Name: A identificação da proteína-proteína Locais de interacção Usando Peptide Arrays (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Aprenda a mapear interações proteína-proteína usando arrays de peptídeos com as proteínas still e CHFR. Este método de alta vazão identifica sítios de ligação para pesquisa em biologia do câncer.

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AF foi apoiado por uma bolsa a partir do Conselho Europeu de Investigação no âmbito do Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia (FP7 / 2007-2013) / acordo de subvenção CEI n ° 203413 e pelo Centro Minerva de Bio-híbrido systems.HA complexo e AI são suportadas pelo Dalia e Dan Maydan Fellowship para estudantes avançados de graduação na Universidade Hebraica de Jerusalém.

1. Criando uma matriz de Peptide <ol><li> Dividir a sequência da proteína alvo em parcialmente sobrepostos 10-20 resíduos péptidos. Variar a quantidade de sobreposição no experimento específico e os recursos do laboratório de realização, mas, em princípio, quanto mais tempo a sobreposição da melhor. Ao projetar os peptídeos ter em conta conhecidos elementos da estrutura secundária da proteína que pode ser responsável pela interação. </li><li> Encomende a matriz peptídeo projetado através de fornecedores comerciais. Aqui, o uso péptidos ligados covalentemente à matriz através do C-terminal. </li></ol> 2. Bloqueio de ligação não específica <ol><li> Adicione uma solução tampão 50 mM Tris ou fosfato contendo 0,05% de Tween 20 (TBST / PBST) e ajustar ao pH desejado com uma quantidade medida de HCl ou NaOH (para saber a força iónica preciso) e a força iónica desejada com NaCl . Aqui, usar um pH de 7,5 e uma força iónica de 150 mM. </li><li> Adicione uma solução de bloqueio de2,5% (w / v) de leite em pó desnatado em TBST / PBST. </li><li> Para impedir a ligação não específica, imergir a matriz em 5 ml de solução de bloqueio. Incubar a matriz durante 2-4 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C num agitador. </li></ol> 3. A incubação com a Proteína <ol><li> Lava-se a matriz primeiro com 5 ml de solução de bloqueio durante 30 segundos e, em seguida, duas vezes com 5 mL de TBST / PBST, durante 5 min num agitador à temperatura ambiente. </li><li> Incubar a matriz lavada com 5 ml de solução de proteína marcada com His contendo 2,5% (w / v) de leite em pó desnatado para prevenir a ligação não específica. Aqui, utilizar 4,5 ^ M de solução de proteína (STIL 500-650) dissolvido na solução de bloqueio descrito. NOTA: Normalmente de 5-10 uM de proteína são usados ​​para o rastreio, mas a concentração de proteína pode ser mesmo tão baixa como 2-3 uM, dependendo da afinidade de ligação e as concentrações locais de péptidos que se ligaram na matriz (a eficiência da síntese). O tampão no qual a proteínaé dissolvido pode variar, mas é comum para diluir a proteína utilizando a mesma solução de bloqueio descrito acima. </li><li> Incubar a matriz na solução de proteína de 3-8 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ºC. </li></ol> 4. A incubação com o anticorpo <ol><li> Lava-se a matriz três vezes com 5 mL de TBST / PBST. A primeira lavagem é de 30 seg seguido por duas lavagens de 5 min no agitador, à temperatura ambiente. </li><li> Incubar a matriz lavada com 5 ml de anticorpo conjugado com HRP diluída (1: 1500) em um tampão de incubação que contém os mesmos ingredientes nas mesmas concentrações como a solução de bloqueio, durante 1 h num agitador à temperatura ambiente. O anticorpo pode ligar-se quer a proteína alvo, ou a etiqueta. </li><li> Realizar experiências de controlo testar a interacção do anticorpo com os péptidos sobre a matriz, especialmente se a matriz contém péptidos da proteína alvo (por exemplo, para estudos de oligomerização) através da repetição do mesmo protocolo sem step 3, a incubação com a proteína. </li><li> Lava-se a matriz três vezes com 5 mL de TBST / PBST. A primeira lavagem é de 30 seg seguido por duas lavagens de 5 min no agitador, à temperatura ambiente. </li></ol> 5. Leitura da Matriz <ol><li> Realizar desenvolvimento de quimiluminescência com um kit de substrato western blotting ECL. </li><li> Realizar a detecção com um analisador de imagem luminescente. </li><li> Analisar os resultados. Certifique-se de que ambos os duplicados na matriz apresentam os mesmos sinais, por isso os resultados são confiáveis. Se a estrutura do parceiro de proteína é conhecido, pesquisa sobre a estrutura para os péptidos de ligação e procurar os locais de ligação. Mesmo os péptidos que estão longe na sequência podem estar próximos uns dos outros na estrutura terciária e criar um local de ligação. </li></ol>

