Purificando o Impure: Sequenciação metagenomes e metatranscriptomas do Complexo amostras associadas a animais

O objetivo geral deste procedimento é coletar e processar amostras complexas associadas ao hospedeiro, como escarro de fibrose cística, para estudar as comunidades virais e microbianas usando abordagens metagenômicas e metatranscriptômicas. Isso é feito primeiro fazendo com que o sujeito inale solução salina hipertônica a 7% por meio de um nebulizador e, em seguida, colete amostras de escarro induzido durante um período de 30 minutos. Em seguida, a amostra é imediatamente homogeneizada e igualmente distribuída em quatro tubos rotulados como metagenoma viral, metagenoma microbiano, metatranscriptoma e escarro extra.

Em seguida, o tubo de metatranscriptoma é selado, colocado horizontalmente e o escarro homogeneizado em velocidade média por 10 minutos. Finalmente, alíquotas individuais são processadas separadamente para isolar e purificar células virais ou bacterianas antes do isolamento de ácido nucleico para estudos metagenômicos. Em última análise, os ácidos nucléicos isolados são usados para preparação de bibliotecas de sequenciamento de alto rendimento para gerar bibliotecas metagenômicas e metatranscriptômicas.

A principal vantagem deste procedimento é que ele fornece um fluxo de trabalho abrangente para processar amostras complexas associadas ao hospedeiro para o estudo de comunidades virais e bacterianas no nível de DNA e RNA. A demonstração visual deste procedimento é crítica, pois as etapas de pré-tratamento da amostra são importantes para garantir o manuseio adequado da amostra, enquanto as etapas de purificação de células virais e microbianas são difíceis de aprender Devido à complexidade do procedimento Antes da coleta da amostra, rotule quatro tubos de 15 mililitros por amostra com o seguinte, o primeiro com metagenoma viral, o segundo como metagenoma microbiano número três com metatranscriptoma e tubo número quatro como escarro extra. Adicione dois mililitros de esferas de sílica de 0,1 milímetro no tubo rotulado como metatranscriptoma, seguido por seis mililitros de tampão de lise de RNA à base de isotiocianato de guiné, ou tampão de lise GITC.

Seguindo o procedimento de coleta de amostras descrito no protocolo de texto e usando copos de amostra pré-wade, estime o volume da amostra pesando o copo após a coleta da amostra e subtraia o peso do copo vazio. Para o peso restante, um grama equivalerá a um mililitro de amostra. Se o volume da amostra for inferior a oito mililitros, adicionar o volume adequado de 0,02 micrómetros filtrado um XPBS para elevar o volume final a oito mililitros.

Em seguida, use imediatamente uma seringa de três mililitros para homogeneizar a amostra até que nenhum aglomerado visível permaneça dentro do escarro, usando a mesma seringa, retire imediatamente dois mililitros de escarro e injete-o no tubo de microtranscriptoma contendo esferas de sílica e tampão de lise GITC. Feche a tampa e use filme para selar a tampa com segurança Para evitar vazamentos, use um vórtice, senhor para homogeneizar imediatamente o escarro em velocidade média por 10 minutos. Usando a mesma alíquota de seringa, dois mililitros de escarro cada um nos tubos rotulados como metagenoma vira e metagenoma microbiano, e transfira o escarro restante do copo de escarro para o tubo rotulado como escarro extra.

Armazene todos os tubos a quatro graus Celsius ou no gelo e transporte para o laboratório, se necessário, para gerar um metagenoma viral. Após a preparação de tampões e soluções. Pré-trate as amostras adicionando tampão de magnésio salino filtrado de 0,02 micrômetro a um volume total de seis mililitros.

Para ajudar na dissolução do muco, adicione seis mililitros de 6,5 milimolares de DTT a cada amostra. Vórtice vigorosamente para misturar e incubar por uma hora a 37 graus Celsius. Depois de um vórtice vigoroso, as amostras giram novamente a 3056 Gs e 10 graus Celsius por 15 a 20 minutos.

Recolher cada sobrenadante num novo tubo de 15 mililitros. Em seguida, use um filtro de ponto 45 micrômetros montado em uma seringa para filtrar os sobrenadantes em novos tubos de 15 mililitros. Remova 100 microlitros de amostra em um tubo de micro fuge e, em seguida, execute o tratamento com clorofórmio.

Extrair o sobrenadante e realizar um tratamento DN um. Adicione um volume igual de 4% para de formaldeído para fixar a amostra. Para microscopia de epifluorescência, consulte o protocolo de texto para uma abordagem abrangente de enriquecimento de partículas virais.

