Name: Amostragem do solo e isolamento de nematóides entomopatogênicos (Steinernematidae, Heterorhabditidae) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Aprenda técnicas de amostragem do solo e isolamento de nematóides entomopatogênicos usando iscas de insetos e armadilha de White modificada. Estes métodos permitem estabelecer culturas laboratoriais para bioensaios futuros.

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Os autores gostariam de agradecer aos membros anteriores do Banco de laboratório: Sam-Kyu Kim, Kathryn Plichta e Victoria Miranda-Thompson por suas contribuições para a melhoria de muitos destes protocolos. Agradecemos o apoio da National Science Foundation (subvenções IOS-0840932 e IOS-0724978) a SP estoque.

1. Coleta de Amostras de solo <ol><li> Considere que cobre uma área mínima de 2 - 4 m 2 para cada local de amostragem. </li><li> Recolha de amostras de solo a uma profundidade de pelo menos 15 cm (Figura 4). </li><li> Tome pelo menos 5 amostras aleatórias dentro desta área. </li><li> Tome 3 subamostras por amostra. Dependendo do objetivo do estudo, ou combinar as subamostras ou mantê-los separados. </li><li> Coloque cada amostra em um saco plástico. Considere duplo ensacamento para evitar vazamento de amostras (Figura 4). </li><li> Amostras de etiquetas com um marcador à prova d&#39;água. Inclua as seguintes informações de cada local de amostragem: informações do site (incluindo localidade / área / nome do site e GPS coordenar informações), data, habitat, a vegetação associada, temperatura, altitude, etc NOTA: Se for o caso, recolher e / ou registrar a presença de insetos e outros invertebrados coletados com a amostra para posterior identificação. Eles podem representar potencial naturhospedeiros al EPN. </li><li> Ferramentas de recolha limpos entre as amostras mediante a lavagem com água e / ou desinfectar as com etanol a 70% ou solução de lixívia a 0,5%. </li><li> Manter as amostras em um refrigerador (8 - 15 ° C) durante o transporte para o laboratório. </li><li> Pegue uma porção da amostra de solo para análise para obter informações sobre a composição do solo, textura, umidade, condutividade elétrica ou outros parâmetros do solo desejados. </li></ol> . 2 Isolamento Nematóides de amostras de solo: Técnica do Inseto-baiting <ol><li> Remova todos os detritos (ie., Rochas, pedaços de madeira ou casca, folhas, etc.), Coletados com suas amostras para evitar a contaminação com microorganismos saprobic. </li><li> Adicionar água para umedecer o solo e facilitar a circulação de nematóides. NOTA: Use um frasco de spray para aumentar lentamente o nível de umidade do solo. </li><li> Colocar aproximadamente 200 a 250 ml de solo húmido num recipiente de plástico limpo com uma tampa. </li><li> Adicionar iscas de insetos. Considere 5 a 10 insectos para a superfície do solo de cada amostra (Figura 5). </li><li> Cobrir o recipiente com tampa e ligar recipientes de cabeça para baixo. </li><li> Manter recipientes no escuro e à temperatura ambiente (normalmente 22-25 ° C). </li><li> Verifique os recipientes a cada 2 - 3 dias, e remover insetos mortos. NOTA: adicionar insetos saudáveis ​​adicionais para cada recipiente para posterior baiting da amostra de solo. </li><li> Remover insetos mortos dos recipientes. NOTA: Cadáveres com um marrom ou ocre coloração geralmente são parasitados por steinernematids, enquanto tijolo vermelho para cadáveres roxo escuro são parasitados por heterorhabditids. </li><li> Enxágüe cadáveres em água estéril. </li><li> Coloque cadáveres em uma armadilha Branco modificado para recuperação de nematóide progênie (ver procedimento abaixo). </li></ol> . 3 Nematode recuperação de cadáveres infectados: Modificado Armadilha Branco <ol><li> Coloque a parte superior de um diâmetro 50 (ou 60) mm. Placa de Petri dentro de um prato grande (100 mm). </li><li> Definir um pecadopapel de filtro circular gle (Whatman # 1) no interior do prato menor. </li><li> Coloque cadáveres sobre o papel de filtro do prato menor certificando-se de cadáveres não se tocam para evitar qualquer contaminação. </li><li> Encha o exterior (maior) placa de Petri com ca. 20 ml de água destilada estéril. Não adicionar água no prato que contém os cadáveres. </li><li> Cobrir a grande placa de Petri e seu conteúdo, com a tampa (Figura 6). </li><li> Rotular pratos de acordo. Adicione as seguintes informações: Nome do Nemátodo (espécie / isolado), a data de infecção (infecção data foi definida) e data armadilha (esta é a data em que a armadilha está configurado). </li><li> Mantenha a armadilha RT até a emergência dos estágios juvenis infectantes (IJS) ocorre. Este processo pode levar entre 10 - 25 dias, dependendo da espécie e / ou tensão considerado nematóides. </li><li> Colheita de água com IJs removendo o maior prato da armadilha e despejar água com nematóides para um copo. </li><li> Permitir nemátodos decantar para a parte inferior da bEaker. Este processo pode demorar alguns minutos. </li><li> Despeje água cuidadosamente, certificando-se de nematóides permanecem no fundo do copo. </li><li> Lavar nematóides, adicionando mais água e permitindo que os nemátodos para decantar. Este passo pode ser repetido 2-3 vezes, até que a água é limpa. </li><li> Colocar a suspensão de nemátodos num balão de cultura de tecidos (250 ml). Manter a concentração da suspensão a 1.000 - 3.000 nemátodos / ml. </li><li> Frasco loja com suspensão de nematóides em uma sala fria ou em estufa entre 10-20 ° C. NOTA: verifique frascos armazenados periodicamente como a vida de prateleira de EPN é variável. Normalmente steinernematids pode ser armazenado por 6-12 meses, sem a necessidade de subcultura, enquanto heterorhabditids pode exigir mais check-ups periódicos. </li></ol>

