A identificação da proteína-proteína Locais de interacção Usando Peptide Arrays

O objetivo geral deste procedimento é mapear a interação entre duas proteínas ou domínios proteicos. Neste caso, os domínios de proteínas relacionadas ao câncer ainda e CHFR são estudados. O objetivo geral deste procedimento é mapear a interação entre duas proteínas ou domínios proteicos.

Neste caso, os domínios de proteínas relacionadas ao câncer ainda e CHFR são estudados. O segundo passo é incubar a matriz de peptídeos CHFR com seu parceiro de ligação, a proteína parada. Em seguida, a matriz é lavada e incubada com peroxidase de rabanete, anticorpo conjugado.

A matriz é então submetida à detecção de luminescência química para detectar a ligação. A etapa final é analisar os resultados e identificar os locais de ligação entre as proteínas. Este estudo abre caminho para o desenvolvimento de inibidores racionais da ligação ainda do CHFR, cuja interação descontrolada pode levar ao desenvolvimento de câncer.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave na pesquisa de interação de proteínas, como quais são as regiões específicas que meditam Uma interação entre duas proteínas, Divida a sequência da proteína alvo em 10 a 20 peptídeos residuais. Isso se sobrepõe parcialmente. A quantidade de sobreposição pode ser variada, mas, em princípio, quanto maior a sobreposição, melhor.

Ao projetar os peptídeos, leve em consideração os elementos de estrutura secundária conhecidos na proteína que podem ser responsáveis pela interação. A matriz de peptídeos projetada pode ser encomendada por meio de fornecedores comerciais. Para este experimento, os peptídeos dos resíduos do domínio CHFR 4 24 a 6 62 são ligados covalentemente à matriz através do terminal C.

Depois de receber a matriz projetada, prepare-a para o experimento bloqueando-a primeiro para evitar a associação não específica. Faça uma solução de bloqueio de 2,5% de peso por volume. Leite em pó desnatado em solução tampão tris contendo 0,05% Tween 20 ou TBST para evitar ligação inespecífica.

Mergulhe a matriz em cinco mililitros de solução de bloqueio. Incube a matriz por duas a quatro horas em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius em um shaker. Lave a matriz primeiro com cinco mililitros de solução de bloqueio por 30 segundos.

Em seguida, lave a matriz duas vezes com cinco mililitros de TBST por cinco minutos em uma coqueteleira em temperatura ambiente. Em seguida, incube a matriz lavada com cinco mililitros de solução de proteína marcada com poli-histidina contendo 2,5% de peso por volume. Leite em pó desnatado para evitar ligações inespecíficas.

Aqui, uma solução micromolar de 4,5 de resíduos de proteínas ainda 500 a seis 50 é usada. Em seguida, incube a matriz na solução de proteína por três a oito horas em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Após incubação na solução proteica.

Lave a matriz com cinco mililitros de TBST por 30 segundos em uma coqueteleira em temperatura ambiente, seguida de duas lavagens adicionais de cinco minutos. Agora incube a matriz lavada com cinco mililitros de anticorpo conjugado diluído de peroxidase de rabanete em um tampão de incubação que contenha os mesmos ingredientes nas mesmas concentrações da solução de bloqueio por uma hora em um agitador à temperatura ambiente, o anticorpo pode se ligar à proteína alvo ou à etiqueta, realizar experimentos de controle, testando a interação do anticorpo com peptídeos na matriz repetindo o mesmo protocolo em uma matriz separada deslize sem incubar com a proteína antes de ler as matrizes. Lave-os como antes com cinco mililitros de TBST.

Realize o desenvolvimento de quimioluminescência com um kit de substrato de western blotting de quimioluminescência aprimorado. Execute a detecção com um analisador de imagem luminescente, como uma câmera Fuji film LAS 3000. Analise os resultados, certificando-se de que ambas as duplicatas na matriz mostrem os mesmos sinais para que os resultados sejam confiáveis.

Se a estrutura do parceiro proteico for conhecida, procure na estrutura os peptídeos de ligação e procure os locais de ligação. Lembre-se de que os peptídeos que estão longe na sequência podem estar juntos na estrutura terciária e criar um local de ligação. Em nosso exemplo, ainda é uma proteína altamente importante do Centro Somal que controla a divisão celular normal e a proliferação celular ainda interage com várias proteínas através de sua região intrinsecamente desordenada.

Usando a matriz de peptídeos projetada, os locais de ligação ainda no supressor de tumor CHFR foram revelados. Cada ponto preto na matriz representa um peptídeo derivado de A-C-H-F-R que ainda observa que cada peptídeo aparece duas vezes, pois existe em duplicata, o que verifica a confiabilidade dos resultados. A triagem de matriz de peptídeos revelou sete peptídeos derivados de CHFR que se ligaram aos resíduos da região ainda intrinsecamente desordenada 500 a seis 50.

Esses resultados nos permitiram mapear o sítio de ligação de ainda no CHFR. Apesar da distância desses sete peptídeos na sequência primária do CHFR. Eles criam um sítio de ligação bem definido para ainda na estrutura terciária do CHFR.

Este método é aplicável para caracterizar todas as interações proteína-proteína Seguindo este procedimento. Métodos quantitativos como fluorescência e isótopo ou ITC devem ser usados para verificar, quantificar, a introdução do peptídeo.