Name: Purificando o Impure: Sequenciação metagenomes e metatranscriptomas do Complexo amostras associadas a animais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Aprenda a processar amostras complexas associadas a hospedeiros, como escarro de fibrose cística, para estudar comunidades virais e microbianas usando abordagens metagenômicas e metatranscriptômicas. Este método permite análises abrangentes de DNA e RNA.

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Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Saúde (1 R01 GM095384-01) atribuído à Floresta Rohwer. Agradecemos Epicentro, uma empresa Illumina para fornecer acesso antecipado a kits Ribo-Zero Epidemiologia. Agradecemos Mark Hatay para a concepção e produção do suporte de tubos de ultracentrifugação. Agradecemos Andreas Haas e Benjamin Knowles para leituras críticas e discussões sobre o manuscrito, e Lauren Paul para auxiliar o processo de filmagem.

Os autores não têm nada a divulgar.

Metagenomics virais As partículas virais são concentradas utilizando polietileno glicol (PEG) ou pequenos concentradores de volume. Em alguns casos, pode não ser necessária concentração, mas pré-filtração ou passos de centrifugação de baixa velocidade são usadas para remover as células eucarióticas e microbianas. Os lisados ​​virais será enriquecido e purificado utilizando ultracentrifugação de gradiente de densidade de 9,41 ou filtros de tamanho pequeno (por exemplo, 0,45 mm) para remover as células microbianas e eucarióticas grandes 25. Ultracentrifugação de gradiente de densidade é tipicamente realizada com soluções densos mas inertes, tais como sacarose ou cloreto de césio para isolar e concentrar as partículas virais 41. A separação física é baseada no tamanho e densidade de flutuação de partículas virais. Portanto, a escolha adequada do tamanho de poro do filtro e a rigorosa preparação de gradientes são essenciais para isolar as comunidades virais específicos, como o sucesso da recuperação físicaVLP determina a comunidade isolada 41 (isto é, partículas virais que não passam através do filtro ou queda na densidade de extracção não serão detectados no metagenome). Após o isolamento e concentração viral, pode haver contaminação material genómico não-viral presente na amostra, tanto na forma de ácidos nucleicos livres e microbiana e células eucarióticas. Portanto, é crítico para verificar a pureza de partículas virais em amostras (Figuras 1A e 1B). Um tratamento de clorofórmio é comumente utilizado para lisar as células remanescentes, seguido por tratamento com nuclease para degradar ácidos nucleicos livres antes da extracção do ácido nucleico. Uma advertência ao fluxo de trabalho apresentados foi a utilização de separação por gradiente de densidade para isolar partículas virais, uma vez que podem excluir partículas virais com invólucro que possam ser muito flutuante para entrar no gradiente de CsCl. Uma alternativa &quot;catch-all&quot; método é omitir a separ gradiente de densidadeção e isolar o DNA da comunidade dos 0,45 mm - filtrados tratados com clorofórmio e ADNase I. Esta abordagem é também apropriado para acomodar pequenos volumes de amostras, tais como aqueles a partir de esfregaços de sangue ou plasma. No entanto, isto pode resultar na contaminação bacteriana resistente ao clorofórmio e maior quantidade de ADN extracelular ADNase I resistente. Protocolos de seqüenciamento atuais requerem 1 ng a 1 mg de ácidos nucleicos para a preparação biblioteca sequenciamento de DNA em que os rendimentos mais elevados proporcionar uma escolha mais ampla de opções de sequenciamento. A concentração de ADN de viromes geradas muitas vezes varia entre o limite inferior de detecção de mais do que 200 ng / mL. A quantidade de ácidos nucleicos virais recuperados podem ser insuficientes para a preparação da biblioteca de sequenciação directa. Em tais casos, a amplificação do ácido nucleico é essencial. Linker amplificação espingarda bibliotecas (LASLs) 2,42,43 e amplificação do genoma inteiro com base em múltiplos de amplificação de deslocamento (MDA) são os doismétodos mais comumente usados ​​para gerar DNA suficiente para sequenciamento. MDA métodos tais como aqueles baseados em phi29 polimerase de ADN são conhecidas por sofrer de viés de amplificação, e pode amplificar ADNcs e preferencialmente de ADN circular, resultando em taxonómico não quantitativo e caracterização funcional 44,45. Foi demonstrado uma versão optimizada do LASLs abordagem para introduzir apenas desvios mínimos, promove uma maior sensibilidade (para pequenas quantidades de material de partida), e é facilmente adaptado para diferentes plataformas de sequenciação 43. No entanto, a abordagem tem muitas etapas, requer equipamento especializado para minimizar a perda de DNA, e é limitado a modelos de dsDNA. No nosso laboratório, esta abordagem foi adaptada com sucesso para amplificar quantidade detectável e indetectável de DNA extraído a partir de lavage- broncoalveolar, e coral- VLP derivadas de água do mar (não publicadas e Hurwitz et ai. 46). Desenvolver pipelines de análise de dados tem classically sido um dos aspectos mais desafiadores da análise metagenômica viral devido à natureza altamente diversificada e em grande parte desconhecida das comunidades virais. Embora haja um número estimado de 10 8 genótipos virais na biosfera, até à data bases de dados virais atuais contêm ~ 4.000 genomas virais, o que é cerca de 1/100000 dessa diversidade viral total aproximado. Portanto, pesquisas baseadas em similaridade (como BLAST 47) para atribuição taxonômica e funcional em metagenomes virais possuem desafios inerentes. Muitas sequências de deixar de ter semelhanças significativas para genomas no banco de dados e, portanto, são classificados como desconhecido. Apesar de pesquisas baseadas em homologia são as aplicações mais importantes para a atribuição de taxonomia e função para a sequência de dados, abordagens alternativas com base na análise independente do banco de dados foram desenvolvidos 48- 50. Fancello et al. 51 fornecer uma revisão completa de ferramentas computacionais e algoritmos usados ​​em Viral metagenômica. Microbial Metagenomics Tipicamente, a quantidade total de DNA extraído a partir de comunidades microbianas tratados com lise hipotónica (HL-DNA) na gama de 20 ng a 5 mg. O rendimento é altamente dependente do estado de saúde do paciente e a quantidade de amostra de expectoração recolhida, o que explica as variações observadas na produção total de células HL-DNA extraído neste estudo (Tabela 2). Os passos críticos para gerar dados de sequência de boa qualidade dependem da qualidade de bibliotecas de sequenciação geradas. A Figura 2 mostra um intervalo de tamanho típico para as bibliotecas de sequenciação geradas a partir de ADN microbiano derivado de expectoração CF utilizando um procedimento de fragmentação de ADN baseada em enzimática. O tamanho óptimo biblioteca é dependente da escolha da plataforma de sequenciação e aplicação, e, por conseguinte, o processo de fragmentação pode ser optimizado, se necessário, através de métodos