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<li>White, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+obtaining+infective+nematode+larvae+from+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A method for obtaining infective nematode larvae from cultures.</a> Science. 66, 302-303 (1927).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Esta demonstração é a primeira de duas apresentações que descrevem um número de técnicas que são comummente usados ​​para estudar EPN e suas bactérias simbióticas. Estas técnicas representam passos fundamentais para o sucesso da criação culturas EPN em laboratório e também servir de base para outros bioensaios que empregam EPN como organismos modelo para a pesquisa. Vários levantamentos de solos de EPN têm mostrado que a sua abundância e distribuição pode variar entre estações, habitats e re...

Muitos nematóides estão associados com insetos, e suas interações hospedeiro variam de benéfico para prejudicial. Aqui, vamos nos concentrar em um grupo de nematóides que são patógenos de insetos, também conhecido como nematóides entomopatogênicos (ou EPN). Duas famílias de nematóides pertencem a este grupo de nematóides: Steinernematidae e Heterorhabditidae 11,13. O seu efeito patogênico é de fato conferida pela sua interação com anaeróbios facultativos bactérias entéricas (bactérias Xenorhabdus associar steinernematids e bactérias Photorhabdus associar heterorhabditids) 2. As bactérias são vetorizado de um hospedeiro a outro por insetos a única fase livre nematóide de vida, a terceira fase juvenil infecciosa (também conhecida como juvenil Dauer, juvenil infecciosa ou IJ), que vive no solo. Uma vez dentro do inseto, os nematóides liberar as bactérias na hemolinfa do inseto, que matam o inseto hospedeiro por septicemia maciça. As bactérias tambémdegradam os tecidos do insecto e se tornar fonte de alimento dos nematóides, permitindo-lhes a amadurecer e multiplicar. Normalmente, uma ou duas gerações de nematóides adultos são produzidos dentro do cadáver do inseto. A progênie dos últimos reassociates geração de adultos com algumas células bacterianas em um mais especializar maneira que sua relação nutricional anterior e cultivar essas células em seus intestinos que se deslocam para fora do inseto carcaça no solo onde irão aguardar outro inseto parasitar 6,11,14 (Figura 1). Desde sua descoberta em 1927, EPN foram consideradas alternativas valiosas para pesticidas químicos como eles podem parasitar uma grande variedade de insetos que são pragas agrícolas 3,4,5. No entanto, ao longo das últimas duas décadas, esses nematóides e suas bactérias simbióticas ter sido reconhecido como um sistema modelo para o estudo de aspectos maleável biológicos, ecológicos e evolutivos de host-micróbio interactions 14. O objetivo desta apresentação é mostrar os métodos e técnicas mais comumente utilizadas para a amostragem do solo e isolamento de EPN. Uma variedade de ferramentas está disponível e pode ser usado para a coleta de amostras de solo, incluindo: corers solo, espátulas, escavadoras pós-buracos, brocas, tubos de amostragem, pás de mão, entre outros (Figura 2). Dependendo do objectivo do estudo, duas estratégias de amostragem pode ser considerada: a) estratificado, b) amostragem (Figura 3). A amostragem estratificada é normalmente usado como parte de um estudo intensivo de uma área específica ou demarcada sobre um dado período de tempo. Em geral, uma seção transversal é demarcado e amostras de solo são tomadas a intervalos previstos na transecção ao longo de um período de tempo (Figura 3A) 15. A amostragem aleatória é geralmente empregada quando o foco em uma área