ol>

<ol><li>Sal Go, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Executive+summary%3A+heart+disease+and+stroke+statistics--2014+update%3A+a+report+from+the+american+heart+association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Executive summary: heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the american heart association.</a> Circulation. 129, 399-410 (2014).</li>
<li>Sal Conte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Results+of+PREVENT+III%3A+a+multicenter%2C+randomized+trial+of+edifoligide+for+the+prevention+of+vein+graft+failure+in+lower+extremity+bypass+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Results of PREVENT III: a multicenter, randomized trial of edifoligide for the prevention of vein graft failure in lower extremity bypass surgery.</a> Journal of Vascular Surgery. 43, 742-751 (2006).</li>
<li>Yu, P., Nguyen, B. T., Tao, M., Bai, Y., Ozaki, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+vein+graft+hemodynamic+manipulations+to+enhance+experimental+utility%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Mouse vein graft hemodynamic manipulations to enhance experimental utility.</a> The American Journal of Pathology. 178, 2910-2919 (2011).</li>
<li>Davies, M. G., Hagen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprinted+article+%26%2334%3BPathophysiology+of+vein+graft+failure%3A+a+review%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+vascular+and+endovascular+surgery+%3A+the+official+journal+of+the+European+Society+for+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Reprinted article &#34;Pathophysiology of vein graft failure: a review&#34;.</a> European journal of vascular and endovascular surgery : the official journal of the European Society for Vascular Surgery. 42, Suppl 1. S19-S29 (2011).</li>
<li>Berard, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+hemodynamic+forces+in+the+ex+vivo+arterialization+of+human+saphenous+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Role of hemodynamic forces in the ex vivo arterialization of human saphenous veins.</a> Journal of Vascular Surgery. 57, 1371-1382 (2013).</li>
<li>Vijayan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+reduction+of+medial+and+intimal+thickening+in+porcine+saphenous+vein+grafts+with+a+polyglactin+biodegradable+external+sheath%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Long-term reduction of medial and intimal thickening in porcine saphenous vein grafts with a polyglactin biodegradable external sheath.</a> Journal of Vascular Surgery. 40, 1011-1019 (2004).</li>
<li>Jeremy, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+biology+of+saphenous+vein+grafts+fitted+with+external+synthetic+sheaths+and+stents%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">On the biology of saphenous vein grafts fitted with external synthetic sheaths and stents.</a> Biomaterials. 28, 895-908 (2007).</li>
<li>Zilla, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constrictive+external+nitinol+meshes+inhibit+vein+graft+intimal+hyperplasia+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Constrictive external nitinol meshes inhibit vein graft intimal hyperplasia in nonhuman primates.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136, 717-725 (2008).</li>
<li>Zilla, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+shape+memory+in+external+vein-graft+meshes+allows+extreme+diameter+constriction+for+suppressing+intimal+hyperplasia%3A+a+non-human+primate+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Utilization of shape memory in external vein-graft meshes allows extreme diameter constriction for suppressing intimal hyperplasia: a non-human primate study.</a> Journal of Vascular Surgery. 49, 1532-1542 (2009).</li>
<li>Yeoman, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+constitutive+model+for+the+warp-weft+coupled+non-linear+behavior+of+knitted+biomedical+textiles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A constitutive model for the warp-weft coupled non-linear behavior of knitted biomedical textiles.</a> Biomaterials. 31, 8484-8493 (2010).</li>