<ol><li>Benyamini, H., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+peptides+to+study+protein%E2%80%93protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Using peptides to study protein–protein interactions.</a> Future Medicinal Chemistry. 2 (6), 989-1003 (2010).</li>
<li>Geysen, H. M., Wagner, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope+or+mass+encoding+of+combinatorial+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Isotope or mass encoding of combinatorial libraries.</a> Chemistry & Biology. 3 (8), 679-688 (1996).</li>
<li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spot-synthesis%3A+an+easy+technique+for+the+positionally+addressable%2C+parallel+chemical+synthesis+on+a+membrane+support%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron%22%5BJournal%5D)">Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support.</a> Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).</li>
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<li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SPOT-synthesis+technique%3A+Synthetic+peptide+arrays+on+membrane+supports%E2%80%94principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">The SPOT-synthesis technique: Synthetic peptide arrays on membrane supports—principles and applications.</a> Journal of Immunological Methods. 267 (1), 13-26 (2002).</li>
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<li>Intavis Bioanalytical Instruments. , 
 
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<li>Izraeli, S., Lowe, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SIL+gene+is+required+for+mouse+embryonic+axial+development+and+left-right+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The SIL gene is required for mouse embryonic axial development and left-right specification.</a> Nature. 399 (6737), 691-694 (1999).</li>
<li>Izraeli, S., Colaizzo-Anas, T., Bertness, V. L., Mani, K., Aplan, P. D., Kirsch, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+SIL+gene+is+correlated+with+growth+induction+and+cellular+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Expression of the SIL gene is correlated with growth induction and cellular proliferation.</a> Cell Growth Differ. 8 (11), 1171-1179 (1997).</li>
<li>Arquint, C., Sonnen, K. F., Stierhof, Y. -D., Nigg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Cell-cycle-regulated+expression+of+STIL+controls+centriole+number+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">a Cell-cycle-regulated expression of STIL controls centriole number in human cells.</a> Journal of Cell Science. 125 (5), 1342-1352 (2012).</li>
<li>Tang, C. J., Lin, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+microcephaly+protein+STIL+interacts+with+CPAP+and+is+required+for+procentriole+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">The human microcephaly protein STIL interacts with CPAP and is required for procentriole formation.</a> Embo J. 30 (23), 4790-4804 (2011).</li>
<li>Vulprecht, J., David, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIL+is+required+for+centriole+duplication+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">STIL is required for centriole duplication in human cells.</a> Journal of Cell Science. 125 (5), 1353-1362 (2012).</li>
<li>Campaner, S., Kaldis, P., Izraeli, S., Kirsch, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sil+phosphorylation+in+a+Pin1+binding+domain+affects+the+duration+of+the+spindle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sil phosphorylation in a Pin1 binding domain affects the duration of the spindle checkpoint.</a> Mol Cell Biol. 25 (15), 6660-6672 (2005).</li>
<li>Kasai, K., Inaguma, S., Yoneyama, A., Yoshikawa, K., Ikeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCL%2FTAL1+interrupting+locus+derepresses+GLI1+from+the+negative+control+of+suppressor-of-fused+in+pancreatic+cancer+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">SCL/TAL1 interrupting locus derepresses GLI1 from the negative control of suppressor-of-fused in pancreatic cancer cell.</a> Cancer Res. 68 (19), 7723-7729 (2008).</li>
<li>Chaturvedi, P., Sudakin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chfr+regulates+a+mitotic+stress+pathway+through+its+RING-finger+domain+with+ubiquitin+ligase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chfr regulates a mitotic stress pathway through its RING-finger domain with ubiquitin ligase activity.</a> Cancer Res. 62 (6), 1797-1801 (2002).</li>
<li>Olaussen, K. a, Commo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+proapoptotic+effects+of+the+two+tyrosine+kinase+inhibitors+pazopanib+and+lapatinib+on+multiple+carcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Synergistic proapoptotic effects of the two tyrosine kinase inhibitors pazopanib and lapatinib on multiple carcinoma cell lines.</a> Oncogene. 28 (48), 4249-4260 (2009).</li>
<li>Reingewertz, T. H., Britan-Rosich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Vif%E2%80%93A3G+interaction+using+peptide+arrays%3A+A+basis+for+anti-HIV+lead+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mapping the Vif–A3G interaction using peptide arrays: A basis for anti-HIV lead peptides.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (12), 3523-3532 (2013).</li>
<li>Katz, C., Benyamini, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+interaction+between+the+antiapoptotic+Bcl-2+family+proteins+and+the+proapoptotic+protein+ASPP2%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the interaction between the antiapoptotic Bcl-2 family proteins and the proapoptotic protein ASPP2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12277-12282 (2008).</li>
<li>Katz, C., Zaltsman-Amir, Y., Mostizky, Y., Kollet, N., Gross, A., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Basis+of+the+Interaction+between+Proapoptotic+Truncated+BID+%28tBID%29+Protein+and+Mitochondrial+Carrier+Homologue+2+%28MTCH2%29+Protein%3A+KEY+PLAYERS+IN+MITOCHONDRIAL+DEATH+PATHWAY%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular Basis of the Interaction between Proapoptotic Truncated BID (tBID) Protein and Mitochondrial Carrier Homologue 2 (MTCH2) Protein: KEY PLAYERS IN MITOCHONDRIAL DEATH PATHWAY.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (18), 15016-15023 (2012).</li>
<li>Rosenberg, M. M., Ronen, D., Lahav, N., Nazirov, E., Ravid, S., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+characterization+of+myosin+IIC+tailpiece+and+its+effect+on+filament+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High resolution characterization of myosin IIC tailpiece and its effect on filament assembly.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (14), 9779-9789 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Rastreio de matriz péptido é uma excelente ferramenta para identificar os locais de ligação de uma proteína alvo nos seus parceiros. Este ensaio é rápido e fácil de realizar e os resultados podem ser obtidos em um ou dois dias de trabalho. Rastreio de matriz péptido é versátil e pode ser usado para muitas finalidades. Ele pode ser usado para a caracterização de modificações pós-tradução, tais como a fosforilação e identificação de substratos de quinases. Por exemplo: a quinase FLT3, que está relacionada com leucemia mie...