extensa. Esta estratégia de amostragem foi usado para estudar a diversidade de EPN fesde uma grande área geográfica ou região (Figura 3B) 12. Uma série de fatores podem ser considerados, dependendo do foco do estudo, incluindo uma grande variedade de elevações, texturas de solo e habitats (por exemplo., Campos cultivados, florestas, pastos, parques, praias, matas ciliares, etc.) Mostramos a técnica de atracção de insectos, que foi originalmente descrito por Bedding e Akhurst 1 e representa uma alternativa simples e selectiva para a recuperação a partir de amostras de solo de EPN. Este é um processo selectiva que é baseado na premissa de que os nemátodos (estádio IJ) será atraído para uma série de insectos e que parasitam. Esta técnica também pode ser considerada para o isolamento de outros agentes patogénicos de insectos, tais como fungos, bactérias e 8,10. Também demonstramos a técnica armadilha branco modificado que é utilizado para a recuperação de nemátodo progenitura de hospedeiros infectados insectos 7,14. Este é um esforço method que oferece a vantagem de recuperar uma &quot;limpa&quot; nematóide progênie livre de restos de cadáveres de insetos degradantes. Finalmente, as técnicas descritas e mostradas neste artigo correspondem aos concebido e / ou realizados no nosso laboratório, bem como os descritos por vários colegas e colaboradores.

<table><tbody><tr><td>Galleria mellonella</td><td>Timberline</td><td>http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG</td><td>Para técnica de isca de insetos</td></tr><tr><td>Papel de filtro, 55 mm Grau 1 Celulose</td><td>Whatman/VWR</td><td>28450-048</td><td>Conjunto de câmara de infecção e armadilha branca</td></tr><tr><td>60 x 15 mm Placas de Petri</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td>Câmara de infecção e conjunto de armadilha branca</td></tr><tr><td>Placas de Petri de 100 x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>Câmara de infecção e conjunto de armadilha branca</td></tr><tr><td>Sacos de plástico ZIPloc</td><td>Ace Hardware ou loja</td><td></td> de ferragens local <td>Amostragem de solo</td></tr><tr><td>Pipetador mecânico P1000, P200 ml</td><td>VWR</td><td>89130-562; 89130-566&nbsp;</td><td>Câmara de infecção e conjunto de armadilha branca</td></tr><tr><td>Pontas de pipetor 1000ml, 200 ml</td><td>VWR</td><td>16466-004 ; 53510</td><td>Câmara de infecção e conjunto de armadilha branca</td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Ace Hardware ou loja</td><td></td> de ferragens local <td>Amostragem de solo , desinfecção</td></tr><tr><td>Hipoclorito de sódio</td><td>Ace Hardware ou loja</td><td></td> de ferragens local <td>Amostragem de solo , desinfecção</td></tr><tr><td>70% Etyl alochol</td><td>AAPER</td><td>17212945</td><td>Amostragem de solo , desinfecção</td></tr><tr><td>Pás</td><td>Ace Hardware ou loja de ferragens local</td><td>N/A</td><td>Amostragem de solo</td></tr><tr><td>Amostrador de solo tubular</td><td>Accuproducts</td><td></td><td>Amostragem de solo</td></tr><tr><td>Sonda de solo, cabo longo</td><td>Nupla&nbsp;</td><td>PRB4T 69401 Amostragem de</td><td>solo</td>clássica</tr><tr><td>Fita métrica</td><td>Ace Hardware ou loja</td><td></td> de ferragens local <td>Amostragem de solo</td></tr><tr><td>Fita de sinalização, várias cores</td><td>Ace Hardware ou loja</td><td></td> de ferragens local <td>Amostragem de solo</td></tr><tr><td>Frascos de cultura de tecidos</td><td>VWR</td><td>Falcon, 29185-304&nbsp;</td><td>Armadilha branca, coleção de EPN</td></tr><tr><td>Frascos de polietileno de boca larga</td><td>VWR</td><td>16650-107</td><td>Sifão branco, coleção de EPN</td></tr></tbody></table>