<li>Longchamp, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+external+mesh+reinforcement+to+reduce+intimal+hyperplasia+and+preserve+the+structure+of+human+saphenous+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of external mesh reinforcement to reduce intimal hyperplasia and preserve the structure of human saphenous veins.</a> Biomaterials. 35, 2588-2599 (2014).</li>
<li>Saucy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+pulsatile+perfusion+of+human+saphenous+veins+induces+intimal+hyperplasia+and+increased+levels+of+the+plasminogen+activator+inhibitor+1%5BTitle%5D)+AND+%22European+Surgical+Research.+Europaische+Chirurgische+Forschung.+Recherches+Chirurgicales+Europeennes%22%5BJournal%5D)">Ex vivo pulsatile perfusion of human saphenous veins induces intimal hyperplasia and increased levels of the plasminogen activator inhibitor 1.</a> European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 45, 50-59 (2010).</li>
<li>Dubuis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atorvastatin-loaded+hydrogel+affects+the+smooth+muscle+cells+of+human+veins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pharmacology+and+experimental%22%5BJournal%5D)">Atorvastatin-loaded hydrogel affects the smooth muscle cells of human veins.</a> The Journal of pharmacology and experimental. 347, 574-581 (2013).</li>
<li>Deglise, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+connexin43+expression+in+human+saphenous+veins+in+culture+is+associated+with+intimal+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Increased connexin43 expression in human saphenous veins in culture is associated with intimal hyperplasia.</a> Journal of Vascular Surgery. 41, 1043-1052 (2005).</li>
<li>Muto, A., Model, L., Ziegler, K., Eghbalieh, S. D., Dardik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+vein+graft+adaptation+to+the+arterial+circulation%3A+insights+into+the+neointimal+algorithm+and+management+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Journal+%3A+Official+Journal+of+the+Japanese+Circulation+Society%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of vein graft adaptation to the arterial circulation: insights into the neointimal algorithm and management strategies.</a> Circulation Journal : Official Journal of the Japanese Circulation Society. 74, 1501-1512 (2010).</li>
<li>Tao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+murine+intimal+hyperplasia+model+founded+on+a+focal+carotid+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">A simplified murine intimal hyperplasia model founded on a focal carotid stenosis.</a> The American Journal of Pathology. 182, 277-287 (2013).</li>
<li>Berard, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salvage+treatment+for+venous+aneurysm+complicating+vascular+access+arteriovenous+fistula%3A+use+of+an+exoprosthesis+to+reinforce+the+vein+after+aneurysmorrhaphy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Vascular+and+Endovascular+Surgery+%3A+the+Official+Journal+of+the+European+Society+for+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Salvage treatment for venous aneurysm complicating vascular access arteriovenous fistula: use of an exoprosthesis to reinforce the vein after aneurysmorrhaphy.</a> European Journal of Vascular and Endovascular Surgery : the Official Journal of the European Society for Vascular Surgery. 40, 100-106 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este estudo revela um sistema de perfusão venosa ex vivo (EVPS) para realizar extensos estudos hemodinâmicos em veias humanas. Este sistema permite a perfusão das veias safenas sob parâmetros hemodinâmicos definidos na ausência de fatores inflamatórios e de crescimento agravantes liberados pelas células circulantes in vivo. Assim, proporciona uma melhor compreensão das vias subjacentes envolvidas no controle da HI em enxertos de veias humanas5,11,12,15.
As perturba...