alternativos, tais como sonicação e a nebulização. Além deos resultados representativos apresentados, o sucesso do método apresentado na expectoração CF recolhidos a partir de vários doentes em vários pontos de tempo é também ilustrado na Lim et al. (2012) 9 e Lim et al. (2014) 10. Estudos anteriores 9,10 sugerem que cada paciente abriga um conjunto exclusivo de comunidade microbiana que muda ao longo do tempo, refletindo assim a persistência dos principais jogadores dentro da comunidade enquanto as flutuações são provavelmente devido a perturbações, tais como tratamentos com antibióticos. Se essas flutuações ocorrem diariamente, mesmo sem perturbações externas ou devido ao processo de amostragem e processamento de amostras, ainda está em questão. Com base na metagenômico HL-ADN e análise amplicão ADNr 16S, a amostragem de 7 dias longitudinal mostra que a variação diária de perfis microbianas sem perturbação antibiótico (Dia 1, 2, e 3) foi mínima (Figuras 3A e 3B). Após a introduçãoprodução de antibióticos orais imediatamente após a amostragem Dia 3, mudanças no perfil da comunidade tornou-se evidente no dia 4. Enquanto o antibiótico ciprofloxacina atinge um amplo espectro de bactérias patogénicas conhecidas, tais como P. aeruginosa, Staphylococcus aureus, e Streptococcus pneumoniae, o tratamento aumentou a abundância relativa de P. aeruginosa, enquanto diminui o Streptococcus spp. e P. melaninogenica. By Day 6, a comunidade recuperou lentamente para a estrutura inicial da comunidade de partida. Os resultados sugerem que as flutuações de perfis microbianos dentro de um único paciente é mais provável devido a perturbações da comunidade nas vias aéreas. Dada a consistência entre os perfis microbianos de bibliotecas 16S rDNA e metagenomes de DNA HL-derivada, que descartou os preconceitos provenientes dos primers 16S rRNA utilizados neste estudo. Uma possível explicação para as diferenças observadas em toda 16S rDNA taxonômicoperfis al gerados a partir de ADN total e HL-ADN derivado (Figura 3B) pode ser a presença de quantidades elevadas de Pseudomonas spp. ADN extracelular após o tratamento antibiótico. Isto é apoiado pelas descobertas de que estas diferenças foram mais aparentes no dia 7, três dias após o tratamento antibiótico, que tem como alvo Pseudomonas spp. em adição aos outros. A ciprofloxacina é comumente usada como tratamento de primeira linha em pacientes com FC e P. crônica infecção aeruginosa, embora o seu espectro de atividade inclui a maioria dos patógenos associados à FC. Trabalhamos com a hipótese de que o tratamento com antibióticos erradica comunidades sensíveis, incluindo Streptococcus spp. e, portanto, criar um nicho preenchido por P. resistente aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa pode ganhar resistência, através do aumento de suas comunidades de biofilme e DNA extracelular foi mostrado para ser o principal suporte estrutural de sua arquitetura biofilme 52. Mesmo quando tele recuperou a estrutura da comunidade, DNA extracelular pode ter permanecido no CF escarro. Portanto, estes dados sugerem que a lise hipotónica e os passos de lavagem apresentados neste fluxo de trabalho potencialmente beneficiar não só na remoção do ADN humano derivada, mas também ADN extracelular microbiana derivada que podem deturpar os perfis microbianas reais. Metatranscriptomics A alta qualidade metatranscriptome deve conter relativamente poucas sequências de RNA ribossomal (rRNA) e representam uma amostragem imparcial das transcrições da comunidade (mRNA). Devido à semi-vida curta e limitada quantidade de ARNm, é crítico que o protocolo, como apresentado aqui, reduz o manuseamento da amostra para maximizar o número de transcritos recuperados. Nos últimos anos, várias abordagens para a depleção de ARNr foram desenvolvidos e adaptados em kits disponíveis comercialmente. Estes incluem Microb Enrich, Ribo-Zero, e específicas de cada amostra h subtrativoybridizations 53 que são baseados em hibridação de oligonucleótido, e o ARNm-kit APENAS que se baseia na actividade enzimática do RNA alvo contendo uma exonuclease &#39;monofosfato 5. Além disso, várias abordagens para enriquecimento de mRNA, tais como o MessageAmp Kit II-Bactérias que preferencialmente polyadenylates e amplifica ARN linear também estão disponíveis. Alguns destes métodos (por exemplo, de mRNA-ONLY, Microb E Xpress eo MessageAmp) são usadas simultaneamente para máxima eficiência. No entanto, a eficácia de todas estas abordagens estão limitadas, especialmente quando se trabalha com rRNA parcialmente degradado, como frequentemente observado no ARN total extraído de amostras de FC. Amplificação de ARN dependente de poliadenilação não pode ser usado para gerar metatranscriptomas consistindo de ARNm tanto eucarióticas e procarióticas. Além disso, o (A) da cauda poli adicionado às sequências pode reduz a quantidade de dados de sequências úteis. Regiões com trechos homopoliméricas tendem a ter menores escores de qualidade, causing um número significativo de lê para ser filtrados por sequenciação e software de pós-sequenciamento, e a duração média de leitura útil após o corte fora de poli (A) caudas serão significativamente reduzidos em 54. Lidar com as comunidades microbianas CF complexos e RNA parcialmente degradado (Figuras 4A e 4C), nosso estudo anterior mostrou que o método de captura de hibridização pelo kit Ouro Ribo-Zero foi mais eficaz na remoção tanto rRNA humano e microbiana em comparação com os combinam tratamentos com outros kits 9 (Tabela 3). Os dados resultantes permite a análise simultânea de ambos hospedeiro humano e transcritos microbianas. Dependendo do rendimento e qualidade do RNA, assim como a escolha final da plataforma de sequenciamento, muitos desses processos, incluindo o passo a síntese de cDNA podem ser simplificados, com geração biblioteca seqüenciamento. Por exemplo, o ARN tratado Ribo-Zero pode ser usado para fazer a sequenciação metatranscriptome libraries utilizando o kit RNA-Seq ScriptSeq Biblioteca Preparação. Análise metagenômica de comunidades associadas a animais fornece uma representação abrangente da entidade funcional global que inclui o acolhimento e de suas comunidades associadas. O fluxo de trabalho aqui apresentado é adaptável a uma variedade de amostras associado a animais complexos, especialmente aqueles que contêm muco espesso, grandes quantidades de resíduos celulares, o DNA extracelular, proteínas e complexos de glicoproteína, bem como células hospedeiras para além do microbiano e viral desejado partículas. Mesmo que as partículas virais e microbianas podem ser perdidos a cada passo, as partículas de isolamento e purificação são essenciais para minimizar a quantidade de ADN do hospedeiro. Enquanto os dados metagenomics fornece potenciais metabólicas das comunidades examinados, metatranscriptomics complementar esta revelando a expressão diferencial de funções codificadas 9. Uma avaliação abrangente dos dados genómica e transcrições rendeu novas insireitos à dinâmica das interações com a comunidade e facilita o desenvolvimento de terapias melhorando 9,10,55.