amostragem do solo e isolamento de nematóides entomopatogênicos (steinernematidae, heterorhabditidae)

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Nematóides entomopatogênicos (aka EPN) representam um grupo de nematóides que vivem no solo que parasitam uma grande variedade de insetos. Esses nematóides pertencem a duas famílias: Steinernematidae e Heterorhabditidae. Até agora, mais de 70 espécies já foram descritas no Steinernematidae e existem cerca de 20 espécies no Heterorhabditidae. Os nematóides têm uma parceria de mutualismo com bactérias Enterobacteriaceae e, juntos, eles agem como um complexo potente inseticida que mata uma grande variedade de espécies de insetos. Aqui, vamos nos concentrar nas técnicas mais comuns considerados para a recolha de EPN do solo. A segunda parte desta apresentação centra-se na técnica de atracção de insectos, uma abordagem amplamente utilizada para o isolamento de EPN de amostras de solo, e a técnica de armadilha branco modificado, que é utilizado para a recuperação destes nematóides de insectos infectadas. Estes métodos e técnicas são passos fundamentais para o sucesso da criação EPN cultUres em laboratório e também servir de base para outros bioensaios que consideram estes nematóides como organismos modelo para a pesquisa em outras disciplinas biológicas. As técnicas indicadas nesta apresentação correspondem às realizadas e / ou concebida por membros da SP laboratório, bem como os descritos por vários autores.

Coleta de Amostras de solo Em estágio Terceiro juvenis infectantes de EPN são os únicos estágios gratuitos de vida no ciclo de vida desses nematóides que residem no solo (Figura 1). Portanto, a recolha de amostras de solo é um método muito eficiente para recuperar estes nemátodos. Figura 4 mostra um perfil de solo que indica a profundidade a que devem ser recolhidas amostras. Preservar a umidade de uma amostra é um fator chave para a sobrevivência dos nemató...

Nematóides entomopatogênicos são vermes que vivem no solo que parasitam uma grande variedade de insetos. Demonstramos métodos de amostragem utilizados para o isolamento destes nematóides do solo utilizando duas técnicas: a iscagem inseto ea armadilha Branco modificado, para a recuperação de nematóides de amostras de solo e cadáveres de insetos infectados, respectivamente.

Amostragem do solo e isolamento de nematóides entomopatogênicos (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

O objetivo deste procedimento é demonstrar os métodos e técnicas comumente usados para amostragem de solo e isolamento de nematóides enteropatogênicos. Isso é feito primeiro coletando amostras de solo por uma abordagem de transecto ou, conforme demonstrado, uma abordagem de amostragem aleatória. Em seguida, as amostras de solo diminuíram com insetos para recuperar seletivamente nematóides enteropatogênicos.A etapa final é coletar os nematóides de insetos infectados usando uma armadilha branca modificada. Em última análise, essas técnicas representam etapas fundamentais para o estabelecimento bem-sucedido de culturas de nematóides enteropatogênicos em laboratório e formam a base para bioensaios a jusante. A vantagem da técnica de amostragem de solo é que podemos ir a campo e coletar estágios maduros de nematóides patogênicos.Em vez de amostrar insetos infectados com esses nematóides, que raramente são encontrados. A estratégia de amostra aleatória que empregamos é comumente usada para avaliar a diversidade de nematóides patogênicos de uma grande região ou área geográfica. Esta técnica foi descrita pela primeira vez por apostas em Accur em 1975.É um procedimento seletivo baseado na p

soil-sampling-isolation-entomopathogenic-nematodes-steinernematidae

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O objetivo desta apresentação é demonstrar in vivo e in vitro técnicas para a criação de nematóides entomopatogênicos. Métodos in vivo consideram a criação destes nematóides com um inseto hospedeiro, enquanto que os métodos in vitro utilizam rico ágar.

