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Advanced Biology

Uma Introdução à Neurociência Celular e Molecular

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Neuroscience

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JoVE Science Education Neuroscience

An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience

1.9: fMRI: Functional Magnetic Resonance Imaging

1.15: An Introduction to Developmental Neurobiology

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11:25 min

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April 30, 2023

Overview

A neurociência celular e molecular é uma das subdisciplinas mais recentes e de crescimento mais rápido da neurociência. Ao investigar as influências dos genes, moléculas de sinalização e morfologia celular, pesquisadores neste campo descobrem insights cruciais sobre o desenvolvimento e a função do cérebro normal, bem como as causas básicas de muitas condições patológicas.

Esta introdução em vídeo ao fascinante mundo da neurociência celular e molecular começa com uma linha do tempo de estudos marcantes, desde a descoberta do DNA em 1953 até avanços mais recentes, como a clonagem de canais de íons. Em seguida, são introduzidas questões-chave no campo, como como os genes influenciam a atividade dos neurônios e como o sistema nervoso é modificado pela experiência. Isso é seguido por breves descrições de alguns métodos proeminentes usados para analisar material genético em neurônios, manipular a expressão de genes e visualizar neurônios e suas partes. Finalmente, várias aplicações da neurociência molecular e celular são apresentadas para demonstrar como abordagens celulares e moleculares podem ser usadas para traçar o perfil das populações de neurônios e explorar suas funções.

Procedure

Os reflexos mais simples das experiências emocionais mais sublimes estão todos enraizados em estruturas moleculares, genéticas e celulares no cérebro. Como um dos mais novos campos da neurociência, a neurociência celular e molecular aproveita a biologia molecular para explorar como genes, moléculas de sinalização e morfologia celular influenciam o sistema nervoso

Este vídeo apresentará descobertas marcantes no campo, abordará questões-chave na pesquisa de neurociência celular e molecular e finalmente mostrará alguns métodos proeminentes que podem ser aplicados para responder a essas perguntas.

Vamos começar por dar uma olhada nas raízes científicas deste campo relativamente jovem.

Antes havia técnicas moleculares, anatomistas e biólogos celulares dominavam a história inicial da neurociência.

No entanto, na década de 1930, um fluxo de físicos, químicos e teóricos para as fileiras de biólogos iniciou a revolução molecular, culminando na descoberta de Watson e Crick da estrutura de DNA e na formalização do dogma central, que explica como o DNA codifica as proteínas que agem como unidades funcionais das células. Pela primeira vez, os neurocientistas foram capazes de investigar o papel de genes e proteínas específicos desempenhados na função do sistema nervoso.

Por exemplo, na década de 1960, Seymour Benzer foi capaz de conectar mudanças comportamentais em moscas de frutas a mutações genéticas específicas, identificando genes-chave expressos em neurônios que controlam o comportamento, como a locomoção.

No mesmo período, Eric Kandel demonstrou que processos complexos como o aprendizado também tinham uma base molecular. Usando o molusco marinho Aplysia, ele analisou extratos de tecido neuronal, e implicou a molécula de sinalização intracelular cíclica AMP em um caminho crítico para o aprendizado.

Então, na década de 1980, membros do laboratório de Shosaku Numa foram os primeiros a clonar moléculas-chave na função neurônio, como o canal de sódio fechado de tensão. Análises dos domínios funcionais dentro dessas grandes proteínas de membrana melhoraram desde então nossa compreensão de como o controle dos movimentos de íons leva ao disparo de neurônios.

Outra descoberta importante nos mecanismos moleculares por trás da comunicação neuronal veio na década de 1990, quando Thomas Sudhof descobriu que íons de cálcio alteram a forma de proteínas que ancoram vesículas cheias de neurotransmissores à membrana celular, explicando como os potenciais de ação levam à liberação precisamente cronometrada de sinais químicos na sinapse.

Da neurofisiologia ao comportamento, as descobertas na neurociência molecular melhoraram nossa compreensão de muitas disciplinas neurocientíficas.

Apesar dessa história produtiva, ainda há muito o que aprender! Vamos rever algumas perguntas que estão sendo feitas nos laboratórios hoje.

Uma área de pesquisa pergunta quais genes influenciam a função neuronal. Por exemplo, as expansões de nucleotídeos em genes específicos são conhecidas por estarem envolvidas em várias doenças caracterizadas pelo declínio constante da saúde dos neurônios, como a doença de Huntington.