Caso contrário, usando soluções de cloreto de césio recém-preparadas, estabeleça um gradiente de cloreto de césio carregando um mililitro de 1,7 gramas por mililitro de solução de cloreto de césio em cada tubo, seguido por um mililitro de 1,5 gramas por mililitro, um mililitro de um vírgula 35 gramas por mililitro e, finalmente, um mililitro de 1,2 gramas por mililitro de solução de cloreto de césio. Finalmente, carregue de seis a oito mililitros de amostra em tubos de gradiente individuais. Marque camadas individuais para indicar a localização de cada fração.

Em seguida, equilibre cada par oposto de dois com um miligrama. Trave cuidadosamente cada tubo no balde de centrifugação. Carregue no rotor e centrifugue a 82.844 Gs e quatro graus Celsius por duas horas.

Após a centrifugação, remova cuidadosamente os tubos do suporte sem interromper os gradientes de densidade com uma agulha de calibre 18 conectada a uma seringa de três mililitros. Certifique-se de que a extremidade aberta da agulha esteja voltada para cima. Perfure o tubo logo abaixo da camada de densidade de 1,5 grama por mililitro e puxe lentamente aproximadamente 1,5 mililitro de solução para a seringa.

Remova lentamente a agulha e deixe a fração restante no tubo pingar em um novo tubo de 15 mililitros através da punção. Rotule isso como cintura de fração superior Transfira a solução na seringa contendo o V ps em dois novos tubos de microfuga. Uma vez preparados os tampões e as soluções, de acordo com o protocolo de texto, adicionar cinco volumes de XPBS filtrado por micrômetro de ponto 22 Para diluir cada homogenato sob uma coifa química, adicionar etanol beta MAR capta a uma concentração final de 2% volume a volume e agitar a mistura à temperatura ambiente por duas horas após a incubação.

Gire a amostra a 3056 GS e 10 graus Celsius por 15 minutos. Depois de descartar o sobrenadante, use 10 mililitros de água de grau molecular para ressuspender o pellet e incubar em temperatura ambiente por 15 minutos antes de repetir a lavagem. Após uma centrifugação final, e uma vez que o SUP natin tenha sido descartado, use cinco mililitros de um tampão XDNA para ressuspender o pellet antes de adicionar 15 microlitros de ds.

Um por mililitro de amostra Incubar a 37 graus Celsius com mistura repetida por duas horas. Depois de girar as amostras e descartar o snat, use 10 mililitros de tampão SE para ressuspender o pellet. Em seguida, gire a amostra e repita a lavagem.

Use dois mililitros de tampão SE para ressuspender o pellet e transfira a suspensão para dois tubos de micro fuge. Em seguida, gire os tubos a 16.000 GS em temperatura ambiente por 15 minutos. Finalmente, após remover o sobrenadante, use um kit de extração de DNA genômico seguindo as instruções para bactérias gram-positivas.

Para isolar o DNA, os resultados anteriores para gerar metagenomas virais são resumidos aqui. Os viromas contêm poucas sequências derivadas de humanos, com apenas uma amostra contendo 70% de amostra de DNA humano CCF quatro A foi omitido da etapa de ultracentrifugação do gradiente de densidade e, como resultado, continha mais de 97% de sequências derivadas de humanos. Esta figura mostra uma imagem fluorescente de uma amostra típica de escarro de FC antes e depois da ultracentrifugação com gradiente de densidade.

Vlp claro foi observado na ausência de partículas grandes após a separação do gradiente de densidade vista aqui. Sete amostras diárias de escarro foram coletadas de um único paciente com fibrose cística que iniciou antibióticos orais. Após o terceiro dia de coleta, o rendimento total de lise hipotônica derivada ou DNA HL coletado de cada amostra variou de 210 nanogramas a mais de cinco microgramas de bibliotecas de sequenciamento Illumina geradas para cada amostra.

Todas, exceto uma biblioteca, renderam mais de 1 milhão de sequências e mais de 85% de sequências de alta qualidade foram retidas no pré-processamento de dados. Usando o software de seqüência de impressão, a quantidade total de sequências derivadas de humanos variou de 14% a 46% Como mostrado aqui, os perfis microbianos das subamostras são altamente semelhantes às amostras após dois tratamentos de lise hipotônica. Além disso, a segunda lise hipotônica aumenta a fração de sequências não humanas em seis a 17% dentro dos metagenomas.

Não se esqueça de que trabalhar com amostras clínicas e patógenos em potencial pode ser extremamente perigoso. O equipamento de proteção individual deve sempre ser usado durante o manuseio da amostra. Boas técnicas de biologia molecular e microbiologia são necessárias durante a execução deste procedimento para garantir que não haja contaminação.

Após este procedimento, você deve ser capaz de realizar estudos metagenômicos virais e microbianos, bem como metatranscriptômicos de amostras complexas, como escarro de FC.