In vivo e in vitro criação de Nematóides entomopatogênicos (Steinernematidae e Heterorhabditidae)

Aqui apresentamos um protocolo baseado no sistema de isca mealworm (Tenebrio molitor)-isca que foi utilizado para isolar e selecionar fungos entomopatômicos (EPF) a partir de amostras de solo. Uma fórmula eficaz de número de conidia (ECN) é usada para selecionar EPF tolerante ao alto estresse com base em características fisiológicas para controle microbiano de pragas no campo.

Isolamento e Seleção de Fungos Entomopatômicos de Amostras de Solo e Avaliação da Virulência Fúngica contra Pragas de Insetos

Este protocolo descreve um método para extrair eficientemente nematoides vivos de substratos naturais no campo.

Isolamento Rápido de Nematoides Selvagens por Baermann Funnel

Colônias fúngicas entomopatômicas são isoladas de amostras de solo tropical usando isca tenebrio , isca de Galleria , bem como meio artificial seletivo, ou seja, ágar de dextrose de batata enriquecido com extrato de levedura suplementado com clorofenicol, tiaabzolendae e ciclohexmida (meio CTC).

Comparação de métodos para isolar fungos entomopatômicos de amostras de solo

Este protocolo pode ser usado para realizar levantamentos ecológicos em larga escala de nematodes caenorhabditis autodes . A principal vantagem desse método é a eficiente organização e análise de dados ecológicos e moleculares associados aos nematoides coletados da natureza.

Uma abordagem altamente escalável para realizar pesquisas ecológicas de nematodes de caenorhabditis

Os nematoides entomopatômicos vivem em simbiose com bactérias e, juntos, infectam com sucesso insetos, minando seu sistema imunológico inato. Para promover pesquisas com base genética na infecção por nematoides, são descritos métodos de manutenção e manipulação genética de nematoides entomopatômicos.

Culturing e Geneticamente Manipulação Nematodes Entomopatômicos

Caenorhabditis elegans é uma das principais espécies modelo em biologia, mas quase todas as pesquisas são realizadas na ausência de seus micróbios naturalmente associados. Os métodos descritos aqui ajudarão a melhorar nossa compreensão da diversidade de micróbios associados como base para futuras pesquisas funcionais de C. elegans.

Isolamento e Caracterização da Microbiota Natural do Nematoide Modelo Caenorhabditis elegans

Apresentamos dois métodos para que agricultores propaguem em massa nematoides entomopatogênicos como bioinseticidas. O primeiro método utiliza gel de poliacrilamida como substrato de cultivo do nematoide, enquanto o segundo utiliza algodão revestido com polímero como substrato de cultivo. Ambos os métodos dependem da propagação in vivo de nematoides dentro de cadáveres de insetos.

Propagação In Vivo de Nematoides Entomopatogênicos Baseada em Cultivadores

Este método explica como construir e operar um contínuo de 13 C e 15 N isótopo câmara de rotulagem para a rotulagem tecido diferencial planta uniforme ou. Os resultados representativos de metabólica e rotulagem estrutural de gerardii Andropogon são discutidos.

Projeto e operação de uma contínua<sup&gt; 13</sup&gt; C e<sup&gt; 15</sup&gt; N Labeling Câmara de uniforme ou Diferencial, metabólica e estrutural, Fábrica de Marcação por Isótopo

Lysimetry campo e amostragem água intersticial permitem aos pesquisadores avaliar o destino dos produtos químicos aplicados aos solos e vegetação estabelecida. O objetivo deste protocolo é para demonstrar como instalar a instrumentação necessária e coletar amostras para análise química durante lysimetry campo integrado e experimentos de amostragem Porewater.

Integrado Campo Lysimetry e Porewater Amostragem para Avaliação de Química Mobilidade em Solos e Vegetação Fundada

Aprenda técnicas de amostragem do solo e isolamento de nematóides entomopatogênicos usando iscas de insetos e armadilha de White modificada. Estes métodos permitem estabelecer culturas laboratoriais para bioensaios futuros.

Amostragem do solo e isolamento de nematóides entomopatogênicos (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

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