Outro grupo de genes sob investigação codifica fatores de transcrição: proteínas que regulam a expressão de genes específicos. Identificar os alvos de DNA de fatores de transcrição específicos do sistema nervoso pode nos dar uma visão melhor do programa genético que nos faz pensar.

Alternativamente, neurocientistas podem perguntar como as moléculas regulam o comportamento neuronal. Por exemplo, eles podem estudar o maquinário molecular que regula os movimentos de íons através da membrana celular, resultando na propagação de potenciais de ação. Pesquisas aqui nos deram anestésicos como lidocaína, que bloqueia canais específicos de íons e interrompe a transmissão de sinais de dor para o cérebro.

Alternativamente, os cientistas podem examinar os locais de interação entre os neurônios, conhecidos como sinapse. Aqui, eles podem perguntar quais moléculas estão envolvidas na preservação da integridade da sinapse, e como essas conexões podem ser restauradas em estados de doenças.

Plasticidade neuronal é a capacidade do sistema nervoso de se adaptar quimicamente e fisicamente em resposta à experiência. Algumas pesquisas neste campo são focadas em mudanças morfológicas dependentes da experiência em estruturas neuronais elaboradas, conhecidas como arbóreas dendríticas, que formam sinapses através de estruturas altamente dinâmicas referidas como espinhas dendríticas. Outros estão interessados em como a experiência pode modificar a distribuição de receptores neurotransmissores em membranas sinápticas, o que pode fortalecer o poder de sinalização de uma sinapse em um fenômeno conhecido como potencialização a longo prazo, ou LTP.

Como você pode ver, neurocientistas celulares e moleculares abordam a neurobiologia a partir de uma visão microscópica, mas a gama de processos que eles estudam é expansiva.

Agora que você está familiarizado com algumas das perguntas emocionantes que são feitas em laboratórios de neurociência celular e molecular, vamos olhar para as ferramentas disponíveis para respondê-las.

Primeiro, para investigar o controle genético da função dos neurônios, os cientistas têm técnicas muito poderosas à sua disposição. Por exemplo, microarrays podem quantificar a expressão de um grande número de genes simultaneamente. Uma microarray é uma superfície com dezenas de milhares de trechos de “sondas” de DNA encalhados. O material genético extraído de um neurônio é permitido se ligar às sondas, e marcadores fluorescentes são usados para visualizar precisamente quais sequências estão presentes na amostra.

Alternativamente, pcr em tempo real ou quantitativo, utiliza equipamentos que podem medir indiretamente a quantidade relativa de transcrições específicas de mRNA através de um método baseado em PCR. Esta abordagem é extremamente útil para detectar os níveis de expressão de genes individuais.

Por último, mas não menos importante, a tecnologia transgênica é uma ferramenta importante para a investigação da função genética no sistema nervoso. Por este método, os pesquisadores podem produzir animais com porções de seus genomas removidos, conhecidos como nocautes, ou com genes modificados inseridos em seu código genético, conhecidos como transgênicos. Os tecidos do sistema nervoso desses animais podem ser analisados de várias maneiras de determinar como as mudanças na expressão genética afetam a função celular.

Para estudar o controle molecular da sinalização neuronal, os pesquisadores muitas vezes preferem estudar tecido cerebral fora do animal, seja em pequenos pedaços de tecido ou em células dissociadas cultivadas in vitro chamadas culturas neuronais primárias. Uma vantagem desse sistema simplificado é a capacidade de manipular eficientemente a expressão de genes de interesse na sinalização neuronal por transfecção. Os resultados dessas manipulações genéticas podem então ser observados pela visualização da localização de proteínas, análise da morfologia celular ou registros eletrofisiológicos.

Por fim, avanços dramáticos na tecnologia de imagem estão permitindo que os cientistas estudem a plasticidade neuronal de novas maneiras excitantes. Por exemplo, os pesquisadores podem usar microscopia de dois fótons para visualizar camadas profundas de tecidos vivos em grande detalhe. Depois de criar uma “janela” no crânio, essa técnica pode ser usada para imagem da morfologia das células cerebrais antes e depois dos animais passarem por uma experiência, permitindo que os pesquisadores vejam como é o aprendizado no nível neuronal.

Ferramentas de imagem também são usadas para investigar componentes moleculares do sistema nervoso em tecidos preservados. A microscopia de fluorescência é frequentemente usada em combinação com a imunohistoquímica, na qual as amostras são manchadas com anticorpos fluorescentes que marcam a localização celular de proteínas específicas.

