Amostragem do solo e isolamento de nematóides entomopatogênicos (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

O objetivo deste procedimento é demonstrar os métodos e técnicas comumente usados para amostragem de solo e isolamento de nematóides enteropatogênicos. Isso é feito primeiro coletando amostras de solo por uma abordagem de transecto ou, conforme demonstrado, uma abordagem de amostragem aleatória. Em seguida, as amostras de solo diminuíram com insetos para recuperar seletivamente nematóides enteropatogênicos.

A etapa final é coletar os nematóides de insetos infectados usando uma armadilha branca modificada. Em última análise, essas técnicas representam etapas fundamentais para o estabelecimento bem-sucedido de culturas de nematóides enteropatogênicos em laboratório e formam a base para bioensaios a jusante. A vantagem da técnica de amostragem de solo é que podemos ir a campo e coletar estágios maduros de nematóides patogênicos.

Em vez de amostrar insetos infectados com esses nematóides, que raramente são encontrados. A estratégia de amostra aleatória que empregamos é comumente usada para avaliar a diversidade de nematóides patogênicos de uma grande região ou área geográfica. Esta técnica foi descrita pela primeira vez por apostas em Accur em 1975.

É um procedimento seletivo baseado na premissa de que os estágios de vida livre serão atraídos pelos hospedeiros insetos e os parasitarão. Demonstrando Os procedimentos serão Rue Orozco estudante de pós-graduação e técnico de pesquisa Ming Mingle em meu laboratório. Laboratório. O local de coleta de amostras deve ter uma área mínima de dois metros quadrados e, se possível, ser maior que quatro metros quadrados.

Para cada amostra de solo, pegue pelo menos três subamostras menores dentro da área de amostra MS a C. As subamostras podem ser combinadas se atenderem aos objetivos do estudo. Colete as amostras de solo em uma profundidade de zero a 15 centímetros.

Cada amostra deve ter de 250 gramas a um quilograma. Use calças CORAs de solo, pás manuais ou ferramentas semelhantes e colete em pelo menos cinco locais aleatórios dentro de cada área de amostragem selecionada. Cada amostra deve ser ensacada duas vezes e rotulada com um marcador à prova d'água.

O rótulo deve conter informações sobre o local, localização, elevação, data e variáveis ambientais, como descrição do habitat com vegetação associada e temperatura no local. Anote os insetos locais e outras espécies de invertebrados. Colete espécies que não podem ser identificadas imediatamente para identificação posterior no laboratório entre os locais de coleta, lave bem as ferramentas de coleta com água e desinfete-as com etanol a 70% ou alvejante a 0,5%.

Armazene as amostras de solo em um refrigerador de oito a 15 graus Celsius para transporte. CES separa uma parte da amostra para analisar as características brutas do solo, como sua composição, textura, condutividade e assim por diante. De cada amostra de solo, remova os detritos que podem levar à contaminação por micróbios seic.

Em seguida, umedeça o solo com água para que os nematóides possam se mover facilmente. Coloque 200 a 250 gramas de solo úmido em um recipiente de plástico com tampa. Em seguida, adicione iscas de insetos.

Cinco a 10 insetos serão suficientes. Coloque a tampa, vire o recipiente e coloque-o no escuro. Em temperatura ambiente a cada dois ou três dias, remova os insetos mortos e, conforme necessário, substitua-os por insetos saudáveis para peso adicional.

Se o cadáver do inseto for marrom ou ocre, isso sugere Stein e Nema parasitando parit. Considerando que, se o cadáver for vermelho tijolo a roxo escuro, antecipe hetero. Use uma armadilha branca modificada para coletar os nematóides que parasitaram as iscas de insetos.

Primeiro, coloque a tampa de uma placa de Petri de 50 ou 60 milímetros na base de uma placa de 100 milímetros. Em seguida, coloque uma folha de watman circular. Papel de filtro número um no prato menor.

Enxágue os cadáveres de insetos com água esterilizada e transfira-os para o papel de filtro. Espalhe-se para que eles não entrem em contato um com o outro. Encha apenas o prato maior com cerca de 20 mililitros de água destilada e cubra o conjunto com os pratos maiores. Tampa.

Rotule os pratos com o nome do nematóide, a data e a data da isca de insetos. A armadilha está montada. Mantenha as armadilhas em temperatura ambiente e monitore se há nematóides infecciosos juvenis ou IJs emergindo dos cadáveres de insetos.

Isso pode levar de 10 a 25 dias e depende da temperatura e do nível de umidade de onde a armadilha é mantida. Se o nível da água no purgador tiver evaporado, certifique-se de reabastecê-lo em placas com IJs. Colha a água do prato maior, que deve conter nematóides.

Deixe os nematóides afundarem por alguns minutos e, em seguida, decanta lentamente a água. Quando os nematóides permanecerem em um pequeno volume de água, enxágue-os mais algumas vezes adicionando água de volta e despejando-a com cuidado. Em seguida, faça diluições em série para estimar a população de nematóides.

Num balão de cultura de 250 ml, ajustar a concentração do nemátodo para entre um e 3000 nemátodos por mililitro. Armazene esta suspensão entre 10 e 20 graus Celsius. Geralmente na natureza, as chances de encontrar insetos parasitados por nematóides enteropatogênicos são muito baixas.

Assim, o protocolo delineado usando larvas de melanoma G como isca foi usado para isolar esses nematóides em uma taxa muito mais eficiente. Após cinco dias, os insetos estavam infectados e apresentavam coloração vermelha. Armadilhas brancas modificadas mostraram rastros de nematóides.

Após 15 dias dessas armadilhas, os nematóides coletados na água, tinham uma aparência limpa e estavam livres de tecidos de insetos. Um único ciclo de extração usando larvas de Melania de gálio pode ser insuficiente para recuperar todos os nematóides patogênicos de Oma que estão em uma amostra de solo. Portanto, recomendamos fazer isso várias vezes.

Além disso, aconselhamos os usuários a considerar outros insetos em vez de Galleria, o que também aumentará as chances de recuperação. O debate de amostras de solo com insetos é uma técnica que também pode ser considerada para o isolamento de outros patógenos de insetos, como bactérias ou fungos.