Interacções proteína-proteína mediar a maior parte dos processos na célula viva. Interacções proteína Deficiência pode resultar em doença, as interacções proteicas importantes alvos de drogas. Assim, é muito importante para compreender essas interações a nível molecular. Interacções entre proteínas são estudados usando uma variedade de técnicas que vão desde os ensaios celulares e bioquímicos para ensaios quantitativos biofísicas, e estas podem ser realizadas tanto com as proteínas de comprimento completo, com domínios de proteína ou com péptidos. Peptídeos servir como excelentes ferramentas para estudar interações protéicas. Isto é porque os péptidos podem ser facilmente sintetizadas e permitem que a focagem sobre um sítio de interacção específica de um lado e de vários alvos de proteína de uma forma de alto rendimento, por outro lado 1,2. Rastreio de matriz é um péptido rápido, fácil de executar método para a obtenção de uma grande quantidade de dados sobre as interacções de uma proteína alvo com numerosos parceiros num curto espaço de tempo 3. Ao contrário de outros métodos bioquímicos ou biofísicas para detectar e analisar interacções proteína-proteína, péptido rastreio matriz requer uma concentração muito baixa de proteína e pode detectar ligação muito fraca. Matrizes de péptidos pode ser utilizada para muitas aplicações em interacções péptido-proteína, tais como mapeamento de proteína-proteína ou sítios de interacção ligando-receptor 4, interfaces de homo- ou hetero-oligomerização, anticorpos que caracterizam epitopos 5, 6 estudar as actividades enzimáticas e de alto rendimento estrutura- relação atividade (SAR) estuda 7. Para uma análise aprofundada sobre a seleção matriz peptídeo ver Katz et al. 4 Vários tipos de matrizes de péptidos existem actualmente. Existem duas principais estratégias sintéticas para preparar matrizes de péptidos: síntese dos péptidos antes anexando-os ao suporte sólido, ou a síntese de péptidos directamente no suporte sólido, utilizando principalmente o SPOT 4,8 técnica. Oos péptidos são sintetizados sobre o suporte sólido geralmente por 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) 8 química. Entre os esquemas sintéticos comuns são apego peptídeo através do terminal N (por exemplo, JPT Pepstar matrizes 9) e apego peptídeo através do terminal C (por exemplo, PEPSCAN matrizes pepchip 10, JPT pepspot matrizes 9 ​​e INTAVIS matrizes celluspot 11) 4. O suporte sólido pode variar e assim faz a química do acoplamento de péptidos a ele. Péptidos de Cis-terminados pode ser ligado a lâminas de vidro através do grupo tiol 12. O terminal N de um péptido pode ser ligado covalentemente a um grupo hidroxilo na membrana de celulose através de esterificação do aminoácido ligado 8. Aqui é apresentado um protocolo detalhado para o rastreio de matrizes de péptidos como um método para estudar as interacções proteína-proteína. A matriz que é utilizada a matriz Celluspots, que é uma micro-array contendo grande amount de pontos (duplicatas de até 384 pontos) em uma membrana de celulose pequena apoiados por uma lâmina de vidro. Isto permite trabalhar com volumes baixos de proteína e anticorpos e obtenção quantidade significativa de dados por única experiência. Essa matriz também contém alta densidade peptídeo que permite a detecção de baixa afinidade de ligação. A matriz foi utilizado para o mapeamento da interacção Stil-chfr, o que é altamente importante para o controlo da proliferação celular normal 13. Descontrolada interacção entre as duas proteínas pode levar ao desenvolvimento de cancro. Ao mapear essa interação encontramos o sítio de ligação específico e resíduos de 14 vinculativa. Isso abre o caminho para a concepção de inibidores racionais que inibem esta interação proteína-proteína.