Tendo revisado tanto questões importantes quanto as ferramentas usadas para respondê-las, vamos olhar para algumas aplicações de pesquisa de neurociência celular e molecular.

Primeiro, aplicando técnicas de microarray a uma pequena população de neurônios, os pesquisadores podem examinar as diferenças na expressão de vários genes em subtipos neuronais específicos. Aqui, foram extraídos neurônios únicos da retina e extraído do RNA celular, permitindo aos pesquisadores traçar o perfil da expressão de mRNAs a partir de células com diferentes características funcionais e morfológicas.

Técnicas moleculares também podem ser aplicadas para entender melhor a resposta do sistema nervoso à lesão. Quando gânglios de raiz dorsal, ou DRGs, são removidos de camundongos adultos para cultura neuronal primária, os axônios são necessariamente cortados. Transfectando os neurônios DRG dissociados com construções de silenciamento genético, é possível testar o efeito de proteínas individuais no recrescimento de novos axônios.

Técnicas especializadas de imagem podem ser usadas para estudar como proteínas como receptores neurotransmissores são transportadas de e para a membrana sináptica. Neste experimento, neurônios cultivados foram transfectados com um gene codificando uma proteína de membrana marcada fluorescentemente. Usando um microscópio confocal, pequenas regiões da membrana foram então fotobleachadas, o que significa que os fluoroforos naquela área foram destruídos. Com o esquema de branqueamento utilizado aqui, a recuperação progressiva da fluorescência, ou FRAP, reflete o transporte de novas proteínas fluorescentes para a membrana plasmática. A taxa em que esse movimento ocorre pode ser quantificada e comparada em muitas condições experimentais.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à neurociência celular e molecular. Neste vídeo discutimos as descobertas históricas que fizeram da neurociência celular e molecular o campo que é hoje, algumas questões-chave no campo, e as técnicas usadas para respondê-las.

Como sempre, obrigado por assistir JoVE Science Education!

Transcript

The simplest reflexes to the most sublime emotional experiences are all rooted in molecular, genetic and cellular structures in the brain. As one of the newest fields in neuroscience, cellular and molecular neuroscience leverages molecular biology to explore how genes, signaling molecules, and cellular morphology influence the nervous system

This video will present landmark discoveries in the field, address key questions in cellular and molecular neuroscience research, and finally showcase a few prominent methods that can be applied to answer those questions.

Let’s begin by taking a look back at the scientific roots of this relatively young field.

Before there were molecular techniques, anatomists and cell biologists dominated the early history of neuroscience.

However, in the 1930s, an influx of physicists, chemists and theoreticians into the ranks of biologists started the molecular revolution, culminating in Watson and Crick’s discovery of DNA structure and the formalization of the central dogma, which explained how DNA encodes the proteins that act as the functional units of cells. For the first time, neuroscientists were able investigate the role specific genes and proteins played in nervous system function.

For example, in the 1960s, Seymour Benzer was able to connect behavioral changes in fruit flies to specific genetic mutations, identifying key genes expressed in neurons controlling behavior, like locomotion.

In the same time period, Eric Kandel demonstrated that complex processes like learning also had a molecular basis. Using the marine mollusk Aplysia he analyzed neuronal tissue extracts, and implicated the intracellular signaling molecule cyclic AMP in a pathway critical to learning.

Then, in 1980s, members of Shosaku Numa’s lab were the first to clone key molecules in neuron function, like the voltage gated sodium channel. Analyses of the functional domains within these large membrane proteins have since improved our understanding of how the control of ion movements leads to neuron firing.

Another important discovery in the molecular mechanisms behind neuronal communication came in the 1990s, when Thomas Sudhof discovered that calcium ions alter the shape of proteins that anchor neurotransmitter-filled vesicles to the cell membrane, explaining how action potentials lead to the precisely timed release of chemical signals into the synapse.

From neurophysiology to behavior, discoveries in molecular neuroscience have improved our understanding of many neuroscientific disciplines.

In spite of this productive history, there’s still a lot to learn! Let’s review some questions that are being asked in labs today.

One area of research asks which genes influence neuronal function. For example, nucleotide expansions in specific genes are known to be involved in several diseases characterized by steady decline of neuron health, like Huntington’s disease.

Another group of genes under investigation encode transcription factors: proteins that regulate the expression of specific genes. Identifying the DNA targets of nervous system-specific transcription factors can give us a better view of the genetic program that makes us think.