<html> Comunidades virais e microbianas associadas com o corpo humano têm sido investigados extensivamente na última década, através da aplicação de tecnologias de sequenciamento 1,2. Os resultados conduziram ao reconhecimento dos micróbios importância na saúde humana e da doença. A principal iniciativa partiu do projeto humano microbiome que descreve as bactérias (e alguns archaea) residentes na pele humana, e dentro de cavidades orais, vias respiratórias, trato urogenital e do tracto gastrointestinal 3. Mais estudos microbioma de saudáveis ​​vias respiratórias humanas através de lavado bronco-alveolar (BAL) 4,5 e swabs de nasofaringe 4 demonstraram que o pulmão pode servir como um dispositivo de recolha de amostras ambientais, resulta na colonização microbiana transitória nas vias aéreas. No entanto, o impacto da colonização microbiana em superfícies das vias respiratórias com deficiência pode levar a infecções pulmonares graves e crónicos, tais como as observadas em pacientes de fibrose cística (FC). t &quot;&gt; CF é uma doença genética letal causada pela mutação no regulador transmembranar da fibrose cística (CFTR) 6. Estas mutações dão origem a proteínas CFTR defeituoso que por sua vez afecta o transporte de iões transepitelial através da superfície apical do epitélio. A doença afecta múltiplos sistemas orgânicos, mas a maioria de mortalidade e morbidade é atribuível à doença pulmonar FC 7. A CF pulmão fornece um ecossistema único para a colonização microbiana. O defeito no transporte de íons provoca muco para acumular-se nas vias aéreas CF, criando microambientes que consistem em aeróbia , microaerofilia, e compartimentos anaeróbios ancorados por uma superfície mucosa rico em nutrientes estática. Esta ambiente facilita a colonização e proliferação de micróbios, incluindo bactérias, vírus, e fungos. aguda e infecções microbianas pulmonares crónicas levam a respostas imunitárias constantes mas ineficaz, resultando em extensa remodelação das vias respiratórias, a perda de capacidade pulmonar, e, finalmente, pulmoinsuficiência pulmonar. Comunidades bacterianas associadas com a CF de pulmão foram bem descritas por meio de abordagens cultura-dependentes e independentes de cultivo, que incluem usando 16S RNA ribossomal (rRNA) sequenciamento gene 8 e metagenomics espingarda 9,10. A abordagem baseada em rRNA 16S é capaz de caracterizar uma vasta gama de espécies microbianas e capturar grandes mudanças na diversidade comunidade. No entanto, ele é limitado em sua resolução na definição das comunidades (resumidos na Claesson et al. 11, 2010) e as previsões de potenciais metabólicas se limitam a essas funções gerais conhecidos para a taxa identificados. Portanto, 16S rRNA métodos de sequenciação do gene são insuficientes para a precisão analítica taxonômica e funcional necessária das diversas comunidades microbianas presentes nos pulmões de FC. A abordagem metagenômica descrito aqui complementa a abordagem baseada em rRNA 16S, supera suas limitações, e permite uma maneira relativamente eficazpara analisar tanto a taxonomia comunidade microbiana e conteúdo genéticas nos pulmões com FC. ADN microbiana isolada a partir de amostras associado a animais, muitas vezes contém uma grande quantidade de ADN do hospedeiro. Expectoração ou amostras de tecido de pulmão com FC geralmente contêm uma grande quantidade de ADN libertado pelos neutrófilos humanos na resposta imune, muitas vezes, maior do que 99% do DNA total de 12 - 14. Embora algumas células humanas intactas pode estar presente, a maior parte deste ADN é livre em solução ou adsorvido à superfície de micróbios. Além disso, a presença de tampões de muco viscoso excepcionalmente, detritos celulares e outros contaminantes desconhecidos complicam ainda mais o isolamento de células microbianas. Vários métodos foram testados para empobrecer a estas amostras de ADN humano, incluindo gradientes de Percoll a humano a partir de células microbianas separado 15, o tratamento com DNase I, o brometo de etídio monoazide para degradar selectivamente DNA humano 16, e o kit MolYsis, tudo com sucesso limitado.<html> Até à data, o processo mais eficiente de purificação de ADN microbiano para expectoração de FQ foi uma modificação do processo descrito por Breitenstein et al. (1995) 17. Esta abordagem, aqui conhecido como método de lise hipotónico (HL), utiliza uma combinação de β-mercaptoetanol para a redução de mucina ligações dissulfureto, lise hipotónica de células eucarióticas, e tratamento com DNase I de ADN solúvel 9. Apesar da falta de alternativas ao método HL levantou algumas preocupações devido a (i) possíveis vieses resultantes da lise indesejada de micróbios e (ii) se as flutuações observadas na composição da comunidade 9,10 são um artefato de variações associadas com o processamento da amostra. Para além da geração de metagenomes espingarda, que abordar estes problemas, comparando os perfis de genes de rRNA 16S e o ADN total extraído a partir de DNA microbiano do método HL utilizando o mesmo conjunto de amostras de expectoração recolhidos a partir de um único paciente em sete dias consecutivos. ent &quot;&gt; Em comparação com as comunidades microbianas, a caracterização das comunidades virais associados com animais é limitado 18,19 As comunidades virais em CF das vias aéreas só foram caracterizadas minimamente 20 -.. 