<table><tbody><tr><td>Matriz de peptídeos</td><td>INTAVIS Bioanalytical Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>His-probe Anticorpo (H-3) HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8036 HRP</td><td></td></tr><tr><td>EZ-ECL Kit</td><td>Biological industries</td><td>20-500-120</td><td></td></tr><tr><td>Leite desnatado</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>Câmera LAS-3000&nbsp;</td><td>Filme</td><td></td><td></td> FUJI</tr></tbody></table>

a identificação da proteína-proteína locais de interacção usando peptide arrays

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Interacções proteína-proteína mediar a maior parte dos processos na célula viva e o controlo da homeostase do organismo. Interacções proteína Deficiência pode resultar em doença, as interacções proteicas importantes alvos de drogas. Assim, é muito importante para compreender essas interações a nível molecular. Interacções entre proteínas são estudados usando uma variedade de técnicas que vão desde os ensaios celulares e bioquímicos para ensaios quantitativos biofísicas, e estas podem ser realizadas tanto com as proteínas de comprimento completo, com domínios de proteína ou com péptidos. Os péptidos servir como excelentes ferramentas para estudar as interacções proteína desde os péptidos podem ser facilmente sintetizadas e permitem que o foco em locais específicos de interacção. Peptídeo matrizes permitem a identificação dos sítios de interacção entre duas proteínas, bem como a despistagem de péptidos que se ligam a proteínas alvo para fins terapêuticos. Eles também permitem alta produtividade estudos de SAR. Para a identificação dos locais de ligação, um TYPIcal matriz peptídica normalmente contém parcialmente sobrepostos 10-20 resíduos de péptidos derivados a partir das sequências completas de uma ou mais proteínas associadas da proteína alvo desejado. O rastreio da matriz para a ligação da proteína alvo revela os péptidos de ligação, o que corresponde aos locais de ligação nas proteínas parceiras, em um método fácil e rápido usando apenas uma pequena quantidade de proteína. Neste artigo descrevemos um protocolo de triagem de matrizes de peptídeos para mapear os sítios de interação entre uma proteína-alvo e seus parceiros. A matriz péptido foi concebido com base nas sequências das proteínas parceiras, tendo em conta as suas estruturas secundárias. As matrizes utilizadas neste protocolo foram Celluspots matrizes preparadas por INTAVIS bioanalíticos Instruments. A matriz é bloqueada para evitar ligação inespecífica e depois incubadas com a proteína estudada. A detecção utilizando um anticorpo revela os péptidos de ligação correspondentes aos sítios específicos de interacção entre as proteínas.

STIL é uma proteína centrosomal altamente importante. Ele controla a divisão celular normal e proliferação celular 13,15 - 19. STIL interage com várias proteínas 18,20,21, e a maior parte das interacções ocorrer através da sua parte central, que é uma região intrinsecamente desordenados (IDR) 14. Concebemos uma matriz composta de péptidos derivados da proteína de ligação STIL chfr. Chfr é um supressor de tumor que é induzida em resposta ao estresse 22 mitóticas. Uma vez que a ...