As doenças cardiovasculares são a principal causa de morbidade e mortalidade nos países ocidentais1. Apesar dos avanços nos tratamentos endovasculares, a cirurgia de bypass continua sendo a base das terapias contemporâneas, portanto, mais de meio milhão de enxertos de veias são realizados anualmente nos Estados Unidos. No entanto, apesar de décadas de pesquisa, 30-60% dos enxertos de veias de membros inferiores falham nos primeiros anos devido à hiperplasia intimal (HI)2. Forças mecânicas, particularmente baixa tensão de cisalhamento (SS) e alta tensão na parede, são fundamentais no início e desenvolvimento dessa resposta hiperplásica3,4. Para resolver essa questão, um sistema de perfusão de veias ex vivo (EVPS) foi gerado para estudar, sob condições hemodinâmicas estritamente controladas (pressão e estresse de cisalhamento), o comportamento de veias safenas humanas. Neste estudo, após a inserção na circulação arterial, a pressão elevada (média = 100 mmHg) foi suficiente para estimular a proliferação e migração de células musculares lisas para a camada íntima (HI)5.
Estudos em mamíferos sugeriram o uso de reforço externo como um método eficiente para apoiar a "veia arterializada" e neutralizar as alterações hemodinâmicas agudas que a veia enfrenta uma vez implantada em um meio arterial. A tela evitou a distensão excessiva, aumentou a tensão de cisalhamento e reduziu a tensão da parede e, consequentemente, a HI6-10. No entanto, os mecanismos subjacentes e sua aplicabilidade às veias humanas na melhoria da permeabilidade do bypass não foram totalmente caracterizados. Nossa EVPS foi usada para comparar, na condição que mimetiza as alterações que uma veia enfrenta uma vez inserida em um regime arterial (alta tensão e pressão de cisalhamento), o comportamento das veias safenas humanas na ausência e presença de uma tela tubular externa de poliéster macroporoso. Ao prevenir o remodelamento patológico e a HI, a tela forneceu evidências de sua potencial eficiência clínica11.
Este estudo 1) apresenta um modelo de perfusão de veias safenas humanas ex vivo sob pressão controlada e estresse de cisalhamento 2) demonstra que a malha externa de poliéster macroporoso reduz a HI e fornece informações cruciais para sua potencial aplicação clínica.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 - Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina/Fungizone</td><td>Bioconcept</td><td>4-02F00-H</td><td></td></tr><tr><td>Dextrano de Leuconostoc spp. 500 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>Tampão PBS CHUV pH 7,1-7,3 1 L</td><td>Laboratorium und Grosse Apotheke Dr. G. Bichsel AG</td><td>100 0 324 00</td><td></td></tr><tr><td>Meio de inclusão de crioseccionamento - Tissue-Tek OCT Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Silicone (Peróxido) L/S 16 (96400-16 ) - 7,5 m</td><td>Idex Health & Science GMBH</td><td>MF0037ST</td><td></td></tr><tr><td>Y-splitter&nbsp;</td><td>Idex Saúde & Science GMBH</td><td>Conector</td><td></td>Y</tr><tr><td>35 mm Placa de cultura</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430165-100EA</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tubo Falcon</td><td>BD Bioscence</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubo Falcon</td><td>BD Bioscence</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de engrenagem - Reglo-Z</td><td>Idex Health & Science GMBH</td><td>SM 895</td><td>&nbsp; App-Nr 03736-00194</td></tr><tr><td>Cabeça da Bomba</td><td>Idex Health & Ciência GMBH</td><td>MI0008&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Monitoramento TRANSPAC IV</td><td>icumedical</td><td>011-0J736-01</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de 20 ml</td><td>B. Braun Medical SA</td><td>4612041-02</td><td></td></tr><tr><td>Etibon 3-0 FS-2</td><td>Ethicon- Johnson& Johnson</td><td>EH7346H</td><td></td></tr><tr><td>Mesh ProVena 6-8mm</td><td>B. Braun Medical SA</td><td>1105012-14</td><td></td></tr><tr><td>NaCl: Perfusão da solução de cloreto de sódio 0,9% (100 ml)</td><td>B. Braun Medical SA</td><td>534534</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Standard Drive</td><td>Cole-Parmer Instrument Co</td><td>7521-10</td><td></td></tr><tr><td>Cartão de aquisição</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6024 E</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de vazão módulo</td><td>Transonic Systems Inc.</td><td>TS410 e T402</td><td></td></tr><tr><td>Torneira com 3 vias</td><td>BD Connexta Luerlock</td><td>394600</td><td></td></tr><tr><td>Millex Filtro</td><td>Milian</td><td>SE2M229I04</td><td></td></tr></tbody></table>