22 O primeiro estudo metagenômico caracterizar o DNA de comunidades virais em CF das vias aéreas mostraram que a maioria dos vírus associados com os pulmões com FC são fagos 20. O potencial metabólico de fago na FQ e indivíduos sem FC foi significativamente diferente. Especificamente, as comunidades de fagos em indivíduos com FC realizada genes reflectora de adaptações hospedeiras bacterianas para a fisiologia de CF das vias aéreas, e virulência 20. metagenomic estudos subsequentes bacterianas do vírus no tecido pulmonar FC demonstrou heterogeneidade espacial distinto de comunidades virais entre as regiões anatômicas 22. Além disso, o tecido pulmonar FC abrigou a diversidade viral menor observado até agora em qualquer ecossistema 22. A maioria dos vírus identificados foram fagoscom o potencial para infectar patógenos CF. No entanto, os vírus eucarióticos como o vírus do herpes, adenovírus e vírus do papiloma humano (HPV) foram também detectadas. Em um caso, onde foram observados quistos no tecido do pulmão durante a dissecção, mais de 99% de um genoma de vírus do papiloma humano foi recuperado, mesmo que o paciente nunca foi diagnosticado com um papiloma ou carcinoma pulmonar. Isso indica que a diversidade viral presente reflete não só a gravidade dos danos nos tecidos, mas também pode expor e explicar uma doença uncharacterized subjacente. Os protocolos descritos aqui fornecer uma maneira simples, mas poderosa para isolar partículas virais (VLPs) a partir de amostras que consistem em grandes quantidades de muco espesso, de acolhimento e células microbianas, DNA livre, bem como restos celulares. Complementando metagenômica, metatranscriptomics é usado para monitorar a dinâmica na expressão gênica em toda a comunidade microbiana e o anfitrião 9,23. Neste caso, tanto microbiana e host ARNm devem ser preferencialmente seleccionado. Uma vez que os mRNAs não estão poliadenilados bacterianas, um ARNm método suspenso baseado em oligo-dT, não pode ser explorado. Amplificação de ARN dependente de poliadenilação não pode ser utilizado em amostras associadas hospedeiras-se as amostras são conhecidas por conter grandes quantidades de ARNm eucariota. Muitas amostras associado a animais, expectoração de FQ, contêm uma elevada densidade de células, para além de grandes quantidades de detritos celulares e nucleases que incluem as RNases. Assim, outro desafio é evitar uma forte degradação do RNA durante metatranscriptome processamento. Na maioria dos casos, o RNA total extraído de expectoração CF é parcialmente degradado, o que limita as aplicações a jusante e utilidade do ARN derivado. Nos últimos anos, várias abordagens para a depleção de ARNr foram desenvolvidos e adaptados em kits disponíveis comercialmente. A eficácia dessas abordagens se limita, contudo, especialmente quando se trabalha com parcialmente degradada rRNA 9,24. Os métodos empregados aqui permitired para a recuperação de RNA total parcialmente degradada adequado para jusante remoção total rRNA eficiente. A comparação directa da eficiência de remoção de rRNA a partir de ARN total parcialmente degradado comparando dois conjuntos diferentes foi ilustrada por Lim et ai. (2012) 9. No geral, o objetivo deste artigo é o de fornecer um conjunto completo de protocolos (Figura 1) para gerar metagenomes espingarda virais e microbianas, e um metatranscriptome, a partir de uma única amostra associada ao animal, utilizando amostra de escarro induzido como um exemplo. Fluxo do laboratório molecular deverá incluir as áreas de pré e de pós-amplificação separados para minimizar a contaminação cruzada. Os métodos são facilmente adaptáveis ​​a outros tipos de amostras, tais como o tecido 22, nasofaringe e orofaringe cotonetes 25, a lavagem broncoalveolar (BAL) e de coral (dados não publicados). Cada amostra deve ser processado imediatamente após a coleta, especialmente quando metagenomics microbianas e conheceuatranscriptomics estudos são desejados. Se as amostras foram congeladas, que limita o isolamento de células microbianas intactas para metagenomes microbianos como o congelamento potencialmente romper a integridade da célula. No entanto, o congelamento não exclui metatranscriptomics e isolamento viral, mas a qualidade do ARN e da quantidade de partículas virais recuperados podem ser afectadas pelo processo de congelação-descongelação. É importante notar que a expectoração induzida tem servido como fonte primária de amostras em muitos estudos associados a pacientes adultos e outras doenças pulmonares crônicas 26,27 como BAL pode ser muito invasivo. Em nossos estudos, amostras de escarro foram coletadas com um método de amostragem cuidadosa e consistente, ou seja, na sequência de bochechos e lavagem da cavidade oral, utilizando solução salina estéril para manter a contaminação micróbios orais dentro das amostras de escarro para um mínimo.