A triagem de matriz de peptídeos é um ensaio de alto rendimento para identificar locais de interação proteína-proteína. Isso permite mapear várias interações de uma proteína-alvo e pode servir como um método para identificar locais para inibidores que têm como alvo uma proteína. Aqui descrevemos um protocolo para triagem e análise de matrizes de peptídeos.

A identificação da proteína-proteína Locais de interacção Usando Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

O objetivo geral deste procedimento é mapear a interação entre duas proteínas ou domínios proteicos. Neste caso, os domínios de proteínas relacionadas ao câncer ainda e CHFR são estudados. O objetivo geral deste procedimento é mapear a interação entre duas proteínas ou domínios proteicos.Neste caso, os domínios de proteínas relacionadas ao câncer ainda e CHFR são estudados. O segundo passo é incubar a matriz de peptídeos CHFR com seu parceiro de ligação, a proteína parada. Em seguida, a matriz é lavada e incubada com peroxidase de rabanete, anticorpo conjugado.A matriz é então submetida à detecção de luminescência química para detectar a ligação. A etapa final é analisar os resultados e identificar os locais de ligação entre as proteínas. Este estudo abre caminho para o desenvolvimento de inibidores racionais da ligação ainda do CHFR, cuja interação descontrolada pode levar ao desenvolvimento de câncer.Este método pode ajudar a responder a questões-chave na pesquisa de interação de proteínas, como quais são as regiões específicas que meditam Uma interação entre duas proteínas, Divida a sequência da proteína alvo em 10 a 20 peptídeos residuais. Isso se sobrepõe parcialmente. A quantidade de sobreposição pode ser variada, mas, em princípio, quanto maior a sobreposição, melhor.Ao projetar os peptídeos, leve em consideração os elementos de estrutura secundária conhecidos na proteína que podem ser responsáveis pela interação. A matriz de peptídeos projetada pode ser encomendada por meio de fornecedores comerciais. Para este experimento, os peptídeos dos resíduos do domínio CHFR 4 24 a 6 62 são ligados covalentemente à matriz através do terminal C.Depois de receber a matriz projetada, prepare-a para o experimento bloqueando-a primeiro para evitar a associação não específica. Faça uma solução de bloqueio de 2,5% de peso por volume. Leite em pó desnatado em solução tampão tris contendo 0,05% Tween 20 ou TBST para evitar ligação inespecífica.Mergulhe a matriz em cinco mililitros de solução de bloqueio. Incube a matriz por duas a quatro horas em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius em um shaker. Lave a matriz primeiro com cinco mililitros de solução de bloqueio por 30 segundos.Em seguida, lave a matriz duas vezes com cinco mililitros de TBST por cinco minutos em uma coqueteleira em temperatura ambiente. Em seguida, incube a matriz lavada com cinco mililitros de solução de proteína marcada com poli-histidina contendo 2,5% de peso por volume. Leite em pó desnatado para evitar ligações inespecíficas.Aqui, uma solução micromolar de 4,5 de resíduos de proteínas ainda 500 a seis 50 é usada. Em seguida, incube a matriz na solução de proteína por três a oito horas em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Após incubação na solução proteica.Lave a matriz com cinco mililitros de TBST por 30 segundos em uma coqueteleira em temperatura ambiente, seguida de duas lavagens adicionais de cinco minutos. Agora incube a matriz lavada com cinco mililitros de anticorpo conjugado diluído de peroxidase de rabanete em um tampão de incubação que contenha os mesmos ingredientes nas mesmas concentrações da solução de bloqueio por uma hora em um agitador à temperatura ambiente, o anticorpo pode se ligar à proteína alvo ou à etiqueta, realizar experimentos de controle, testando a interação do anticorpo com peptídeos na matriz repetindo o mesmo protocolo em uma matriz separada deslize sem incubar com a proteína antes de ler as matrizes. Lave-os como antes com cinco mililitros de TBST.Realize o desenvolvimento de quimioluminescência com um kit de substrato de western blotting de quimioluminescência aprimorado. Execute a detecção com um analisador de imagem luminescente, como uma câmera Fuji film LAS 3000. Analise os resultados, certificando-se de que ambas as duplicatas na matriz mostrem os mesmos sinais para que os resultados sejam confiáveis.Se a estrutura do parceiro proteico for conhecida, procure na estrutura os peptídeos de ligação e procure os locais de ligação. Lembre-se de que os peptídeos que estão longe na sequência podem estar juntos na estrutura terciária e criar um local de ligação. Em nosso exemplo, ainda é uma proteína altamente importante do Centro Somal que controla a divisão celular normal e a proliferação celular ainda interage com várias proteínas através de sua região intrinsecamente desordenada.Usando a matriz de peptídeos projetada, os locais de ligação ainda no supressor de tumor CHFR foram revelados. Cada ponto preto na matriz representa um peptídeo derivado de A-C-H-F-R que ainda observa que cada peptídeo aparece duas vezes, pois existe em duplicata, o que verifica a confiabilidade dos resultados. A triagem de matriz de peptídeos revelou sete peptídeos derivados de CHFR que se ligaram aos resíduos da região ainda intrinsecamente desordenada 500 a seis 50.Esses resultados nos permitiram mapear o sítio de ligação de ainda no CHFR. Apesar da distância desses sete peptídeos na sequência primária do CHFR. Eles criam um sítio de ligação bem definido para ainda na estrutura terciária do CHFR.Este método é aplicável para caracterizar todas as interações proteína-proteína Seguindo este procedimento. Métodos quantitativos como fluorescência e isótopo ou ITC devem ser usados para verificar, quantificar, a introdução do peptídeo.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Tandem purificação por afinidade é uma abordagem robusta para a identificação de parceiros de ligação às proteínas. Como prova de conceito, este método foi aplicado ao bem caracterizado eIF4E factor de iniciação da tradução para o co-precipitado os factores de células hospedeiras envolvido na iniciação da tradução. Este método é facilmente adaptado a qualquer proteína celular ou virai.