procedimento para safenas humanas veias ex vivo perfusão e reforço externo

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

A base das terapias contemporâneas para doença arterial oclusiva extensa é a cirurgia de revascularização venosa. No entanto, sua durabilidade é ameaçada pela hiperplasia intimal (HI) que eventualmente leva à oclusão do vaso e à falha do enxerto. Acredita-se que as forças mecânicas, particularmente a baixa tensão de cisalhamento e a alta tensão da parede, iniciem e sustentem essas mudanças celulares e moleculares, mas sua contribuição exata ainda precisa ser desvendada. Para avaliar seletivamente o papel da pressão e do estresse de cisalhamento na biologia da HI, um sistema de perfusão ex vivo (EVPS) foi criado para perfundir segmentos de veias safenas humanas sob regime arterial (alta tensão de cisalhamento e alta pressão). Outras inovações técnicas permitiram a perfusão simultânea de dois segmentos da mesma veia, um reforçado com uma malha externa. As veias foram colhidas usando uma técnica sem toque e imediatamente transferidas para o laboratório para montagem na EVPS. Um segmento da veia recém-isolada não foi perfundido (controle, dia 0). Os outros dois segmentos foram perfundidos por até 7 dias, sendo um deles completamente abrigado com uma tela externa de 4 mm (diâmetro). A pressão, a velocidade do fluxo e a frequência de pulso foram continuamente monitoradas e ajustadas para mimetizar as condições hemodinâmicas predominantes na artéria femoral. Após o término da perfusão, as veias foram desmontadas e utilizadas para análise histológica e molecular. Em condições ex vivo, a perfusão de alta pressão (arterial, média = 100 mm Hg) é suficiente para gerar HI e remodelação das veias humanas. Essas alterações são reduzidas na presença de uma malha externa de poliéster.

O EVPS fornece uma ferramenta valiosa para avaliar independentemente as forças hemodinâmicas sobre o remodelamento e a IH dos enxertos de veia safena humana.
Figura 1 mostra a câmara de perfusão e o suporte para veia. Nas Figuras 1A e B, o suporte para veia é apresentado antes (Figura 1A) e depois (Figura 1B) da montagem, respectivamente. Ele é composto (de cima para baixo) por um tubo liso de aço inoxidável c...

Os mecanismos que levam ao desenvolvimento de hiperplasia intimal (HI) e falha do enxerto venoso ainda são pouco compreendidos. Este estudo descreve um sistema ex vivo para perfundir veias humanas sob fluxo e pressão controlados. Além disso, avaliou-se a eficiência do reforço da malha externa para limitar o desenvolvimento de IH.