<table><tbody><tr><td>Tampão de lise de RNA à base de isotiocianato de guanidina</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td>TRIzol LS Reagent foi usado neste estudo</td></tr><tr><td>Grânulos de sílica; 0,1 a 0,15 mm</td><td>Cole-Parmer</td><td>YO-36270-62</td><td>Grânulos de silicato de zircônia foram usados neste estudo</td></tr><tr><td>Ditiotreitol, grau molecular (pó seco)</td> <td>Promega</td><td>V3155</td><td>Pode ser adquirido de qualquer outra empresa</td></tr><tr><td>Filtro de seringa estéril; 0,45 &micro; membrana PVDF hidrofílica de tamanho de poro</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>enzima DNase I&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa estéril; 0,02 &micro; m tamanho do poro</td><td>FisherScientific</td><td>09-926-13</td><td>Diâmetro: 25 mm</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga ultra-claros</td><td>Beckman</td><td>344059</td><td>9/16 x 3 &frac12; pol. (14 x 90 mm), adequado para rotor SW41 Ti e VLPs ultracentrifugação com gradiente de densidade</td></tr><tr><td>SW41 Ti Rotor</td><td>Beckman</td><td>333790</td><td></td></tr><tr><td>SS-34 rotor de ângulo fixo</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 DNA polimerase</td><td>Monserate Biotech</td><td>4001</td><td>10 U/&micro; l</td></tr><tr><td>Phi29 Hexâmero Aleatório</td><td>Thermo Scientific</td><td>S0181</td><td>Comprado anteriormente da Fidelity Systems</td></tr><tr><td>Filtro de matriz de alumina com anel de suporte de polipropileno anular; 0.02 &micro; m tamanho do poro</td><td>FisherScientific</td><td>09-926-34</td><td>As membranas de filtro Whatman Anodisc foram usadas neste estudo; diâmetro 25 mm</td></tr><tr><td>SYBR Gold ácido nucleico gel mancha</td><td>Life Technologies</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DNase livre de RNase I&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td>Pode ser adquirido de qualquer outra empresa</td></tr><tr><td>Glicogênio, grau de RNA</td><td>FisherScientific</td><td>FERR0551</td><td>Pode ser adquirido de qualquer outra empresa</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de alta velocidade Oak Ridge</td><td>FisherScientific</td><td>05-562-16B</td><td>Para procedimento de extração de DNA de grande volume, adequado para rotor de ângulo fixo SS-34</td></tr><tr><td>Kit de remoção total de rRNA</td><td>Epicentro</td><td>MRZE724</td><td>O Kit Completo de Ouro ScriptSeq (Epidemiologia) pode ser usado para acoplar a remoção de rRNA com a preparação da biblioteca de sequenciamento</td></tr><tr><td>Cloreto de césio&nbsp;</td>Brometo de hexadecitrimetil-amônio (CTAB) <td>FisherScientific</td><td>BP1595-500</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5882-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