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Este vídeo demonstra uma técnica que usa peptídeos de penetração de células biotiniladas para detectar interações proteína-proteína intracelular. Os peptídeos que penetram nas células facilitam a entrada do peptídeo conjugado em uma célula e se ligam especificamente às suas proteínas de interação. A biotina, após se ligar à avidina, permite a purificação do complexo de proteínas que interagem a partir de um lisado celular.

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Este vídeo demonstra uma técnica que aplica a tecnologia de microarray de peptídeos para traçar o perfil da especificidade dos anticorpos que reconhecem modificações pós-traducionais (PTMs) em peptídeos de histonas. Uma lâmina de microarray contendo peptídeos de histonas conjugados com fluoróforo imobilizado com combinações conhecidas de PTM é tratada com anticorpos específicos de PTM alvo. Esse processo ajuda a identificar a especificidade do anticorpo para o alvo e sua potencial reatividade...

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Identificação baseada em peptídeo de motivos funcionais e seus parceiros de ligação

Experimentos de imunoprecipitação SILAC representar um poderoso meio para descobrir nova proteína: interações protéicas. Ao permitir que a quantificação relativa exacta da abundância de proteína em ambas as amostras de controlo e de ensaio, os verdadeiros interacções podem ser facilmente distinguidos dos contaminantes experimentais, e interacções de baixa afinidade preservado através da utilização de condições de tampão menos rigorosas.

Identificação de parceiros de interação de proteínas em células de mamíferos utilizando SILAC-imunoprecipitação quantitativos Proteômica

Utilizando microarrays de proteína que contêm quase toda a S. cerevisiae proteoma é sondado para um rápido interrogatório imparcial de milhares de interações proteína-proteína em paralelo. Este método pode ser utilizado para a molécula de proteína-pequena, a modificação pós-traducional, e outros ensaios in high-throughput.

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As matrizes de peptídeos sintetizadas pelo método SPOT podem ser usadas para analisar a especificidade do substrato das proteínas lisina metiltransferases (PKMTs) e para definir o espectro de substrato das PKMTs para entender seu papel biológico. Este protocolo descreve como sintetizar matrizes de peptídeos, metilá-las com PKMTs e analisar os resultados.

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Aqui, apresentamos um protocolo para tela extracelular da proteína microarrays para identificação de interações ligante-receptor romance em alta taxa de transferência. Também descrevemos um método para realçar a deteção de interações da proteína-proteína transiente usando complexos proteína-Microconta.

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Aqui, apresentamos um protocolo para permitir a captura e identificação de interações proteína-proteína específicas da doença de células e tecidos nativos usando sondas químicas e espectrometria de massa. Os conjuntos de dados de interação resultantes são analisados por meio de uma plataforma dedicada baseada na web para revelar disfunções de rede dinâmica e alterações de vias ligadas à doença.

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