Alternatively, neuroscientists may ask how molecules regulate neuronal behavior. For example they may study the molecular machinery that regulates ion movements across the cell membrane, resulting in the propagation of action potentials. Research here has given us anesthetics like lidocaine, which blocks specific ion channels and halts transmission of pain signals to the brain.

Alternatively, scientists may examine the sites of interaction between neurons, known as the synapse. Here, they may ask what molecules are involved in preserving the integrity of the synapse, and how these connections can be restored in disease states.

Neuronal plasticity is the ability of the nervous system to chemically and physically adapt in response to experience. Some research in this field is focused on experience-dependent morphological changes in elaborate neuronal structures, known as dendritic arbors, that form synapses via highly dynamic structures referred to as dendritic spines. Others are interested in how experience can modify the distribution of neurotransmitter receptors on synaptic membranes, which can strengthen the signaling power of a synapse in a phenomenon known as long term potentiation, or LTP.

As you can see, cellular and molecular neuroscientists approach neurobiology from a microscopic view, but the range of processes they study is expansive.

Now that you’re familiar with some of the exciting questions that are asked in cell and molecular neuroscience labs, let’s look at the tools available to answer them.

First, to investigate the genetic control of neuron function, scientists have some very powerful techniques at their disposal. For example, microarrays can quantify the expression of a huge number of genes simultaneously. A microarray is a surface with tens of thousands of snippets of single stranded DNA “probes” attached to it. Genetic material extracted from a neuron is allowed to bind to the probes, and fluorescent markers are used to visualize precisely which sequences are present in the sample.

Alternatively, real-time or quantitative PCR, utilizes equipment that can indirectly measure the relative quantity of specific mRNA transcripts via a PCR based method. This approach is extremely useful for detecting the expression levels of individual genes.

Last but not least, transgenic technology is an important tool for the investigation of gene function in the nervous system. By this method, researchers can produce animals with portions of their genomes removed, known as knockouts, or with modified genes inserted into their genetic code, known as transgenics. Nervous system tissues from these animals can be analyzed in a variety of ways to determine how changes in gene expression impact cellular function.

To study the molecular control of neuronal signaling, researchers often prefer to study brain tissue outside of the animal, either in small tissue pieces or in dissociated cells grown in vitro called primary neuronal cultures. One advantage of this simplified system is the ability to efficiently manipulate the expression of genes of interest in neuronal signaling by transfection. The results of these genetic manipulations can then be observed by visualization of protein localization, analysis of cell morphology, or electrophysiological recordings.

Lastly, dramatic advances in imaging technology are allowing scientists to study neuronal plasticity in exciting new ways. For example, researchers can use two-photon microscopy to visualize deep layers of living tissues in great detail. After creating a “window” in the skull, this technique can be used to image brain cell morphology before and after animals undergo an experience, allowing researchers to see what learning looks like at the neuronal level.

Imaging tools are also used to investigate molecular components of the nervous system in preserved tissues. Fluorescence microscopy is often used in combination with immunohistochemistry, in which samples are stained with fluorescent antibodies that mark the cellular localization of specific proteins.

Having reviewed both important questions and the tools used to answer them, let’s look at some applications of cell and molecular neuroscience research.

First, by applying microarray techniques to a small population of neurons, researchers can examine the differences in expression of various genes in specific neuronal subtypes. Here, single neurons were isolated from the retina and cellular RNA was extracted, allowing the researchers to profile the expression of mRNAs from cells with different functional and morphological characteristics.

Molecular techniques can also be applied to better understand the nervous system’s response to injury. When dorsal root ganglia, or DRGs, are removed from adult mice for primary neuronal culture, axons are necessarily severed. By transfecting the dissociated DRG neurons with gene silencing constructs, it is possible to test the effect of individual proteins on the regrowth of new axons.

Specialized imaging techniques can be used to study how proteins like neurotransmitter receptors are transported to and from the synaptic membrane. In this experiment, cultured neurons were transfected with a gene encoding a fluorescently tagged membrane protein. Using a confocal microscope, small regions of the membrane were then photobleached, meaning that the fluorophores in that area were destroyed. With the bleaching scheme used here, the progressive recovery of fluorescence, or FRAP, reflects the transport of new fluorescent proteins into the plasma membrane. The rate at which this movement occurs can be quantified and compared over many experimental conditions.

You’ve just watched JoVE’s introduction to cellular and molecular neuroscience. In this video we discussed the historical discoveries that made cellular and molecular neuroscience the field it is today, some key questions in the field, and the techniques used to answer them.

As always, thanks for watching JoVE Science Education!

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