purificando o impure: sequenciação metagenomes e metatranscriptomas do complexo amostras associadas a animais

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

A acessibilidade de high-throughput seqüenciamento revolucionou muitas áreas da biologia. A fim de entender melhor as comunidades microbianas associadas virais e do hospedeiro, um fluxo de trabalho abrangente para a extração de DNA e RNA foi desenvolvido. O fluxo de trabalho ao mesmo tempo gera metagenomes virais e microbianas, assim como metatranscriptomas, a partir de uma única amostra para o sequenciamento de próxima geração. O acoplamento destas abordagens fornece uma visão geral de ambas as características taxonómicas e as funções de comunidade codificado. Os métodos apresentados usar Fibrose Cística (FC) expectoração, um tipo de amostra problemático, porque é extremamente viscosa e contém uma quantidade elevada de mucinas, ADN livre de neutrófilos, e outros contaminantes desconhecidos. Os protocolos descritos aqui direcionar esses problemas e com sucesso recuperar DNA viral e microbiana com a contaminação de DNA humano mínima. Para complementar os estudos Metagenômica, um protocolo metatranscriptomics foi otimizado para recuperar tanto microbianae mRNA host que contém relativamente poucas seqüências de RNA ribossômico (rRNA). Uma visão geral das características dos dados é apresentada para servir de referência para avaliar o sucesso dos métodos. Amostras adicionais CF escarro também foram coletadas para (i) avaliar a consistência dos perfis microbioma em sete dias consecutivos dentro de um único paciente, e (ii) comparar a consistência da abordagem metagenômica para a sequenciação à base de gene 16S RNA ribossomal. Os resultados mostraram que a flutuação diária das perfis microbianas sem perturbação antibiótico foi mínimo e os perfis de taxonomia das bactérias comuns associadas CF eram altamente semelhantes entre as bibliotecas 16S rDNA e metagenomes gerados a partir do DNA -derived lise hipotônica (HL). No entanto, as diferenças entre os perfis taxonómicas 16S rDNA gerado a partir de ADN total e HL-ADN derivado sugerem que a lise hipotónica e os passos de lavagem em beneficiar não só a remoção do ADN de origem humana, mas também extracellul-microbiana derivadaDNA ar que podem deturpar os perfis microbianos reais.