Procedimento para safenas humanas Veias Ex Vivo Perfusão e reforço externo

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar a influência da pressão, estresse puro e reforço externo na hiperplasia intimal humana. Isso é obtido pela perfusão simultânea de alta pressão de dois segmentos da mesma veia. Enquanto um segmento é reforçado por uma malha externa, os segmentos da veia são então cortados em seções para análise histológica e molecular.Essas análises são usadas para avaliar o efeito de um reforço externo na hiperplasia intimal. Os resultados mostram que um reforço externo pode reduzir a hiperplasia intimal que normalmente é observada após sete dias de perfusão. A cirurgia de revascularização do miocárdio de Seno van é um dos tratamentos de escolha em pacientes que sofrem de doença arterial periférica.No entanto, o desenvolvimento de hiperplasia t que leva à falha do enxerto é o principal fator limitante em tais ofícios. Essa remodelação se deve à adaptação da van ao ambiente arterial para o desenvolvimento de novas terapias. A compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos nesse fenômeno é essencial.Portanto, desenvolvemos um modelo ex vivo de perfusão. Uma das principais vantagens do nosso sistema é que ele permite o estudo de parâmetros hemodinâmicos sem outros fatores imunológicos ou endócrinos de confusão. Um estudante de doutorado em MD do nosso laboratório demonstrará a técnica.Amostras de veias humanas são obtidas de pacientes submetidos à cirurgia de revascularização do miocárdio. A veia é coletada e levada ao laboratório em condições estéreis e colocada sob uma capela de fluxo laminar. O tamanho mínimo dessas veias é de nove centímetros de comprimento.O diâmetro interno está acima de 2,5 milímetros e o diâmetro externo acima de quatro milímetros. A veia é dividida em três. Mesmo os segmentos das veias colhidas são armazenados em meio RPMI 1640 glut max gelado suplementado com 12,5% FBS enxágue um segmento em PBS.É o controle dividido novamente em três partes. Fixe uma parte na Formina para morfo e congele as outras duas partes para análise molecular. O EVPS deve ser feito de material à prova d'água que não lixivie produtos químicos como polimetilacrílico, metilpolioxietileno e aço.A câmara de perfusão deve ter pelo menos 2,5 centímetros de profundidade para flexão e dilatação mínimas do vaso e fácil troca de meios. O suporte da veia é uma haste de aço conectada a acessórios em forma de L de cima para baixo. Os dutos de conexão na coluna de pressão permitem ajustes de pressão de entrada e saída para a veia e mudança de mídia para determinar a direção normal do fluxo.Os dois segmentos restantes para perfusão são injetados suavemente com meio. Se o segmento tiver válvulas, o fluxo será mais lento. A veia deve ser invertida no EVPS para que as válvulas não impeçam o fluxo.Conecte a veia aos dois cilindros metálicos. Uma ponta de cada vez. Prenda os cilindros com Vicryl três oh ao redor das reentrâncias usando um nó apertado.Em seguida, transfira a veia para a câmara de perfusão carregada com meios. Para o terceiro segmento de veia, prenda uma extremidade da veia ao cilindro conforme mostrado anteriormente. Em seguida, deslize suavemente a malha na veia.Em seguida, prenda a malha e a veia no cilindro com suturas. Por fim, ajuste o comprimento da malha e prenda a outra extremidade da veia e a malha ao cilindro. Mova o conjunto para a segunda câmara de perfusão.O EVPS é montado em um circuito fechado com tubulação de silicone. Conecte cada cilindro de saída a um divisor Y usando um segmento de tubulação de silício tratada com peróxido. Faça o mesmo para cada cilindro de metal de entrada.Em seguida, conecte o divisor de saída a um segundo divisor Y. A partir deste divisor Y. Conecte uma saída ao tubo conectado ao transdutor de pressão e, para conectar a outra saída à coluna de pressão, use um tubo de um metro para conectar a coluna de pressão à bomba.Conclua a configuração conectando a bomba ao divisor de entrada y. Com outro metro de tubulação, conecte os tubos restantes à coluna de pressão. O duto mais baixo serve para troca de mídia.Depois de montar o EVPS, preencha a coluna com meio a logo abaixo do duto de saída da veia. Agora, mova o sistema para a incubadora, que é ajustada para 37 graus Celsius usando dióxido de carbono. Mantenha o pH constante em 7,4 fora da incubadora.Conecte as cabeças de engrenagem da bomba ao acionamento da engrenagem para monitorar a pressão. Conecte a saída de pressão do EVPS ao transdutor de pressão. Verifique se o tubo está totalmente cheio e sem bolhas.Um sinal cardio ital de pulsos a 60 pulsos por minuto com amplitude constante é configurado por meio do software de computador, que pilota independentemente a bomba de engrenagem. O fluxo resultante é de cerca de 160 mililitros por minuto. A pressão é configurada e regulada independentemente por uma bomba centrífuga em série com um regulador de pressão ajustável controlado pelo computador.Após três a sete dias, termine a perfusão para cada segmento perfundido. Remova cinco milímetros de cada extremidade para descartar a parte ligada das veias. Em seguida, corte um anel de cinco milímetros para fixação da seção central da veia.Congelar os fragmentos restantes para análise molecular. Incorpore o terceiro segmento na formina para histologia e análise molecular. Após sete dias de perfusão de alta pressão, cortes de veias foram preparados para análise histológica.Para todas as condições, a coloração h e e revelou núcleos de células endoteliais que revestem o lúmen e núcleos de SMCs na camada média. Quando o tecido foi corado com gel V para visualização de elastina, as veias perfundidas mostraram espessamento da íntima, patológico, remodelação externa e afinamento da mídia foi aparente. A coloração de tricomas de Masson mostra que apenas uma das três camadas musculares persistiu células musculares lisas acumuladas na camada interna.Em contraste, o reforço externo da veia preservou a distribuição do SMC e a estrutura do meio Esta técnica requer trabalhar sob sepse rigorosa. Uma vez dominado, pode ser executado em menos de duas horas usando este sistema. Outras condições, como fluxo turbulento, podem ser testadas para responder a perguntas adicionais, como a eficiência da armadura da malha em fluxo não lanar.

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