Vivo-imaging da Drosophila Pupal Eye

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um método eficiente para gerar imagens ao vivo Isso é feito removendo primeiro o permanente O da caixa da pupila e rasgando ao longo do lado para expor o neuro epitélio de um olho. O segundo passo é montar um equipamento de imagem e montar a pupa em uma pequena gota de vaselina.

Em seguida, seções seriadas do neuroepitélio na região do cinturão de adesão são adquiridas usando um microscópio de fluorescência padrão. A etapa final é estabilizar a filmagem e fazer ajustes de cor no software de edição de imagem padrão. Em última análise, a imagem de células vivas do neuroepitélio da drosófila é usada para elucidar os comportamentos celulares desse padrão.

A demonstração visual do olho deste método é crítica, pois dissecar parcialmente uma pupa e, em seguida, montá-la corretamente no equipamento de imagem pode ser complicado porque os pupi são bastante frágeis nesta fase. Além disso, a orientação correta da pupa e a colocação correta da lamínula acima do epitélio ocular são essenciais para o sucesso da imagem. Demonstrando o procedimento estará Mark Hellerman do nosso laboratório.

Para iniciar o experimento, selecione pré-pús brancos de genótipos previamente cruzados e coloque-os em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, coloque um pedaço de tecido de 10 centímetros quadrados embebido em água destilada em uma caixa de ponta de plástico limpa. Insira os tubos da microcentrífuga na caixa de pontas.

O tecido úmido evitará a dessecação do pupi e, em seguida, incubará a 25 graus Celsius por 17 a 25 horas. Após a incubação, coloque um pedaço de fita dupla face fresca em uma placa de dissecação de charuto preto. Posicione o lado dorsal da pupa para cima na fita e certifique-se de que a cabeça da pupa esteja presa à fita dupla face sem aderir às regiões torácica e abdominal da pupa.

Usando uma pinça, levante e remova cuidadosamente o permanente A para expor a cabeça da pupila. Em seguida, rasgue ao longo do lado da caixa da pupila. Para expor a área ao redor de um olho, remova suavemente a pupila da fita adesiva.

Construa a pequena moldura de 15 milímetros quadrados com papel mata-borrão e faça um furo de cinco milímetros no meio. Mergulhe a moldura e a água destilada e coloque-a no centro de um microscópio. Deslize com uma seringa de 30 cc.

Esprema um anel uniforme de vaselina para envolver a moldura do papel mata-borrão. Em seguida, adicione uma pequena gota de vaselina diretamente na lâmina. Disponha cuidadosamente a pupa de lado e apoie-a com a conta de vaselina.

Coloque uma lamínula no topo do anel de vaselina de modo que ele entre em contato com o epitélio acima do olho. Comprima suavemente a preparação para selar a lamínula contra a vaselina e gerar uma pequena superfície de contato plana entre a região dos olhos da pupila e a imagem da lamínula, a preparação da pupila. Usando um microscópio fluorescente, capture cortes seriados através do domínio AAL do olho, neuro epitélio na região da junção de aderência a cada sete minutos.

Use o software de deconvolução apropriado para reduzir o fundo e melhorar o contraste das imagens da seção serial para cada arquivo Zack e software LASAF. Navegue até o painel de ferramentas. Selecione Deconvolução 3D e clique em aplicar.

Gere uma projeção máxima ou imagem MP para cada arquivo de pilha complicado. Alinhe cada imagem MP para destacar comportamentos celulares individuais e reduzir as distrações causadas pelo crescimento do organismo. Usando os algoritmos integrados no Photoshop CS cinco na guia de arquivo do menu principal, abra scripts e selecione carregar arquivos na pilha.

Em seguida, importe os arquivos de imagem MP para o painel de camadas de carga. Certifique-se de que a opção tentar alinhar automaticamente as imagens de origem não esteja selecionada. Caso contrário, os dados da imagem podem ficar distorcidos.

Depois que todos os arquivos MP forem carregados no painel de camadas, verifique se todas as imagens estão em ordem cronológica e se o ponto de tempo mais antigo está na parte superior da camada. Empilhe, arraste e solte-os até que sejam ordenados corretamente. Se necessário, selecione alinhar camadas automaticamente.

Escolha reposicionar e clique em OK. Fora de foco, as regiões de uma imagem MP inicial podem ser corrigidas para produzir um campo retiniano uniformemente focado. Para iniciar o processamento da imagem, use a função de corte no LAS.

O Saf restringe manualmente as fatias inicial e final, de modo que elas abrangem apenas a esteira de adesão dentro da região inicialmente fora de foco. Clique em aplicar para gerar um novo arquivo de pilha otimizado para essa região. Em seguida, gere uma nova projeção máxima para a pilha otimizada localmente e exporte-a como um arquivo TIF no Photoshop.

Abra scripts e selecione carregar arquivos na pilha. Em seguida, insira o arquivo MP inicial e o arquivo MP otimizado no painel de camadas de carga. Novamente, certifique-se de que a opção tentativa de alinhar automaticamente as imagens de origem não esteja selecionada e selecione OK.

Selecione ambas as camadas e escolha camadas de mesclagem automática para produzir um campo retiniano uniformemente focado. Salve esta imagem composta como um arquivo TIF. Use uma ferramenta de transformação para girar as imagens de modo que o eixo ventral dorsal da retina fique alinhado ao eixo Y do quadro do filme.

Use o ajuste de nível de quadros individuais para aumentar o contraste entre a membrana celular e o corpo celular. Em seguida, selecione criar quadros a partir de camadas para converter as imagens em um filme. Observe que as camadas são adicionadas ao painel de animação em ordem sequencial, começando na parte inferior da pilha.

Para inverter a ordem das pilhas, selecione todos os quadros e, em seguida, selecione quadros reversos. Selecione o tempo de atraso do quadro de 0,8 segundos para cada quadro e escolha QuickTime. Exporte e selecione o formato de vídeo desejado.

Por fim, em opções de renderização, selecione a taxa de quadros como personalizada e insira uma taxa de quadros de 15. Em seguida, clique em renderizar. Um gradiente de desenvolvimento pronunciado foi observado em todo o olho com esta técnica, o que levou a descrições detalhadas do padrão ocular.

Durante o envoltório primário, duas células foram recrutadas como primárias, que rapidamente circundaram os feixes fotorreceptores conectando-se uns aos outros para formar junções estáveis. As células intero materiais indiferenciadas estavam em um padrão desorganizado à medida que as primárias eram enroladas e seladas. Cada feixe de fotorreceptores movimentos celulares locais reorganizados.

As células iniais agrupadas nos lados dorsal e ventral de cada oma. A intercalação entre células reorganizou as células de duas linhas em uma única linha. Após a intercalação, a competição terciária foi capturada ao microscópio.

As células concorrentes ocuparam o nicho terciário por cinco a 10 minutos antes do deslocamento. Eventualmente, uma única célula estabeleceu o nicho terciário estável. Durante a poda final, uma onda de apoptose reduziu o número de ICS ao mínimo necessário para gerar com eficiência uma rede de células de material de entrada no olho composto.

Uma vez dominado, o imageamento do EPI pode ser feito em quatro horas se realizado corretamente. O processamento de imagem subsequente leva cerca de uma hora.