Utilizando a via aérea fibrose cística como um exemplo, o manuscrito apresenta um fluxo de trabalho global que compreende uma combinação de abordagens metagenômicas metatranscriptomic e caracterizar a comunidades microbianas e virais em amostras associado a animais.

Purificando o Impure: Sequenciação metagenomes e metatranscriptomas do Complexo amostras associadas a animais

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

O objetivo geral deste procedimento é coletar e processar amostras complexas associadas ao hospedeiro, como escarro de fibrose cística, para estudar as comunidades virais e microbianas usando abordagens metagenômicas e metatranscriptômicas. Isso é feito primeiro fazendo com que o sujeito inale solução salina hipertônica a 7% por meio de um nebulizador e, em seguida, colete amostras de escarro induzido durante um período de 30 minutos. Em seguida, a amostra é imediatamente homogeneizada e igualmente distribuída em quatro tubos rotulados como metagenoma viral, metagenoma microbiano, metatranscriptoma e escarro extra.Em seguida, o tubo de metatranscriptoma é selado, colocado horizontalmente e o escarro homogeneizado em velocidade média por 10 minutos. Finalmente, alíquotas individuais são processadas separadamente para isolar e purificar células virais ou bacterianas antes do isolamento de ácido nucleico para estudos metagenômicos. Em última análise, os ácidos nucléicos isolados são usados para preparação de bibliotecas de sequenciamento de alto rendimento para gerar bibliotecas metagenômicas e metatranscriptômicas.A principal vantagem deste procedimento é que ele fornece um fluxo de trabalho abrangente para processar amostras complexas associadas ao hospedeiro para o estudo de comunidades virais e bacterianas no nível de DNA e RNA. A demonstração visual deste procedimento é crítica, pois as etapas de pré-tratamento da amostra são importantes para garantir o manuseio adequado da amostra, enquanto as etapas de purificação de células virais e microbianas são difíceis de aprender Devido à complexidade do procedimento Antes da coleta da amostra, rotule quatro tubos de 15 mililitros por amostra com o seguinte, o primeiro com metagenoma viral, o segundo como metagenoma microbiano número três com metatranscriptoma e tubo número quatro como escarro extra. Adicione dois mililitros de esferas de sílica de 0,1 milímetro no tubo rotulado como metatranscriptoma, seguido por seis mililitros de tampão de lise de RNA à base de isotiocianato de guiné, ou tampão de lise GITC.Seguindo o procedimento de coleta de amostras descrito no protocolo de texto e usando copos de amostra pré-wade, estime o volume da amostra pesando o copo após a coleta da amostra e subtraia o peso do copo vazio. Para o peso restante, um grama equivalerá a um mililitro de amostra. Se o volume da amostra for inferior a oito mililitros, adicionar o volume adequado de 0,02 micrómetros filtrado um XPBS para elevar o volume final a oito mililitros.Em seguida, use imediatamente uma seringa de três mililitros para homogeneizar a amostra até que nenhum aglomerado visível permaneça dentro do escarro, usando a mesma seringa, retire imediatamente dois mililitros de escarro e injete-o no tubo de microtranscriptoma contendo esferas de sílica e tampão de lise GITC. Feche a tampa e use filme para selar a tampa com segurança Para evitar vazamentos, use um vórtice, senhor para homogeneizar imediatamente o escarro em velocidade média por 10 minutos. Usando a mesma alíquota de seringa, dois mililitros de escarro cada um nos tubos rotulados como metagenoma vira e metagenoma microbiano, e transfira o escarro restante do copo de escarro para o tubo rotulado como escarro extra.Armazene todos os tubos a quatro graus Celsius ou no gelo e transporte para o laboratório, se necessário, para gerar um metagenoma viral. Após a preparação de tampões e soluções. Pré-trate as amostras adicionando tampão de magnésio salino filtrado de 0,02 micrômetro a um volume total de seis mililitros.Para ajudar na dissolução do muco, adicione seis mililitros de 6,5 milimolares de DTT a cada amostra. Vórtice vigorosamente para misturar e incubar por uma hora a 37 graus Celsius. Depois de um vórtice vigoroso, as amostras giram novamente a 3056 Gs e 10 graus Celsius por 15 a 20 minutos.Recolher cada sobrenadante num novo tubo de 15 mililitros. Em seguida, use um filtro de ponto 45 micrômetros montado em uma seringa para filtrar os sobrenadantes em novos tubos de 15 mililitros. Remova 100 microlitros de amostra em um tubo de micro fuge e, em seguida, execute o tratamento com clorofórmio.Extrair o sobrenadante e realizar um tratamento DN um. Adicione um volume igual de 4% para de formaldeído para fixar a amostra. Para microscopia de epifluorescência, consulte o protocolo de texto para uma abordagem abrangente de enriquecimento de partículas virais.Caso contrário, usando soluções de cloreto de césio recém-preparadas, estabeleça um gradiente de cloreto de césio carregando um mililitro de 1,7 gramas por mililitro de solução de cloreto de césio em cada tubo, seguido por um mililitro de 1,5 gramas por mililitro, um mililitro de um vírgula 35 gramas por mililitro e, finalmente, um mililitro de 1,2 gramas por mililitro de solução de cloreto de césio. Finalmente, carregue de seis a oito mililitros de amostra em tubos de gradiente individuais. Marque camadas individuais para indicar a localização de cada fração.Em seguida, equilibre cada par oposto de dois com um miligrama. Trave cuidadosamente cada tubo no balde de centrifugação. Carregue no rotor e centrifugue a 82.844 Gs e quatro graus Celsius por duas horas.Após a centrifugação, remova cuidadosamente os tubos do suporte sem interromper os gradientes de densidade com uma agulha de calibre 18 conectada a uma seringa de três mililitros. Certifique-se de que a extremidade aberta da agulha esteja voltada para cima. Perfure o tubo logo abaixo da camada de densidade de 1,5 grama por mililitro e puxe lentamente aproximadamente 1,5 mililitro de solução para a seringa.Remova lentamente a agulha e deixe a fração restante no tubo pingar em um novo tubo de 15 mililitros através da punção. Rotule isso como cintura de fração superior Transfira a solução na seringa contendo o V ps em dois novos tubos de microfuga. Uma vez preparados os tampões e as soluções, de acordo com o protocolo de texto, adicionar cinco volumes de XPBS filtrado por micrômetro de ponto 22 Para diluir cada homogenato sob uma coifa química, adicionar etanol beta MAR capta a uma concentração final de 2% volume a volume e agitar a mistura à temperatura ambiente por duas horas após a incubação.Gire a amostra a 3056 GS e 10 graus Celsius por 15 minutos. Depois de descartar o sobrenadante, use 10 mililitros de água de grau molecular para ressuspender o pellet e incubar em temperatura ambiente por 15 minutos antes de repetir a lavagem. Após uma centrifugação final, e uma vez que o SUP natin tenha sido descartado, use cinco mililitros de um tampão XDNA para ressuspender o pellet antes de adicionar 15 microlitros de ds.Um por mililitro de amostra Incubar a 37 graus Celsius com mistura repetida por duas horas. Depois de girar as amostras e descartar o snat, use 10 mililitros de tampão SE para ressuspender o pellet. Em seguida, gire a amostra e repita a lavagem.Use dois mililitros de tampão SE para ressuspender o pellet e transfira a suspensão para dois tubos de micro fuge. Em seguida, gire os tubos a 16.000 GS em temperatura ambiente por 15 minutos. Finalmente, após remover o sobrenadante, use um kit de extração de DNA genômico seguindo as instruções para bactérias gram-positivas.Para isolar o DNA, os resultados anteriores para gerar metagenomas virais são resumidos aqui. Os viromas contêm poucas sequências derivadas de humanos, com apenas uma amostra contendo 70% de amostra de DNA humano CCF quatro A foi omitido da etapa de ultracentrifugação do gradiente de densidade e, como resultado, continha mais de 97% de sequências derivadas de humanos. Esta figura mostra uma imagem fluorescente de uma amostra típica de escarro de FC antes e depois da ultracentrifugação com gradiente de densidade.Vlp claro foi observado na ausência de partículas grandes após a separação do gradiente de densidade vista aqui. Sete amostras diárias de escarro foram coletadas de um único paciente com fibrose cística que iniciou antibióticos orais. Após o terceiro dia de coleta, o rendimento total de lise hipotônica derivada ou DNA HL coletado de cada amostra variou de 210 nanogramas a mais de cinco microgramas de bibliotecas de sequenciamento Illumina geradas para cada amostra.Todas, exceto uma biblioteca, renderam mais de 1 milhão de sequências e mais de 85% de sequências de alta qualidade foram retidas no pré-processamento de dados. Usando o software de seqüência de impressão, a quantidade total de sequências derivadas de humanos variou de 14% a 46% Como mostrado aqui, os perfis microbianos das subamostras são altamente semelhantes às amostras após dois tratamentos de lise hipotônica. Além disso, a segunda lise hipotônica aumenta a fração de sequências não humanas em seis a 17% dentro dos metagenomas.Não se esqueça de que trabalhar com amostras clínicas e patógenos em potencial pode ser extremamente perigoso. O equipamento de proteção individual deve sempre ser usado durante o manuseio da amostra. Boas técnicas de biologia molecular e microbiologia são necessárias durante a execução deste procedimento para garantir que não haja contaminação.Após este procedimento, você deve ser capaz de realizar estudos metagenômicos virais e microbianos, bem como metatranscriptômicos de amostras complexas, como escarro de FC.

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Biology

Biologia

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